一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，特别涉及一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]随着我国经济的发展，人们生活质量水平大幅度的提高，糖尿病患者的数量也急剧增长。根据最新调查报告显示，中国糖尿病患者持续增加，至2013年，成人糖尿病患病率接近12%，糖尿病患者人数突破I亿，位居全球第一位。糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷后/或其生物效应降低(胰岛素抵抗)引起的以高血糖为特征的慢性全身代谢性病症。慢性高血糖将导致人体多组织，尤其是眼、肾、神经及心血管的长期损害，功能不全和衰竭，危害性极大。
[0003]胰岛素治疗一直被公认为是治疗糖尿病以及控制糖尿病患者血糖的重要手段。随着分子生物学技术和基因工程的发展，20世纪90年代末，人们在对胰岛素结构和成分的深入研宄中发现，对肽链进行修饰有可能改变胰岛素的理化和生物学特征，从而能研制出较传统人胰岛素更适合人体生理需要的胰岛素类似物(Insulin analog)。人胰岛素类似物的出现，弥补了传统人胰岛素的局限性，满足不同糖尿病患者的治疗需求。
[0004]地特胰岛素作为新一代的长效可溶性胰岛素类似物，是第一个采用化学修饰的方法获得的胰岛素类似物，即将人胰岛素天然排列在B30位的苏氨酸去掉后，通过酰化反应，在B29位的赖氨酸ε氨基上结合一个14碳脂肪酸链(肉豆蔻酸)。一方面，这14碳脂肪酸侧链可使地特胰岛素在皮下注射后形成双六聚体而延缓吸收，同时还与皮下组织的的白蛋白可逆性结合，进一步减缓入血速度；另一方面，地特胰岛素在进入外周血循环后，98%与白蛋白可逆性结合，靶器官分布也延缓。这些特点使地特胰岛素的作用时间长达24小时。在多个国家的研宄学者发布的地特胰岛素最新研宄结果中显示，地特胰岛素与其他胰岛素相比，具有长效降糖作用的同时，糖尿病患者用后出现低血糖较少，且还具有独特的减少体重增加的作用。
[0005]以固态晶体形式存在的胰岛素，相比较于不定形固体粉末以及溶液状态的形式，对于产品稳定性、贮存性能等均较为有优势。因此，亟需一种有效能将地特胰岛素结晶的方法。中国专利CN2 01110118 O 2 6.2公开了一种长效胰岛素类似物一甘精胰岛素(GlyA21-ArgB31-ArgB32-人胰岛素)的结晶方法:在室温条件下，制备含2.8?3.2g/L甘精胰岛素、体积分数为10?30%的乙醇、体积分数为0.01?0.2%的苯酚、0.4?0.6M乙酸、70?100mg/L氯化锌、0.3?0.4M氯化钠的结晶液，调节pH值至8.0?8.5，将结晶液温度降至2?8°C，调节pH值至7.1?7.8，结晶3h。本发明发明人参照此专利中的实施例1和实施例2进行了地特胰岛素结晶的制备，未能得到地特胰岛素结晶。应用甘精胰岛素结晶的制备方法进行地特胰岛素结晶，地特胰岛素只能形成沉淀。根本原因在于甘精胰岛素与地特胰岛素是两种分子结构完全不同的胰岛素，物理化学性质差异大。甘精胰岛素是将人胰岛素的A21突变并添加B31和B32位氨基酸形成的，即GlyA21-ArgB31_ArgB32-人胰岛素，其等电点变为6.7左右，在中性pH条件下微溶。而地特胰岛素是用脂肪酸链酰化修饰去(B30)人膜岛素得来的膜岛素类似物，即赖氨酸B29 (Νε-十四烧酰)去(Β30)人膜岛素，其疏水性增强，等电点约为5.0至6.0，但在中性pH条件下澄清易溶。其次由于甘精胰岛素难溶于中性PH条件，因此结晶中使用了大量的有机酸作为溶解缓冲体系，但这反而不利于地特胰岛素结构的稳定。可见，地特胰岛素的结晶对于PH，缓冲盐，离子强度，溶液组成等与其他胰岛素相比有着完全不同的要求。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种地特胰岛素结晶的制备方法。该方法能更好的与上游工艺衔接(可从干燥/冻干固体粉末样品或者纯化收集的液体样品中直接制备地特胰岛素结晶)；该方法获得的地特胰岛素结晶具有均一稳定的固体形态，沉降体积小，易于与上清分离(可采用离心或抽滤的方式)，冻干时间短，适合工业化生产。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种地特胰岛素结晶的制备方法，包括如下步骤:在0.1?0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5?10%的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在PH8.0?8.5的条件下使地特胰岛素结晶。
[0008]所述的地特胰岛素结晶的制备方法，优选包含如下步骤:
[0009](I)配制含0.1?0.2M柠檬酸三钠、I?6g/L地特胰岛素、体积百分比5?10%的有机溶剂、0.05?0.5M盐、质量体积百分比0.005%?0.2%的酚类物质的结晶液；调节pH值至8.5?9.0，加入锌离子；
[0010](2)调节含锌离子的结晶液的pH值至8.0?8.5，结晶3?6小时；
[0011](3)然后在2?8°C条件下静置结晶12?24小时，得到地特胰岛素结晶。
[0012]步骤(I)和(2)宜在室温条件下进行；室温条件指的是10?30°C，优选为15?28。。。
[0013]所述的柠檬酸缓三钠体系是地特胰岛素形成结晶至关重要的条件。发明人经实验研宄发现，在没有柠檬酸三钠的结晶体系下，地特胰岛素只能形成无固定形态的沉淀，无法形成结晶；所述的柠檬酸三钠在所述的结晶液中的浓度优选为0.1?0.15M。
[0014]所述的有机溶剂的浓度是地特胰岛素形成结晶的重要参数之一。与其他胰岛素相比，由于地特胰岛素在结构上存在较大的差异，疏水性较强，导致其在水相中的溶解度较差，在结晶液中需要加入一定体积分数的有机溶剂以增强其溶解性质。发明人经试验研宄发现，在没有加入有机溶剂的条件下，地特胰岛素只能形成无固定形态的沉淀，无法形成晶体；而有机溶剂浓度的过度增加又会使地特胰岛素溶解度增加，以致无法达到利于结晶析出的过饱和状态；只有在含体积分数5?10%有机溶剂的结晶液中，地特胰岛素才能形成结晶。所述的有机溶剂为乙腈、乙醇和异丙醇中的一种或至少两种，其中优选的有机溶剂为乙腈，结晶液中有机溶剂的浓度优选为体积百分比7?10%。
[0015]所述的地特胰岛素可以为干燥/冻干固体粉末或纯化收集的液体样品中的一种；其制备方法可参照专利W098/02460或CN94193852中披露的方法进行；所述的地特胰岛素在所述的结晶液中的浓度为I?6g/L，优选2?4g/L。
[0016]所述的锌离子可以是本领域技术人员所熟悉的锌盐，其中优选的锌盐是乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌、氧化锌和硫酸锌中的一种或至少两种，更优选为乙酸锌。所述的锌离子的用量按锌离子与地特胰岛素按摩尔比(1.5?7):1计，优选为(2.5?4):1。
[0017]所述的酚类物质选自苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚和对羟基苯甲酸甲脂中的一种或至少两种，更为优选苯酚。所述的酚类物质在所述的结晶液中浓度为质量体积百分(g/mL)比0.005?0.2%，优选0.03?0.07%。
[0018]所述的盐选自氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙酸铵中的一种或至少两种。所述的盐在所述的结晶液中的浓度为0.05?0.5M，优选为0.25?0.5M ;其中优选的盐为乙酸铵和氯化钠组合，优选盐的浓度为乙酸铵0.05M?0.1M、氯化钠0.2M。
[0019]本发明结晶体系中，pH值的调节也是关键之一。在加入锌盐时，会导致结晶液体系的PH值降低，若pH值降低至7.8或以下，会导致地特胰岛素在结晶液中形成无固定形态的沉淀。发明人研宄发现，一旦地特胰岛素在结晶液中形成沉淀，就难以再溶解澄清；因此，在加入锌盐之前，可将结晶液pH值调节至结晶pH值以上(8.5?9.0，优选为8.5?8.7)，加入锌盐后再调节至结晶需要的PH值(8.0?8.5)。本发明所述的结晶液的pH值可通过本领域技术人员所知的酸