溶液调节pH值至8.58，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌203 μ 1，2M盐酸调节pH至8.10 ;放置摇床100转/分钟，室温条件28°C下结晶5h，然后转移至8°C条件下静置结晶24h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图4所示，晶体形状呈三角短棒状。
[0047]实施例5
[0048]制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为:地特胰岛素4g/L、乙腈浓度10 %、柠檬酸三钠0.1M、乙酸铵0.4M、苯酚0.005% (w/v)、锌离子与地特胰岛素的摩尔比为3:1。
[0049]制备过程如下:称取地特胰岛素0.2g,加入25ml浓度为20% (v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节pH值至8.55，溶解完全，待用；配制盐溶液:二水合柠檬酸三钠1.47g、乙酸铵1.54g、6%苯酚水溶液42 μ 1，加水溶解并定容至25ml，2Μ氢氧化钠溶液调节pH值至8.55，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌203 μ 1，2M盐酸调节pH至8.10 ;放置摇床100转/分钟，室温条件25°C下结晶4h，然后转移至6°C条件下静置结晶20ho取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图5所示。
[0050]实施例6
[0051]制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为:地特胰岛素6g/L、乙腈浓度7.5% (v/v)、柠檬酸三钠0.15M、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.05M、氯化钠0.2M、苯酚0.03% (w/v)，锌离子与地特胰岛素的摩尔比为6:1。
[0052]制备过程如下:称取地特胰岛素0.3g，加入25ml浓度为15%的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节PH值至8.60，溶解完全，待用；配制盐溶液:二水合柠檬酸三钠2.2g、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.39g、氯化钠0.58g，6%苯酚水溶液250 μ I，加水溶解并定容至25ml，2Μ氢氧化钠调节pH值至8.73，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌608 μ 1，2Μ盐酸调节pH至8.01 ;放置摇床100转/分钟，室温条件25°C下结晶3h，然后转移至4°C条件下静置结晶18h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图6所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒较细。
[0053]实施例7
[0054]制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为:地特胰岛素4g/L、乙腈浓度7.5 % (v/v)、柠檬酸三钠0.1M、乙酸铵0.05M、氯化钠0.2M、苯酚0.07% (w/v)，锌离子与地特胰岛素的摩尔比为4:1。
[0055]制备过程如下:称取地特胰岛素0.1g,加入25ml浓度为15% (v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节pH值至8.63，溶解完全，待用；配制盐溶液:二水合柠檬酸三钠1.47g，乙酸铵0.19g，氯化钠0.58g，6%苯酚水溶液583 μ I，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠调节PH值至8.59，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌270 μ 1，2M盐酸调节PH至8.11 ;放置摇床100转/分钟，室温条件25°C下结晶3h，然后转移至2°C条件下静置结晶18h。取取结晶悬浮液在显微镜下放大160下镜检，其结果如图7所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒粗。
[0056]实施例8
[0057]制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为:地特胰岛素3.2g/L，乙腈浓度7% (v/v)，柠檬酸三钠0.1M，乙酸铵0.05M，氯化钠0.2M，苯酚0.05% (w/v)，锌离子与地特胰岛素的摩尔比为3:1。
[0058]取含量为16.19g/L地特胰岛素纯化收集液25L，地特胰岛素总质量为404.75g，纯化收集液中乙腈浓度约为35%，往纯化收集液中加入75L水，2M氢氧化钠调节pH值至8.68，待用；配制盐溶液:二水合柠檬酸三纳3.68kg，乙酸铵0.48kg，氯化钠1.46kg，二水合乙酸锌45g，苯酸62.5g，加水溶解并定容至25L，用2M氢氧化钠调节pH值至8.59，加至已稀释好的纯化收集液中，搅拌均匀，用2M盐酸调节pH值至8.09 ;常温(26°C )下缓慢搅拌结晶6h，将温度降至4°C，静置结晶12h。取结晶上清进行HPLC检测，结晶上清中地特胰岛素的含量为0.01g/L，符合要求；取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图8所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒较粗。
[0059]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包括如下步骤:在0.1?0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5?10%的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在PH8.0?8.5的条件下使地特胰岛素结晶。
2.根据权利要求1所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包含如下步骤: (1)配制含0.1?0.2M柠檬酸三钠、I?6g/L地特胰岛素、体积百分比5?10%的有机溶剂、0.05?0.5M盐、质量体积百分比0.005%?0.2%的酚类物质的结晶液；调节pH值至8.5?9.0，加入锌离子，锌离子的用量按锌离子与地特胰岛素按摩尔比(1.5?7):1计; (2)调节含锌离子的结晶液的pH值至8.0?8.5，结晶3?6小时； (3)然后在2?8°C条件下静置结晶12?24小时，得到地特胰岛素结晶。
3.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的柠檬酸三钠在所述的结晶液中的浓度为0.1?0.15M。
4.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的有机溶剂为乙腈、乙醇和异丙醇中的一种或至少两种。
5.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的有机溶剂在所述的结晶液中的浓度为体积百分比7?10%。
6.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于: 所述的地特胰岛素为干燥/冻干固体粉末或纯化收集的液体样品中的一种； 所述的地特胰岛素在所述的结晶液中的浓度为2?4g/L。
7.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的锌离子来源于自乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌、氧化锌和硫酸锌中的一种或至少两种。
8.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的酚类物质选自苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚和对羟基苯甲酸甲脂中的一种或至少两种。
9.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的盐选自氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙酸铵中的一种或至少两种。
10.权利要求1?9任一项所述地特胰岛素结晶的制备方法在工业化制备地特胰岛素中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用。该制备方法包括如下步骤：在0.1～0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5～10％的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在pH8.0～8.5的条件下使地特胰岛素结晶。通过该制备方法得到的地特胰岛素结晶具有均一稳定的固定形态，沉降体积小，易于与上清分离，冻干时间短，生产效率高，适合应用于工业化生产。
【IPC分类】C07K14-62
【公开号】CN104761632
【申请号】CN201510176512
【发明人】黄亮, 肖拥军, 曹永恒, 曹春来, 陈航, 周翠
【申请人】珠海联邦制药股份有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月14日