GmbHLH转录因子在促进大豆异黄酮合成中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆bHLH转录因子及其编码基因 在转基因大豆组织中提高大豆异黄酮含量水平的应用。
【背景技术】
[0002] 异黄酮作为豆科植物中特有的一种次级代谢产物，在植物体内起到植保素的作 用，特别是在植物抗外来真菌入侵方面起到重要的保护作用。与此同时，异黄酮作为人类 雌激素的类似物在促进人类健康方面也起到了重要作用。近些年对于描述异黄酮在生物学 及医学方面的文章屡见不鲜，主要阐述了异黄酮在促进人体健康和预防疾病方面的作用。 这些内容大多集中在：异黄酮平衡女性雌激素水平，预防和治疗女性更年期并发症；调节 心血管系统，改善心肌缺血，降低血固醇类物质含量；防癌和抗癌的功效，特别是降低乳腺 癌的功能；另外，异黄酮还有预防老年痴呆和骨病等疗效。
[0003] 随着我国人民生活水平的普遍改善，人们在提高生活质量方面的投入更多，特别 是增加了对于家庭身体健康方面开支。另一方面，我国老年人口比例也在逐步增加，这使得 健康方面支出占总财政方面支出的比例进一步增大。随着人们对科学技术和知识更深入和 全面的了解，像是异黄酮制剂作为保健品已能够被人们接受。异黄酮能够预防和治疗一些 多发的顽固性疾病，并且具有很好的疗效，因此对其的消费需求也随之增加。大豆作为当前 世界主要的经济作物之一，也是大豆异黄酮（soybeanisoflavone)主要分离提取来源。所 以，提高大豆植株的异黄酮含量具有很高的经济及社会价值。
[0004] 植物的转录因子一般定位在植物的细胞核内，通过结合特定的DNA序列，调节下 游基因的表达，有时会起到调控同一代谢通路的作用，从而使这一代谢通路的下游产物能 够大量积累。植物苯丙氨酸代谢主要分为前期代谢过程和后期代谢过程，在早期代谢过程 中，即在查儿酮异构酶CHI的作用下生成4'，5'，7' -三羟基黄烷酮，该物质将成为多种酶 作用底物，一方面在黄烷酮-3羟化酶（F3H)及二氢还原酶（DFR)作用下生成花青素，另一 方面在异黄酮合成酶（IFS)及2-羟基异黄烷酮脱水酶（HID)作用下合成异黄酮。所以，抑 制花青素合成相关基因的表达，能够促使底物向异黄酮合成方向流动。Xie (2013)的研宄指 出，过量表达AtbHLH3转录因子能降低拟南芥花青素的合成代谢。
[0005] 目前，转基因方法是提高作物品质及产量的重要手段。由于传统育种对于作物产 量的提高程度有限，并且新品种的的培育时间漫长，阻碍了农业产业的发展与进步，同时造 成大量投入的浪费。转基因方法很好的解决了这一问题，缩短了育种期限，并且大幅提高作 物的目的性状。但是，转基因的安全问题也受到了广泛关注。为了解决转基因安全问题，一 方面是加紧完善审查制度，另一方面是加紧研宄导入的外源基因对于转基因作物内部代谢 产物的影响，及自身蛋白的毒性研宄。目前，内源基因的过表达能够在一定程度上解决转基 因作物所遇到的安全问题。内源基因是来自于作物本身，通过内源基因过量表达提高相应 的植物性状，从而大大降低外源基因导入造成的产生不明代谢产物的隐患，也便于基因自 身研宄工作的开展。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种GmbHLH转录因子在促进大豆异黄酮合成中的应用，以解决基因 代谢产物的安全隐患问题。
[0007] GmbHLH转录因子在促进大豆异黄酮合成中的应用。
[0008] 所述的GmbHLH转录因子，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所述。
[0009] 编码所述的大豆bHLH转录因子的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所述。
[0010] 一种重组载体，利用植物表达载体PCAMBIA3301H，将克隆得到的GmbHLH3a转录因 子开放阅读框的部分构建成为重组载体pCAMBIA3301H-GmbHLH3a，所述pCAMBIA3301H载体 中含有35s启动子。
[0011] 本发明所提供的提高大豆异黄酮含量的bHLH转录因子来源于吉林32大豆品种， bHLH转录因子基因命名为GmbHLH3a。
[0012] SEQ ID No. 1由1515个碱基组成；SEQ ID No. 2由504个氨基酸残基组成，自氨基 端的第51至227位氨基酸残基含一个bHLH-MYC_N结构域和358至407位氨基酸残基含一 个HLH结构域，通过比对和预测得知这两个结构域属于MYC类转录因子家族成员；含有一个 核定位信号：自氨基端的第342至343位氨基酸残基。
[0013] 利用植物表达载体pCAMBIA3301H，将克隆得到的GmbHLH3a转录因子开放阅读框 的部分构建成为重组载体pCAMBIA3301H-GmbHLH3a4CAMBIA3301H载体中含有35s启动子， 从而使GmbHLH3a在植物中能够高效表达；pCAMBIA3301H载体还包含草苷膦抗性Bar基因， 在多种转基因作物中已验证具有抗除草剂的功能，同时至今没有发现其具有危害人体的毒 性。pCAMBIA3301H-GmbHLH3a重组植物表达载体可以通过基因枪和根癌农杆菌介导的方式 导入至各种大豆品种中，也包括各种双子叶植物中。最终，可获得高异黄酮含量的大豆品 种。
[0014] 本发明的有益效果是：本发明克隆了一个与大豆苯丙氨酸代谢通路相关的大豆 GmbHLH3a转录因子基因，通过进化分析得到该转录因子的同源基因，得知其属于bHLH基因 家族，尤其是其与拟南芥AtbHLH3同源，因此很可能具有相近的功能；通过实验进一步证明 其基本结构与MYC转录因子相同；进一步将构建的pCAMBIA3301H-GmbHLH3a重组植物表达 载体转化大豆发根农杆菌，检测转基因发根异黄酮含量，证明其提高了大豆异黄酮各组分 含量。这些研宄结果在基础理论和实际功效上都为pCAMBIA3301H-GmbHLH3a重组载体导入 大豆提高大豆异黄酮含量提供了有效依据。
[0015] 本发明选用的GmbHLH3a转录因子，只在大豆细胞核中表达，通过结合DNA序列调 控下有基因的表达量从而提高了大豆异黄酮的含量。全过程由于GmbHLH3a为转录因子蛋 白，不产生代谢产物，从而最大限度的降低了转基因代谢产物的安全隐患。
【附图说明】
[0016] 图 1 是 GmbHLH3a 基因的 PCR 扩增结果图，M:2000bp maker. l-3:GmbHLH3 扩增结 果；
[0017] 图2是MYC类转录因子进化树图；
[0018] 图3是大豆MYC类转录因子的表达模式图；
[0019] 图4是GmbHLH3a重组蛋白的表达模式图，M :Protein Marker ;1 :pET28a空载体 未经IPTG诱导菌；2 :pET28a空载体IPTG诱导菌；3 :pET28a-MYC2a未诱导菌；4-8 :分别为 pET28a-GmbHLH3a IPTG 诱导 4h，6h，8h，10h 和 12h 菌体；
[0020] 图5是GmbHLH3a基因籽粒发育期表达模式图；
[0021] 图6是GmbHLH3a基因亚细胞定位试验图；
[0022] 图7是报告质粒、效应质粒载体结构示意图；
[0023] 图8是转基因发根阳性结果的筛选示意图，图中：
[0024] A :转化 K599pCAMBIA1300h - GmbHLH3 大豆根，
[0025] B :转化 K599 (CK) pCAMBIA1300h 大豆根，
[0026] C :获得阳性结果，
[0027] D:得到阴性结果；
[0028] 图9是GmbHLH3a基因在转基因发根中的qRT-PCR鉴定结果，其中
[0029] l-3:pCAMBIA1300h - GmbHLH3 ；
[0030] 4-6:pCAMBIA1300H ；
[0031] 图10是转基因发根异黄酮含量高效液相色谱HPLC的测定结果图，其中：
[0032] 1.总异黄酮2.染料木苷3.黄豆黄苷4.大豆苷。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1 :GmbHLH3a基因的克隆及序列分析
[0034] 大豆RNA的提取及cDNA的合成：用RNAiso Plus (购自TaKaRa公司）提取大豆吉 林 32 轩粒发育 30 天的总 RNA，用 M-MLV reverse transcriptase (RNase H〇 (购自 TaKaRa) 进行反转录，合成第一条cDNA。
[0035] 引物的设计与合成：将大豆品种吉林32的3个时期（20、30和50天）未成熟胚 表达谱测序所得序列（华大基因完成）输入phytozomelO. 1中进行Blast比对，获得一个 与植物中bHLH转录因子蛋白序列同源性较高的bHLH3-l ike的完整cDNA序列。根据已 获得的cDNA序列，其核苷酸序列如Sequence NO. 1所述，设计合成引物，GmbHLH3a-RT_F : 5 ' -CGCCAAATCACAATACCC-3 '、GmbHLH3a-RT-R : 5 ' -GCCACTTAACCTACAAGACAGA-3 '。以上述 cDNA为模板，按照以下反应体系及条件进行PCR扩增：总共25 :总体系，内含10,内含照以 下反应体系及条件进行y〇,2.5mM dNTP mix 2ydNTPyd的引物GmbHLH3a-RT-F和引物 GmbHLH3a-RT-R各 lym，cDNA 2yD，Ex Taq(购自 1&1^1^)0.51^，补去离子水至25115。反 应条件：预变性 94°C 8min ;94°C 40s, 58°C 90s, 72°C lmin, 30 个循环；72°C延伸 8min。将上 述扩增片段回收后与克隆载体PMD18-T(购自TaKaRa)进行连接，鉴定后送华大基因测序， 验证序列正确后保留备用。
[0036] 经PCR扩增得到包含有GmbHLH3a基因全长0RF的序列，编码一个由502个氨基酸 残基组成的蛋白质，包含一个保守的HLH结合域，和MYC转录因子特有的bHLH-MYC_N结构 域，一个核定位信号。
[0037] 实施例2 :GmbHLH3a基因的进化树分析
[0038] 根据plantTFDB在线数据库公布的大豆bHLH转录因子及拟南芥bHLH转录因子数 据，使用ClustalW2软件对两组数据合成产生无根进化树，使用MEGA 6. 0进行进化树的亚 家族分类标记（分类方案参考2001年Ralf Stracke文章的分类内容）从中得出大豆及拟 南芥MYC类转录因子家族。将得到的MYC类转录因子在NCBI数据库中进行blast，检测出 相关研宄信息。将拟南芥或大豆转录因子相关名称更改为已公布的研宄命名，以便能够更 好的了解对应AtMYC转录因子的GmMYC基因同源性及功能分析。
[0039] 经过分析最终得