专利名称：用红三叶草异黄酮制备染料木黄酮和黄豆苷元的方法
技术领域：
本发明涉及化学合成技术，具体地说是用红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物为原料，经过一步化学修饰，即同时分别将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元，将红三叶草异黄酮鸡豆黄素转化成染料木黄酮。
背景技术：
大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物。大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有12种，可以分为3类，即黄豆苷(daidzin)类、染料木苷(genistin)类、黄豆黄素苷(glycitin)类，分别以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在。
很多研究表明，在大豆中存在的12种大豆异黄酮中，两种游离形式的异黄酮即大豆异黄酮苷元染料木黄酮(genistein)和黄豆苷元(daidzein)具有较高的生物活性，是大豆异黄酮的功能因子。
染料木黄酮和黄豆苷元化学结构式为
染料木黄酮(genistein)黄豆苷元(daidzein) 染料木黄酮和黄豆苷元能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生。但是这两种苷元形式的异黄酮在大豆中其含量非常少，不足大豆异黄酮总量的3％。
目前，采用的传统化学合成法制备染料木黄酮和黄豆苷元，是由小分子合成大分子，所用化工原料和试剂等对人和环境有害，且工艺路线长，三废处理难。目前采用的以大豆为原料制备染料木黄酮和黄豆苷元，提取纯化大豆异黄酮后也需要酸或酶的水解才能得到染料木黄酮和黄豆苷元。但大豆中大豆异黄酮含量低，国内原料含量一般小于0.2％，且占用粮食资源。
我国知识产权专利局已授权的多个制备大豆异黄酮苷元的专利，如蛋白质技术国际公司中国专利ZL97120435.7公开了使用酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法；金凤燮申请的中国专利(申请号CN03133637.X)公开了用微生物发酵的方法水解大豆异黄酮糖苷，以制备大豆异黄酮苷元；王哲申请的中国专利(专利号ZL2004 10058379.8，授权公告日2007年11月28日)公开了用β-葡萄糖苷酶和膜技术生产大豆异黄酮苷元的方法；他们专利所用的原料是大豆异黄酮。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合于工业化生产黄豆苷元和染料木黄酮的方法，通过采用红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物为原料，达到节约粮食资源，降低成本；并通过四种高效的化学修饰试剂(碘化氢，碘化钾的浓磷酸溶液，溴化氢，溴化钾的浓磷酸溶液。)修饰作用，把红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物高效地转化为黄豆苷元和染料木黄酮的目的。
本发明的目的是这样实现的 以红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物为原料，经过一步化学修饰，即同时分别将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元，将红三叶草异黄酮鸡豆黄素转化成染料木黄酮，其一步化学修饰包括以下四种方法 1、将红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与苯酚以质量比10∶1混合后，再按每克原料加7.5毫升碘化氢的比例加入碘化氢，在120～130℃条件下，反应2～3小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮； 2、红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与每毫升浓磷酸含2.5～3.5克碘化钾的浓磷酸溶液按每克原料加15毫升碘化钾的浓磷酸溶液的比例混合，在110～120℃条件下，反应2～4小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮； 3、将红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与苯酚以质量比10∶1混合后，再按每克原料加5毫升溴化氢的比例加入溴化氢，在115～125℃条件下，反应2～3小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮； 4、红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与每毫升浓磷酸含1.5～3.0克溴化钾的浓磷酸溶液按每克原料加5毫升溴化钾的浓磷酸溶液的比例混合，在110～120℃条件下，反应2～4小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮。
应用红三叶草中异黄酮的主要成分芒柄花黄素和鸡豆黄素一步法化学转化为黄豆苷元和染料木黄酮的反应方程式如下。
芒柄花黄素(Formononetin)黄豆苷元(Daidzein)
鸡豆黄素(Biochanin A)染料木黄酮(Genistein) 我们发明使用的原料是红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素的提取物，红三叶草中的异黄酮总含量约占干重的0.5～2.5％，该含量比其它豆科异黄酮的含量高10～30倍，该含量是其他植物无法与之相比的。也就是说，红三叶草中异黄酮的含量远远高于大豆中异黄酮含量。红三叶草中已经发现的异黄酮约有40余种，其中以芒柄花黄素和鸡豆黄素的含量最高，其中，芒柄花黄素含量为1322mg/100g；鸡豆黄素含量为833mg/100g，而大豆中大豆异黄酮含量一般小于0.2％，可见，应用红三叶草鸡豆黄素和芒柄花黄素提取物经化学修饰制备染料木黄酮和黄豆苷元与应用大豆中异黄酮生产黄豆苷元和染料木黄酮相比，在原料方面就有原料含量丰富的优点。
另外，红三叶草为牧草，容易生长，分布广泛，易于种植，亩产红三叶草可高达3000kg。红三叶草异黄酮可从叶、颈、花中提取，而大豆异黄酮只能从大豆种子中提取。每棵三叶草的叶子比每棵豆类的种子多，因此每单位面积的草原的三叶草能提供高产量的异黄酮。红三叶草生长季节长，生长快。可重复修剪叶子刺激来获取更多的异黄酮。由于重复修剪叶子的刺激，异黄酮的含量还会更高。这与应用大豆中异黄酮生产黄豆苷元和染料木黄酮相比，在原料方面有不占用粮食资源和优质的土地，亩产量高的优点。
本发明以红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物为原料，仅经过一步化学修饰，即同时分别将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元，将红三叶草异黄酮鸡豆黄素转化成染料木黄酮。此处提出了四种高效的化学修饰催化剂，分别是碘化氢，碘化钾的浓磷酸溶液，溴化氢，溴化钾的浓磷酸溶液。转化效率大于96％。因此，该技术具有生产步骤简单，转化效率高的优点。
总之，应用红三叶草鸡豆黄素和芒柄花黄素提取物经化学修饰制备染料木黄酮和黄豆苷元与用从大豆中提取大豆异黄酮制备染料木黄酮和黄豆苷元技术相比，该技术有如下优点 1、在原料方面有不占用粮食资源和优质的土地，含量丰富的优点，生产成本低； 2、该技术具有生产步骤简单，反应时间短，转化效率高。
(四)具体实施方案 下面举例对本发明作更详细地描述 实施例1 称取2g红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物与0.2g苯酚混合后，加入15毫升碘化氢，油浴加热，在125℃条件下，搅拌反应2.5小时，通过高效液相色谱法(HPLC)测定转化率，转化率为97％。
反应产物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，每次取液1mL上硅胶柱(硅胶G，100～200目，长径比为30∶1)分离。石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为洗脱剂，分别收集染料木黄酮和黄豆苷元的洗脱液，将其浓缩成黏稠液体后，冷冻干燥即得产品。黄豆苷元和染料木黄酮纯度均大于90％，收率均在70％以上。
实施例2 称取2g红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物，加入30毫升含90克碘化钾的浓磷酸溶液，油浴加热，在115℃条件下，搅拌反应3小时，通过HPLC测定转化率，转化率为97％。
反应产物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，每次取液1mL上硅胶柱(硅胶G，100～200目，长径比为30∶1)分离。石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为洗脱剂，分别收集染料木黄酮和黄豆苷元的洗脱液，将其浓缩成黏稠液体后，冷冻干燥即得产品。黄豆苷元和染料木黄酮纯度均大于90％，收率均在70％以上。
实施例3 称取2g红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物与0.2g苯酚混合后，，加入10毫升溴化氢，油浴加热，在120℃条件下，搅拌反应2.5小时，通过HPLC测定转化率，转化率为97％。
反应产物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，每次取液1mL上硅胶柱(硅胶G，100～200目，长径比为30∶1)分离。石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为洗脱剂，分别收集染料木黄酮和黄豆苷元的洗脱液，将其浓缩成黏稠液体后，冷冻干燥即得产品。黄豆苷元和染料木黄酮纯度均大于90％，收率均在70％以上。
实施例4 称取2g红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物，加入10毫升含25克溴化钾的浓磷酸溶液，油浴加热，在115℃条件下，搅拌反应3小时，通过HPLC测定转化率，转化率为97％。
反应产物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，每次取液1mL上硅胶柱(硅胶G，100～200目，长径比为30∶1)分离。石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为洗脱剂，分别收集染料木黄酮和黄豆苷元的洗脱液，将其浓缩成黏稠液体后，冷冻干燥即得产品。黄豆苷元和染料木黄酮纯度均大于90％，收率均在70％以上。
权利要求
1.一种用红三叶草异黄酮制备染料木黄酮和黄豆苷元的方法，其特征在于以红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物为原料，经过一步化学修饰，即同时分别将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元，将红三叶草异黄酮鸡豆黄素转化成染料木黄酮，其一步化学修饰包括以下四种方法
①将红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与苯酚以质量比10∶1混合后，再按每克原料加7.5毫升碘化氢的比例加入碘化氢，在120～130℃条件下，反应2～3小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮；
②红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与每毫升浓磷酸含2.5～3.5克碘化钾的浓磷酸溶液按每克原料加15毫升碘化钾的浓磷酸溶液的比例混合，在110～120℃条件下，反应2～4小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮；
③将红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与苯酚以质量比10∶1混合后，再按每克原料加5毫升溴化氢的比例加入溴化氢，在115～125℃条件下，反应2～3小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮；
④红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物原料与每毫升浓磷酸含1.5～3.0克溴化钾的浓磷酸溶液按每克原料加5毫升溴化钾的浓磷酸溶液的比例混合，在110～120℃条件下，反应2～4小时，同时完成将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元和鸡豆黄素转化成染料木黄酮。
全文摘要
用红三叶草异黄酮制备染料木黄酮和黄豆苷元的方法属于化学合成技术；以红三叶草异黄酮芒柄花黄素和鸡豆黄素提取物为原料，经过一步化学修饰，即同时分别将红三叶草异黄酮芒柄花黄素转化成黄豆苷元，将红三叶草异黄酮鸡豆黄素转化成染料木黄酮，然后经提取、纯化、分离后得染料木黄酮和黄豆苷元产品；本发明制备方法操作简便易行，转化率大于96％，应用可再生的生物资源牧草红三叶草为原料，不占用粮食资源和优质的土地，红三叶草异黄酮含量高，可以降低制备染料木黄酮和黄豆苷元的生产成本。
文档编号C07D311/36GK101353340SQ20081013715
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者张永忠, 孙艳梅, 张晓松, 陈学颖 申请人:东北农业大学