一种纯化干扰素蛋白的方法

专利名称：一种纯化干扰素蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及药用干扰素蛋白的纯化，特别涉及反 相填料层析方法在干扰素的纯化中的应用。
背景技术：
干扰素是一些结构相似，功能相近的低分子量糖蛋白质，具有共同的多肽
成分，其分子量在15-40KD左右，其大小取决于它的糖基化程度。1957年Zssacs 和Lindenmann首次发现受到病毒感染的细胞会产生一种物质，保护其他细胞抵 御多种病毒素的感染，并命名为干扰素(Interferon, IFN)。干扰素具有很高的 生物活性，lmg即具有IO亿个活性单位。其抗病毒作用无特异性，由一种诱导 剂诱导细胞产生的干扰素可抑制多种病毒的复制，是广谱的抗病毒物质。
根据干扰素的结构和来源可分为干扰素a， (3， Y三种。干扰素oc主要由单 核巨噬细胞，B细胞，成纤维细胞产生，可分为23个亚型，不同亚型的干扰素 a具有较高的同源性。干扰素卩主要由成纤维细胞产生，由166个氨基酸残基 组成，与干扰素a之间的同源性为25%， 二者又称为I型干扰素。干扰素Y又称 为II型干扰素，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，由143个氨基酸残基组 成，它和I型干扰素之间没有明显的同源。
干扰素cDNA的获得是将产生干扰素的白细胞的mRNA分级分离，然后将不 同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母细胞，并测定干扰素的抗病毒活性。结果发现 12smRNA的活性最高，因此用这部分mRNA合成cDNA。干扰素mRNA仅占白细 胞总mRNA的0.101。/。 0.1P/。，因此转化的cDNA文库中大肠杆菌克隆多达上万 个,每一个克隆都需检测是否含有专一的干扰素基因。大多数干扰素都是糖基化 的，但糖链并非生物活性所必需。起初干扰素在大肠杆菌中的表达水平为每个细胞生产50个干扰素分子，将干扰素cDNA序列精确定位于E coli的乳糖启动子 邻近，提高表达效率1000倍以上。目前l升培养液已得到lmg干扰素，并已纯化 结晶，证明即使大剂量应用也无毒性。
干扰素的分离纯化技术有许多中，其中色谱法己被普遍认为是当前分离纯 化生化样品最有效的手段。目前，大多采用离子交换层析和疏水层析色谱方法， 如将复性后的干扰素经DEAE离子交换色谱，进行分离。选用以上色谱方法分 离纯化工艺简单，成本低，但干扰素的纯度通常只能达到95%左右。有文献报 道用亲和色谱或反相色谱，疏水色谱，离子交换色谱，凝胶色谱等方法纯化蛋 白。亲和色谱配体生产困难，费用高，且配体脱落影响产物纯度。而反相色谱 (RPLC)与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便 等优势。由于RPLC可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)等， 纯化产物不必进行洗脱，因此大大简化了操作步骤。在RPLC中，蛋白质分子 通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠，内部某些疏水残基暴露并与固定相相 互作用，从而表现出与其他色谱及电泳方法不同的选择性，提供其他方法不能提 供的信息，这成为RPLC在蛋白质分离中有利因素。
本发明采用反相色谱填料对干扰素进行纯化，不仅使干扰素蛋白回收率达 到满意的结果，还提高干扰素的纯度、比活，大大简化了操作歩骤、縮短了生 产周期，可以预料，由于设备的简化将会使投资成本大大下降，经济效益明显 上升。

发明内容
本发明可解决现有干扰素纯化技术的不足，是对基因工程蛋白分离纯化手 段的创新，大幅度提高干扰素分离纯化后的纯度、比活、稳定性。
本发明关键技术在于采用了反相填料的精细分离纯化歩骤。包括步骤a、 将工程菌进行发酵培养；
b、 对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到粗品包涵体；
c、 对粗品包涵体进行复性，获得复性产物；
d、 对复性产物进行离子柱层析处理，得到离子柱层析产物；
e、 离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到蛋白。 同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，干扰素电泳纯度由离
子柱层析产物的90%提高到98%， HPLC纯度由90%提高到98%,其比活由 0.9X 107IU/mg提高到3.5X 108IU/mg。 4"C条件下稳定性由原有的3个月提高到 12个月。可见，采用本发明的干扰素的纯化工艺，可以大幅度的提高干扰素蛋 白的纯度、比活、稳定性。将降低干扰素在临床中的副作用。
具体实施例方式
以下通过实施例、实验例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对 本发明的限制。
实施例l
使用半制备型MKF-RP柱。
样品阳离子层析产物200ml，蛋白浓度2mg/ml。
配制洗脱液A为含50mmolNaCl和20mmo1 Tris-HCl缓冲液(pH 8)，洗脱液 B为含50mmolNaCl溶液20mmol Tris-HCl 60。/。乙腈(pH 8)。
先用洗脱液A洗脱，再用梯度洗脱15%-90%洗脱液8洗脱，10-55分钟收
集样品峰。
被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓縮后保存在4'C条件下。
实施例2使用XK 50/30柱，用SBC MCL GEL型反相制备液相色谱填料装柱。样品阴离子层析产物500ml，蛋白浓度2.2mg/ml。
洗脱液A为20%磷酸盐缓冲液，洗脱液B为含0.02%tween80的30%甲醇溶液，流速为15ml/min。
梯度洗脱，在10-80分钟20Q^-75。/。洗脱液B洗脱，收集样品峰。收集样品时，收集中间部分。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓缩后保存在4X:条件下。
实施例3
使用Butyl-Sepharose 4Fast Flow, XK50H16层析柱。
样品阴离子层析产物500ml，蛋白浓度1.5mg/ml。添加硫酸铵到0.8M。
平衡液20mmol/ml Tris-HCl， PH8.0, 0.8M硫酸铵
预洗脱液20mmol/ml Tris-HCl， PH8.0, 0.5M硫酸铵
洗脱液20mmol/ml Tris-HCl， PH8.0, 0.2M硫酸铵
收集洗脱液洗脱部分，透析除盐即得。
在^C条件下对实施例1、 2、 3的样品进行稳定考察，考察结果如下
0月
批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例13. 5X赔U/mg98%98%符合规定1. 2mg/ml
实施例23. 4X108IU/mg98%97%符合规定1. lmg/ml
实施例31.8X108IU/mg95%95%符合规定1.Omg/ml
3月批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例13. 5X108IU/mg98%98%符合规定1. lmg/ml
实施例23.4X108IU/mg98%97%符合规定1. lmg/ml
实施例31.6X108IU/mg93%92%符合规定1. Omg/ml
66月
批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例13.4X108IU/mg97%98%符合规定1. lmg/ml
实施例23. 3 X 108IU/mg97%97%符合规定1. Omg/ml
实施例31.2X108IU/rag88%89%符合规定0. 9mg/ml
12月批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例13. 3X108IU/mg98%98%符合规定1. Omg/ml
实施例23. 2X108IU/mg98%97%符合规定1. Omg/ml
实施例30. 9X108IU/mg85%86%符合规定0. 9mg/ml
以上数据说明，通过反向填料方法获得的实施例1、 2样品较实施例3，电泳纯度与HPLC纯度在12个月内均大于97%,比活达到3.0X 108IU/mg以上，
其他各项指标也符合药典要求，实施例l、 2样品可在4。C条件下放置12个月，实施例3样品在考察6个月时出现比活降低，蛋白纯度下降的现象。说明通过反向填料方法获得的千扰素蛋白更加稳定。
权利要求
1、一种纯化干扰素的方法。其特征在于采用了反相填料层析分离。
2、 根据权利要求1所述的反相填料层析分离前的样品要求，其特征在于经过初 步的分离纯化。
3、 根据权利要求2所述的初步分离纯化，其特征在于经过阴离子或阳离子柱层 析处理。
4、 根据权利要求1所述的反相填料柱，其特征在于采用半制备型柱子和制备型 柱子。
5、 根据权利要求1所述的反相填料层析，其特征在采用反相色谱预装柱或反相 填料预装柱。
全文摘要
本发明涉及一种纯化干扰素的方法。本发明在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。同现有技术相比较，本发明首次采用反相填料精细分离的方法纯化干扰素，将干扰素的电泳纯度由90％提高到98％，HPLC纯度由90％提高到98％，其比活由0.9×10⁷U/mg提高到3.5×10⁸U/mg。采用本发明的重组干扰素的纯化工艺，可以大幅度的提高人干扰素的纯度、比活、稳定性，将有效降低干扰素在临床中的副作用。
文档编号C07K1/20GK101659690SQ200810137008
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月27日 优先权日2008年8月27日
发明者淼 于, 冷国庆, 睿 庞, 李会成, 李郑武, 梁秋波, 赵华南, 静 陈, 陈玉军, 晶 高 申请人:哈药集团生物工程有限公司