专利名称：从大豆中提取分离大豆异黄酮单体化合物的方法
技术领域：
本发明属于化工领域，具体是涉及一种从大豆中提取分离多种高纯度大豆异黄酮单体化合物的方法，主要是分离纯化黄豆黄苷(Glycitin)、大豆苷(Daidzin)、染料木苷 (Genistin)、黄豆黄素(Glycitein)、大豆苷元(Daidzein)、染料木素(Genistein)等化合物。
背景技术：
大豆异黄酮是大豆在生长过程中形成的次级代谢产物，是多酚类的混合物。大豆的多种营养、保健作用与大豆异黄酮有关。现代药理学研究表明，大豆异黄酮具有雌激素样作用，可预防妇女更年期综合征；具有预防、改善骨质疏松作用，减少骨质流失，同时增加机体对钙的吸收，增加骨密度；具有预防和治疗癌症作用，对乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和皮肤癌及白血病有明显的治疗作用，也可预防卵巢癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌的发生； 具有预防心血管疾病作用，降低胆固醇、调节血脂，预防心血管疾病的发生；具有预防早老性痴呆症作用。目前，从大豆中分离纯化高纯度化合物的方法已有报道。中国专利(大豆异黄酮主要单体组分的分离方法，申请号03135952. 3)以含量不低于40%的大豆异黄酮的混合物为原料，以硅胶为吸附剂，以氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，分离得到染料木素、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分，各单体组分的含量均达到90%以上。中国专利(从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的方法，申请号201010114937. 3)以离子液体或由离子液体与其他极性溶剂组成的二元混合溶剂为萃取剂，采用分馏萃取法从含有大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的大豆异黄酮苷元混合物中分离得到染料木素。叶茂颖等(中压制备系统分离制备大豆异黄酮糖苷，粮食科技与经济，2009年04期)以大豆异黄酮初提物为原料，使用中压制备系统和0DSC18色谱柱，分离制备得到大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷3 种大豆异黄酮糖苷，纯度分别为99. 69%,98. 6 和96. 26%。康少华等(硅胶柱层析法分离大豆异黄酮苷元的研究，中国酿造，2009年01期)利用硅胶柱层析分离得到染料木素、大豆苷元、黄豆黄素3种大豆异黄酮，纯度均超过90%。刘烨等(大孔吸附树脂分离纯化4种主要大豆异黄酮，中南药学，2007年04期)利用大孔吸附树脂后用20%、25%、35%、45%、70%的乙醇溶液梯度洗脱，得到大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4种大豆异黄酮成分，纯度分别为49. 31%,60. 38%、19. 33%和8. 14%。姚开等(大豆异黄酮主要单体组分的分离方法，四川大学学报(工程科学版)，2004年03期)采用300 400目硅胶、以氯仿-甲醇洗脱体系洗脱，得到染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元4种主要单体组分。江和源等(高速逆流色谱法分离制备大豆异黄酮中的大豆苷和染料木苷，食品科学，2004年01期)采用高速逆流色谱法分离纯化大豆异黄酮中的大豆苷和染料木苷，纯度分别达到98.洲和99. 2%。徐德平等(大豆异黄酮的分离鉴定与抗氧化作用的研究，南京农业大学学报，2001年03期)利用硅胶柱层析和氯仿、乙醇梯度洗脱，得到大豆甙元和染料木素。用Saphadex LH-20柱， 甲醇、水梯度洗脱，结合TOYOpearl冊_40层析柱反复多次层析，得到大豆苷和染料木苷。
上述各种方法或采取多步进行分离，操作比较麻烦；或仅能得到一种或少数几种大豆异黄酮成分；或得到的成分纯度不高；或分离过程中要使用氯仿有毒溶剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、分离量大，综合成本低，生产周期短的快速制备多种高纯度大豆异黄酮化合物的方法，一步分离纯化能得到高纯度的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元、染料木素等多种大豆异黄酮单体化合物。本发明的方案如下
从大豆中提取分离大豆异黄酮单体化合物的方法，步骤为
(1)大豆异黄酮提取物的制备脱脂大豆豆粕，用乙醇或甲醇浸泡，用5-20倍体积的乙醇或甲醇渗漉提取，渗漉液经回收至无醇后喷雾干燥得到提取物粗粉，将提取物粗粉用丙酮回流提取、浓缩结晶，得到大豆异黄酮提取物；
(2)柱层析纯化将大豆异黄酮提取物用甲醇溶解，上Superose12柱进行层析分离纯化，用甲醇-水或乙醇-水为洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为每小时1-10倍柱体积，流出液由紫外检测器在254 nm检测，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，得到高纯度的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元、染料木素等多种大豆异黄酮单体化合物。前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)渗漉提取时使用带有夹套加热保温的双层渗漉柱，介质温度为30-80°C，渗漉液流速为1-5倍柱体积/小时。更加优选的是，介质温度为40-60°C (优选50°C )，渗漉液流速为2-4倍柱体积/小时(优选3倍柱体积/小时)。前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)用乙醇或甲醇浸泡脱脂大豆豆粕时，乙醇或甲醇的质量浓度为40%-85% (优选50%-80%，更优选60%)，浸泡时间为6_12小时(优选 7-10小时，更优选8小时)。前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)渗漉提取时所用乙醇或甲醇的质量浓度为 40%-85% (优选 50%-80%，更优选 60%) ο前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)回流提取提取物粗粉时所用丙酮质量浓度为 80%-100% (优选 85%-95%，更优选 90%)。前面所述的方法，优选的方案是，步骤(2)洗脱液为20%_80%的甲醇-水洗脱液。前面所述的方法，优选的方案是，洗脱方式为等度、分步或梯度。前面所述的方法，优选的方案是，洗脱液为60%甲醇-水等度洗脱/50%甲醇-水等度洗脱/40%甲醇-水和60%甲醇-水梯度洗脱/30%甲醇-水和70%甲醇-水梯度洗脱。前面所述的方法，优选的方案是，用洗脱液进行洗脱时，洗脱液流速为每小时3-8 倍柱体积(优选每小时5倍柱体积)。本发明从大豆中提取分离大豆异黄酮单体化合物的方法，所得提取物大豆异黄酮类化合物含量高，杂质很低，这一优点从大豆异黄酮提取物HPLC图(图1)可清楚看出。除此之外，还具有如下优势
(1)所得到的大豆异黄酮提取物大豆异黄酮类化合物含量高，杂质低，有利于后续的进
一步纯化。(2)经过一步分离纯化就可以同时得到黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元、染料木素等多种高纯度大豆异黄酮单体化合物。不需要象已有技术一样对样品进行多次分离，只需要一个分离步骤即可得到多种高纯度化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。(3)纯化过程中不使用对环境危害大的氯仿等有机溶剂，绿色环保。(4)建立了一个简便、高效、能实现发明目的的途径，优化了层析方法的条件(洗脱液组成与洗脱方式)，使纯度和效率都大为提高。
图1是大豆异黄酮提取物的高效液相色谱图。图2是实施例1层析色谱图。图3是实施例2层析色谱图。图4是实施例3层析色谱图。图5是实施例4层析色谱图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用Superose 12购自通用电气(中国)医疗集团，所用试剂均购自天津试剂四厂，所用水为去离子水。实施例脱脂大豆豆粕1000克，用60%乙醇浸泡8小时，用10倍体积的60%乙醇
渗漉提取。渗漉提取时使用带有夹套加热保温的双层渗漉柱，介质温度为50°C，渗漉液流速为3倍柱体积/小时。渗漉液经回收至无醇后喷雾干燥得到提取物粗粉，将提取物粗粉用 90%丙酮回流提取、浓缩结晶，得到大豆异黄酮提取物。将大豆异黄酮提取物甲醇溶解，上Superose 12层析，用甲醇-水为洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为每小时5倍柱体积，流出液由紫外检测器在254 nm检测，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。发明人通过使用不同浓度的甲醇，采用不同洗脱方式，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下表一
表一柱层析条件
洗脱液条件实施例160%甲醇-水等度洗脱实施例250%甲醇-水等度洗脱实施例340%甲醇-水和60%甲醇-水梯度洗脱实施例430%甲醇-水和70%甲醇-水梯度洗脱
图2是当选用实施例1体系时层析色谱图，由图2可见，黄豆黄苷和大豆苷分离不开， 其它成分分离良好，可得到染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元、染料木素等四种成分。图3是当用实施例2体系时的层析色谱图，由图3可见，黄豆黄苷和大豆苷的分离有所改善，但并不理想，其它成分分离良好，另外，染料木素所需分离时间太长，在500分钟内没有洗脱下来。 图4是当选用实施例3体系时的层析色谱图。图5是实施例4体系时的层析色谱图，由图 4、5可见，各成分分离良好，分离时间也可以接受。根据色谱图收集各峰组分，回收溶剂后， 即可得到相应高纯度化合物。根据1H-NMR和13C-NMR的测试，对所得峰组分进行鉴定，得到
5了黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元、染料木素6个大豆异黄酮成分。
经HPLC面积归一化法分析测试，实施例1-4所得到的各个组分的纯度很高，均在 98%以上。
权利要求
1.从大豆中提取分离大豆异黄酮单体化合物的方法，其特征是，步骤为(1)大豆异黄酮提取物的制备脱脂大豆豆粕，用乙醇或甲醇浸泡，用5-20倍体积的乙醇或甲醇渗漉提取，渗漉液经回收至无醇后喷雾干燥得到提取物粗粉，将提取物粗粉用丙酮回流提取、浓缩结晶，得到大豆异黄酮提取物；(2)柱层析纯化将大豆异黄酮提取物用甲醇溶解，上Superose12柱进行层析分离纯化，用甲醇-水或乙醇-水为洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为每小时1-10倍柱体积，流出液由紫外检测器在254 nm检测，收集目标组分馏分，将得到的馏减压浓缩，得到高纯度的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元、染料木素等多种大豆异黄酮单体化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)渗漉提取时使用带有夹套加热保温的双层渗漉柱，介质温度为30-80°C，渗漉液流速为1-5倍柱体积/小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，介质温度为40-60°C(优选50°C)，渗漉液流速为2-4倍柱体积/小时(优选3倍柱体积/小时)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)用乙醇或甲醇浸泡脱脂大豆豆粕时，乙醇或甲醇的质量浓度为40%-85% (优选50%-80%，更优选60%)，浸泡时间为6_12小时 (优选7-10小时，更优选8小时)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)渗漉提取时所用乙醇或甲醇的质量浓度为40%-85% (优选50%-80%，更优选60%)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)回流提取提取物粗粉时所用丙酮质量浓度为80%-100% (优选85%-95%，更优选90%)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(2)洗脱液为20%-80%的甲醇-水洗脱液。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征是，洗脱方式为等度、分步或梯度。
9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征是，洗脱液为60%甲醇-水等度洗脱/50% 甲醇-水等度洗脱/40%甲醇-水和60%甲醇-水梯度洗脱/30%甲醇-水和70%甲醇-水梯度洗脱。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，用洗脱液进行洗脱时，洗脱液流速为每小时3-8倍柱体积(优选每小时5倍柱体积)。
全文摘要
本发明公开了一种从大豆中提取分离大豆异黄酮单体化合物的方法，步骤为(1)大豆异黄酮提取物的制备和(2)柱层析纯化。该方法所得到的大豆异黄酮提取物大豆异黄酮类化合物含量高，杂质低，有利于后续的进一步纯化；纯化过程中不使用对环境危害大的氯仿等有机溶剂，绿色环保；建立了一个简便、高效、能实现发明目的的途径，优化了层析方法的条件，使纯度和效率都大为提高。
文档编号C07D311/36GK102206209SQ20111008986
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者孙爱玲, 柳仁民 申请人:聊城大学