MC结合情况，流式细胞仪 计数20000个细胞。
[0037] 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合
[0038] (1)包板，10 y g/mL的PD-L1包板，50 y L/孔，4°C过夜孵育，PBST洗涤3次；
[0039] (2)封闭，5%脱脂奶粉封闭，20〇1117孔，37°〇孵育411，？851'洗涤3次；
[0040] (3)加多肽，加入0? lmg/mL FITC标记多肽PD-15,设FITC为阴性对照，浓度为 0. lmg/mL，稀释液为5%脱脂奶粉，50 y L/孔，37°C孵育2h，PBS洗涤5次，
[0041] (4)荧光显微镜观察多肽PD-15与PD-L1的结合情况，记录结果。
[0042] 为检测合成的系列多肽能否阻断ro-i/PD-Li通路，首先检测多肽与ro-i或ro-Li 结合，本研宄用标记FITC的多肽与PBMC结合，流式细胞仪检测结果显示，多肽PD-15与 PBMC结合后，与FITC对照组相比荧光信号显著增强，说明多肽H)-15与PBMC结合（如图 la，图lb，图lc，图Id所示）。多肽H)-15与重组蛋白PD-L1结合试验表明，PD-15可以与 PD-L1结合，因此得出结论，PD-15位于猪H)-l蛋白上，PD-15与PBMC的结合是与PBMC上 的ro-Li结合。
[0043] 多肽ro-15阻断TO-1/PD-L1通路后对PBMC增殖影响
[0044] (1) PBMC来临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪，PBMC的分离纯化同上述过程，用 RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至10 6个/mL ;
[0045] (2)分别取106个PBMC加入终浓度为0? lmg/mL未标记多肽（总体积200 y L)，冰 上避光孵育2h，PBS洗涤3次，洗去未结合多肽；
[0046] (3)加入 10 y mol/L CFSE，37°C孵育 lOmin，1000r/min 室温离心 lOmin，弃上清，洗 涤3次，将多余的SFSE洗去；
[0047] (4)将PBMC转至96孔细胞培养板中，50000个/孔，每个样品做6个重复，然后加 入 lOOyL 10%RPMI-1640培养基，10mg/mL conA，4mmol/L L-谷氨酰胺，10yL猪血浆（过 滤除菌）100IU/mL青霉素和100yg/mL链霉素，37°C 5% C02培养箱中培养3d，收集细胞， PBS洗涤3次，加入0.5mL PBS悬浮细胞，200目尼龙网过滤，流式细胞仪计数20000个细胞， 检测细胞中CFSE荧光信号强弱，判定PBMC增殖能力。
[0048] 多肽ro-15阻断后对PBMC增殖影响
[0049] 体外检测PBMC的增殖变化，以期证实多肽H)-15结合PBMC后能否阻断H)-l/ PD-L1通路。本研宄用感染PCV2断奶仔猪的PBMC，与多肽H)-15作用后，培养3d，检测CFSE 标记的PBMC增殖变化，流式结合显示H)-15阻断ro-1/PD-Ll通路后，PBMC的增殖显著提 高，出现大量增殖细胞，而空白对照组的PBMC几乎未增殖（图2)。说明H)-15不但能够结 合PBMC上的H)-L1，而且还能阻断ro-1/PD-Ll通路，提高免疫细胞免疫效应。为深入研宄 PD-15的免疫功能奠定基础。
[0050] (l)PBMC来自临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪，PBMC的分离纯化同上述过程， 用RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至10 6个/mL ;
[0051](2)分别取106个PBMC加入终浓度为0? lmg/mL未标记多肽（总体积200 y L)，冰 上避光孵育2h，PBS洗涤3次，洗去未结合多肽；
[0052] (3)加入 10 y mol/L CFSE，37°C孵育 lOmin，1000r/min 室温离心 lOmin，弃上清，洗 涤3次，将多余的SFSE洗去；
[0053] (4)将PBMC转至96孔细胞培养板中，50000个/孔，每个样品做6个重复，然后加 入 lOOyL 10%RPMI-1640培养基，10mg/mL conA，4mmol/L L-谷氨酰胺，10yL猪血浆（过 滤除菌）100IU/mL青霉素和100 y g/mL链霉素，37°C 5% C02培养箱中培养18~24h ;
[0054] (5)流式检测结果，计数20000个PBMC。
[0055] 免疫小鼠
[0056] (1)准备病毒，石门株CSFV为本实验室在PK-15细胞上传代获得，用终浓度为2%。 的甲醛溶液37°C灭活24h;
[0057] (2)免疫昆明鼠，50yg灭活CSFV+50yg PD-15多肽/只，皮下多点注射，同时设 CSFV和PBS两组对照，每组试验3只昆明鼠，一免后14d进行二免，二免后14d，检测CSFV 抗体的水平。
[0058] 多肽H)-15作为佐剂与灭活CSFV共同免疫昆明鼠，CSFV和PBS分别为无多肽对照 和阴性对照，二免后14d用ELISA检测CSFV抗体水平。结果显示，多肽H)-15和CSFV抗原 组的抗体效价达1:3200以上，无多肽的CSFV组的抗体效价为1:400~1:1600 (见表1和 图4)，说明多肽H)-15能够刺激B细胞活化，提高B细胞产生抗体的能力，为H)-15作为免 疫佐剂提高体液免疫反应奠定基础。
[0059] 表1 CSFV抗体效价
[0060]
【主权项】
1. 阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：CTRRNDSGTYFCGAHL PPKTQINESHQAKLT。
2. 如权利要求1所述阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽在提高体液免疫中的应用。
3. 如权利要求1所述阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽作为佐剂在提高体液免疫中的应 用。
4. 如权利要求1所述阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽在提高细胞免疫中的应用。
5. 如权利要求1所述阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽的用途，用于结合PBMC上的 ro-Ll，阻断ro-1/PD-Ll通路，提高PBMC增殖。
【专利摘要】本发明公开了基于阻断猪PD-1/PD-L1复合物结合位点的多肽，对其阻断猪PD-1/PD-L1通路后的免疫效应进行初步研究，为获得提高免疫效应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。该多肽：CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT，分子量：4012.42Da。
【IPC分类】C07K14-705, A61P37-04, A61K38-17, A61K39-39
【公开号】CN104761633
【申请号】CN201510132090
【发明人】王选年, 岳锋, 朱艳平, 李鹏, 孙国鹏, 张艳芳
【申请人】新乡学院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月25日