一种微生物复合除藻剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物复合除藻剂的制备方法，将分离纯化的胞外多聚物与高岭土等进行合理组合制备出复合微生物絮凝剂，然后将分离到的溶藻菌、藻毒素降解菌固定化，最后将复合微生物絮凝剂与固定化的溶藻菌和藻毒素降解菌合理复合，制备出复合微生物除藻剂。本发明能够实现很好的杀藻及其藻毒素降解效果，且制备过程中使用的源材料价格低廉，制备成本低且这些材料不会破坏自然生态系统，本发明制备的除藻剂将絮凝除藻、微生物溶藻及藻毒素的微生物降解有机结合成一个整体，从而实现了水华的安全高效治理。
【专利说明】一种微生物复合除藻剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环保【技术领域】，特别涉及一种微生物复合除藻剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国的大中型湖泊（>50km2)占全国湖泊总面积的80%，是重要的水源地。但是在2 万多座自然湖泊当中，75%的湖泊都被藻类生长物污染，致使鱼和其他生物无法生存，变成 死湖而走向消亡，其中以铜绿微囊藻污染最为普遍。因此，目前对于水华治理方法的研制是 环保研究领域一个重要的方向。如何实现有毒水华的快速、高效、安全治理且投入成本低， 是目前评判一个方法好坏的关键。然而现有的方法除藻效果单一等因素限制了水华治理的 效果，从而使得那些方法无法大规模应用。
[0003] 目前，治理水华的方法大致分为：1、物理方法。此类方法有紫外、超声、遮蔽、曝气 混凝、打捞、活性炭吸附等。2、化学方法。这类方法主要是通过化学试剂也称杀藻剂来控制 藻类繁殖，有机溴杀藻剂、铜盐(硫酸铜、氯化铜)、高锰酸钾等是应用最多的除藻剂。3、生物 方法。即通过自然状态下的病毒、溶藻菌、真菌、原生动物、鱼类等的溶解或吞食藻类，控制 藻类的过度生长。越来越多的研究发现，以上几种方法均存在各自的缺点，而且单一使用以 上方法水华治理效果较差。因此，将不同方法进行有机复合，制备出一种高效且安全的复合 除藻剂从而实现水华的有效治理。
[0004] 因此，将溶藻菌、藻毒素降解菌以及絮凝剂产生菌的筛选、微生物絮凝剂的制备、 微生物的固定化以及复合絮凝剂、复合除藻剂的制备过程整合成一个有机的整体，可以通 过以下几个方面实现复合除藻剂的安全高效除藻效果：1、溶藻菌、藻毒素降解菌以及絮凝 物产生菌的筛选分别用于溶藻、降解藻毒素以及产生微生物絮凝剂。2、微生物的固定化，可 以保证细菌在恶劣的自然环境中稳定的生长，并且固定化的环境可以为细菌发挥各自作用 提供必需的营养物质。3、微生物絮凝剂的制备技术可以保证微生物絮凝剂的纯度，减少其 使用量。4、将以上几部分有机复合，制备出一种复合除藻剂，从而一次实现对有害藻类的絮 凝沉降、微生物溶藻以及藻毒素的微生物降解，进而实现水华的高效且安全治理。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种微生物复合除藻剂的制备方法。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种微生物复合除藻剂的制备方法， 包括以下步骤： (1) 溶藻菌（R1)、藻毒素降解菌(Ml)的固定化：以海藻酸钠为固定材料，以丽培养基 作为溶剂，配制质量百分数为2%的海藻酸钠溶液后，对溶藻菌（R1)和藻毒素降解菌(Ml)分 别进行固定化； (2) 胞外多聚物的分离纯化：以MMDT培养基培养胞外多聚物分泌菌（DT)，将培养24小 时后的培养液通过进一步纯化，得到胞外多聚物制品； (3) 复合微生物絮凝剂的制备：以高岭土、硫酸铝钾、氯化钙以及步骤（2)得到的胞外 多聚物制品为原料，结合响应面设计方法设计胞外多聚物制品、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙 之间的比例，得到絮凝效果最好的复合微生物絮凝剂； (4) 复合微生物除藻剂的制备：以步骤（1)得到的固定化的溶藻菌和固定化的藻毒素 降解菌与步骤（3)得到的复合微生物絮凝剂为原料，制备出微生物复合除藻剂。
[0008] 进一步地，所述步骤（3)中，絮凝效果最好的复合微生物絮凝剂中，胞外多聚物制 品、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙的质量比为0. 25X ΚΓ3 :5. 64 :0. 08 :0. 125。
[0009] 本发明的有益效果是： 该方法中需要投放到水体中的微生物均为自然界中筛选到的安全菌株，释放到自然界 中不会产生负面影响； 制备过程中使用的源材料价格低廉，制备成本低且这些材料不会破坏自然生态系统。
[0010] 该技术制备的除藻剂将絮凝除藻、微生物溶藻及藻毒素的微生物降解有机结合成 一个整体，从而实现了水华的安全高效治理。
[0011] 该方法中使用的菌株均为高效菌株，分别具有很高的溶藻、藻毒素降解及絮凝除 藻效果，三者结合可以实现水体中有害藻类的高效去除。
[0012] 所述溶藻菌（R1)保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号：CGMCC No. 9198,分类命名：柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)。保藏日期为 2014 年 5 月 23 日。
[0013] 所述藻毒素降解菌（Ml)保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号：CGMCC No. 9197,分类命名：多粘 类芽孢杆菌（Peanibacillus polymyxa)。保藏日期为2014年5月23日。
[0014] 所述胞外多聚物分泌菌（DT)保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号：CGMCC No. 9196,分类命名： 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)。保藏日期为2014年5月23日。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是复合除藻剂的制备路线图； 图2是本发明复合除藻剂的絮凝效果图； 图3是本发明复合除藻剂的溶藻效果图； 图4是本发明复合除藻剂的藻毒素降解效果图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件 所做的修改或替换，均属于本发明范围，若未特殊指明，实施例中所用的技术手段为本领域 技术人员所熟悉的常规手段。
[0017] 实施例1溶藻菌（R1)的筛选 1. 1富集：将200UL采集的水样接种于100mL LB培养基中，37°C，200rpm富集培养 24h。取富集培养后的菌液5mL离心去除培养基，用无菌水清洗菌体3次后悬浮于10mL无 菌水中，得到富集培养的细菌液。
[0018] 1. 2初筛：将步骤1. 1得到的富集培养的细菌液接种于25mL的铜绿微囊藻液 (0D_=1.0)中，混合均匀后人工智能培养箱培养5d (人工智能培养箱中，光照强度为 2000LX，光暗时间比为12:12,温度为25 土 1°C )，铜绿微囊藻液出现黄化现象：铜绿微囊藻 液由原来的绿色变成黄色，黄色越明显，则表明细菌液的溶藻效果越好。
[0019] 取lmL黄化的铜绿微囊藻培养液用无菌水稀释1000倍，取200uL涂布在LB固体培 养基上，37 °C培养48h。随机挑选LB固体培养基上形状不同的单菌落接种到10mL MM培养基 (MM 培养基的成分为：K2HP043H20 2g/L，MgS047H20 0.3g/L，（NH4)2S04 0.2g/L，CaCl2 0.03g/ L，NaCl 0.9g/L，微量元素溶液0. 5 mL/L，葡萄糖20g/L;其中，微量元素溶液配方为：MnS04 1. 2311 g/L，ZnS04 0· 356g/L，FeS04 0· 256 g/L，CuS045H20 0· 3127 g/L，pH 6. 0)中，37?、 200rpm培养48h，得到16种单菌落的MM培养液； 1. 3复筛：将步骤1. 2得到的16种单菌落的MM培养液，用铜绿微囊藻液验证其溶藻效 果，即将5mL各单菌落的MM培养液分别与25mL铜绿微囊藻液混合培养，验证时的培养条件 为：光照强度为2000Lx，光暗时间比为12h : 12h，温度25±1°C，时间为48h。通过对 比铜绿微囊藻液黄化效果(黄化表示能够溶藻)，从16株单菌落筛选出中溶藻效果最好的单 一菌落，该菌落为溶藻菌菌落，将该溶藻菌菌落命名为R1。
[0020] 1.4分子生物学鉴定：取5yL R1细菌液（0D6CICI=0. 5)接种到5mL LB液体 培养基中，37°C，200rpm，12h后，取lmL R1细菌培养液，使用细菌基因组提取试剂盒 (Axygen，USA)提取R1基因组后，进行16S rRNA PCR。条件如下：选取两对引物为27F : 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，和 1492R:5，-TACGGTTACCTGTTACGACTT-3， ；PCR 体系 (50yL):10XPCR 缓冲液 5yL，25 mmol/L dNTP 4yL，基因组（50ng/ul ) 12.5yL， 27F/1492R(20ymol /L)引物各 1.25yL，rTaq 0 5yL，ddH20 25.3mL。PCR 程序为：94°C 预变性3111丨11，941：308,501：308,721：908,30个循环，72 1：5111丨11，161：5111丨11。？〇?产物 送至生工生物工程上海股份有限公司进行测序。在NCBI数据库中对16S rRNA测序结果 进行BLAST比对分析然后利用ClustalX2. 0进行多序列比对最后通过MEGA4. 0软件的邻 接（neighbor-joining, NJ)模型进行Bootstrap分析1000次重复验证，生成系统发育树。 实验结果表明R1为朽1檬酸杆菌属)。
[0021] 实施例2藻毒素降解菌（Ml)的筛选 2. 1初筛：取lmL步骤1. 1中得到的细菌富集培养液，接种到20mL含有铜绿微囊藻藻 毒素粗提液(藻毒素浓度不计）的MM (无葡萄糖）液体培养基中（藻毒素粗提液与无葡萄糖 MM液体培养基的体积比为1 :1)，接后摇床避光培养（200rpm，37°C )，观察菌株的生长情况 并选择长势最好的菌株以供复筛。
[0022] 2. 2复筛：向1L无葡萄糖的丽培养基中添加20mg的MC-LR使用该培养基对2. 1 中的培养物继续培养，200rpm，37°C避光培养48h，筛选出生长能力最好的细菌，即为铜绿微 囊藻藻毒素降解菌，并将其命名为Ml。
[0023] 2.3分子生物学鉴定：方法见1.4,鉴定结果表明，Ml属于多粘类芽孢杆菌 iPeanibacillus polymyxa、。
[0024] 实施例3胞外多聚物分泌菌（DT)的筛选 3. 1单菌落的活化：随意取实验室保存的单菌落若干，先各自接种到5mL LB液体培养 基200rpm，37°C培养12h后培养液作为种子液（0D6(KI=0. 5 )，待用。
[0025] 3. 2单菌落的培养：各取lmL不同种子液接种到100mL MMDT培养基（蔗糖5g/L， 葡萄糖 2g/L，麦芽糖 2g/L，酵母膏 5g/L，NH4Cl 1.5g/L，（NH4)2S04 1.5g/L，FeCl3 0. Olg/ L，MnCl2 0.01g/L，pH 8.0)中，30°C下培养24h，得到各细菌MMDT培养液。
[0026] 3. 3絮凝活性测定：分别取lmL3. 2中得到的MMDT培养液，加入到40 mL高岭土 悬浮液中（10 g/L)，再加入lmL CaCl2溶液（1(^/1)，200印111，21^11使其完全混匀后，静置 30min后，取4mL上清液测定上清液的0D 55(I，计算絮凝率（Flocculating Rate，FR)(见公 式Eq. 1)，以不加菌液只加 CaCl2溶液的高岭土混合液作为对照组。从而根据絮凝率筛选出 絮凝效果好的胞外多聚物（EPS)分泌菌，将该菌命名为DT。
[0027] FR= (b_a)/b*100% Eq. 1 a是各菌液组〇D55Q值，b为对照组0D55Q值。
[0028] 3.4分子生物学鉴定：方法参照1.4。鉴定结果表明，DT属于解淀粉芽孢杆菌 {Bacillus amyloliquefaciens、。
[0029] 实施例4 一种微生物复合除藻剂的制备方法，包括以下步骤： (1)溶藻菌、藻毒素降解菌的固定化，具体为： 1.1溶藻菌的固定化：使用80 mL MM培养基为溶剂，溶解2g海藻酸钠，配制海藻酸钠 溶液。将 100yLRl(0D6QQ=0.5)接种到 100mL LB 培养基，37°C、200rpm 培养 48h 后，8000rpm 离心5min，收集R1菌体。再用20 mL MM培养基再将R1菌体重悬，并将该悬浮液加入到上 述海藻酸钠溶液中，充分混合后，使用lmL蓝色枪头将该混合液逐滴注入体积为100mL的 CaCl2溶液(质量分数为2%)中，4°C静置24h后，制备出包埋着R1的海藻酸钠小球，直径平 均为2mm。
[0030] 1. 2铜绿微囊藻藻毒素降解菌的固定化：以相同的方法培养并固定铜绿微囊藻毒 素降解菌M1，制备出包埋着Ml的海藻酸钠小球，直径平均为2mm。
[0031] (2)胞外多聚物的分离纯化：以MMDT培养基培养胞外多聚物分泌菌，将培养24小 时后的培养液通过进一步纯化，得到胞外多聚物制品；具体为： 2. 1细菌DT的培养：取lmL活化的细菌DT(0D6CICI=0. 5)，接种的1L MMDT培养基中，30°C， 200rpm培养24h，室温下静置48h。
[0032] 2. 2 EPS粗提：将2. 1中培养液4000rpm离心30min后丢弃上清，然后用50mL无菌 水溶解沉淀，加入_20°C预冰的丙酮100mL，于4°C冰箱中静置24h待析出物稳定。4000rpm 离心30min后，丢弃上清收集沉淀部分。
[0033] 2. 3 EPS纯化：用50mL无菌水溶解2. 2中制备的沉淀，加入50 mLSevage (氯仿： 正丁醇=5 :1)溶液，润旋振荡器充分振荡5min后，离心（4000rpm离心30min)收集上清液， 冷冻干燥机对收集到的上清液冷冻干燥，制得EPS。
[0034] (3)复合微生物絮凝剂的制备：以高岭土、硫酸铝钾、氯化钙以及步骤（2)得到的 胞外多聚物制品为原料，结合响应面设计方法设计胞外多聚物制品、高岭土、硫酸铝钾、氯 化钙之间的比例，得到絮凝效果最好的复合微生物絮凝剂，具体为： 3. 1 BBD实验设计：使用3水平(高（+1)，中（0)，低（-1))4因素（EPS、高岭土、硫酸铝 钾、氯化I丐)Box-Behnken Design (BBD)设计出27组实验。各因素设计值及真实值见表1。
[0035] 表1编码及实验值水平
【权利要求】
1. 一种微生物复合除藻剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 溶藻菌、藻毒素降解菌的固定化：以海藻酸钠为固定材料，以MM培养基作为溶剂， 配制质量百分数为2%的海藻酸钠溶液后，对溶藻菌和藻毒素降解菌分别进行固定化； (2) 胞外多聚物的分离纯化：以MMDT培养基培养胞外多聚物分泌菌，将培养24小时后 的培养液通过进一步纯化，得到胞外多聚物制品； (3) 复合微生物絮凝剂的制备：以高岭土、硫酸铝钾、氯化钙以及步骤（2)得到的胞外 多聚物制品为原料，结合响应面设计方法设计胞外多聚物制品、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙 之间的比例，得到絮凝效果最好的复合微生物絮凝剂； (4) 复合微生物除藻剂的制备：以步骤（1)得到的固定化的溶藻菌和固定化的藻毒素 降解菌与步骤（3)得到的复合微生物絮凝剂为原料，制备出微生物复合除藻剂。
2. 根据权利要求1所述的一种微生物复合除藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤 (3)中，絮凝效果最好的复合微生物絮凝剂中，胞外多聚物制品、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙 的质量比为 〇· 25X 1(Γ3 :5· 64 :0· 08 :0· 125。
3. 根据权利要求1所述的一种微生物复合除藻剂的制备方法，其特征在于，所述溶藻 菌保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（CGMCC)，保藏编号：CGMCC No. 9198,分类命名：柠檬酸杆菌(C/iro如cier sp.)。
4. 根据权利要求1所述的一种微生物复合除藻剂的制备方法，其特征在于，所述 藻毒素降解菌保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号：CGMCC No. 9197,分类命名：多粘类芽孢杆菌 iPeanibacillus polymyxa、。
5. 根据权利要求1所述的一种微生物复合除藻剂的制备方法，其特征在于，所述胞 外多聚物分泌菌保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号：CGMCC No. 9196,分类命名：解淀粉芽孢杆菌 {Bacillus amyloliquefaciens、。
【文档编号】C12R1/07GK104140963SQ201410289634
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】孙朋飞, 赵宇华, 王冠, 卢丽玲 申请人:浙江大学