专利名称：一种低成本培养基工业化生产溶藻菌的制备方法
技术领域：
本发明属于环保技术领域，更具体涉及一种低成本培养基规模化生产溶藻菌的制 备方法。适宜工业化生产，溶藻菌适用于在富营养化水体中控制蓝藻(主要是微囊藻)水华 的爆发。
背景技术：
蓝藻是地球上最早出现的光合自养生物，在长期的进化过程中，这类生物发展了 一套独特的形态和生理生化机制，能够在各种不同生境中生衍，使其具有一定的竞争优势。 在环境条件适宜时，某些蓝藻能快速生长，当达到一定生物量时，微囊藻在水体表层大量聚 集，形成肉眼可见的藻类聚集物，即蓝藻(微囊藻)水华。蓝藻水华引起的一系列环境和健康 问题，正受到全世界各国的高度重视。藻类过度繁殖是导致湖泊水环境恶化的关键环节， 有害藻类的过度增殖，尤其产毒素蓝藻给人类健康构成了潜在的威胁。针对我国湖泊面 临的严重富营养化及其灾害问题，在湖内污染源、流域点源与面源污染控制需要投入巨大 资金且短期内难以取得成效的情况下，探索浮游藻类生物量的控制、抑制“水华”发生、改 善湖泊水质的有效途径是非常必要的。藻类的控制技术可归结为物理方法、化学方法和生 物方法。物理方法主要是电磁场、机械除藻等，可作为蓝藻水华控制的辅助性措施，但处 理能力有限，局限于水处理工程应用。化学除藻的方法主要包括施用除草剂、杀藻剂及金 属盐等。化学药剂除藻技术虽有快速高效的优点，但会带来水体的二次污染问题，直接在 作为饮用水源的湖泊、水库等的应用受到限制或必须慎用。生物学控藻技术是利用藻类的 天敌及其产生的生长抑制物质对藻类的生长、繁殖进行抑制，从而达到控制藻类数量、防 治富营养化带来的各种危害，目前正处在研究发展的初期阶段。溶藻细菌(algae-lysing bacteria)，作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，对维持藻的生物量 平衡具有非常重要的作用。溶藻细菌，作为水华防治的生物，已经引起越来越多人的关 注。然而，培养溶藻菌的主要营养成分为硝酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钙，柠檬酸， 柠檬酸铁铵，乙二胺四乙酸，碳酸钠，A5 + Co Solution (A5溶液)大豆胰蛋白等(见ZL ZL2004100129324 “一种肠杆菌及制备方法和应用”)，这些原料，尤其是大豆胰蛋白成本较 高，难用于大规模生产，给溶藻菌的应用带来了一定的困难。本发明采用1/2体积的豆腐水 进行培养，原料来源容易，生产成本低廉，且易于培养，适宜工业化生产，从而达到控制富营 养化湖泊蓝藻水华发生的目的。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种低成本培养基工业化生产溶藻菌的制备方法。方 法易行，操作简便，在于降低了富营养化水体，控制了蓝藻水华爆发。该方法原料来源容易， 生产成本低廉，且易于培养，适宜工厂化的生产。为了达到上述的目的，本发明采取以下技术措施
本发明采用(新鲜未稀释豆腐水与井水的体积比)1/2体积的豆腐水为原料，适当添加
3少量营养元素(N、P、K、Ca、Mg、具体用量见配制培养基)进行溶藻菌培养。其主要技术措施 如下
溶藻菌菌种来源
溶藻菌为专利菌种(专利号ZL2004100U9324，菌种名为肠杆菌；拉丁文是 Enterobacteriaceae . sp，保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为M204010。) 该溶藻菌能在市场中买到。一种低成本培养基工业化生产溶藻菌的制备方法，其步骤是
其技术构思是:A、配制溶藻菌I、溶藻菌II菌种培养基；B、溶藻菌I、溶藻菌II菌 种的培养；C、III级溶藻菌种子(母液扩大)规模化生产培养。A、溶藻菌I、溶藻菌II菌种培养基
①配制培养基硝酸钠100-1 lOrng，磷酸氢二钾3-%ig，硫酸镁7-8mg，氯化钙， 柠檬酸0. 5-0. 6mg,柠檬酸铁铵0. 5-0. 7mg,乙二胺四乙酸0. 5-0. 7mg,碳酸钠Umg，A5 + Co Solution (A5 溶液)0· 1-0. 3ml,蒸溜水 Distilled water99. 9 ml, 5-6 g/升大豆胰 蛋白，混合溶解后可得培养基。培养基PH7.6。②灭菌培养基配制好后采用高压蒸汽灭菌，当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时， 水蒸气的温度升高到121°C，经15 30min灭菌结束，培养基降到20 25°C后，即可进行 接种。接种应在无菌室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超净工作台内的紫外 灯同时打开，灭菌lh。试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台上分别按斜面接种、平板划 线和液体培养接种法进行接种。B、溶藻菌I、溶藻菌II菌种的培养将溶藻菌原种接种在经过A步骤中的①②灭 菌好的培养基中，将经过A步骤①②试管培养基中繁殖而成的I级溶藻菌菌种接种后应放 在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在25 ^TC,每天应摇动2 3次为宜。培养 的I级溶藻菌菌种要定期更换，(试管)斜面和平板三个月换一次；液体试管或小三角瓶夏 季保种19 21天，冬季一个月换一次培养基。II级溶藻菌种子培养(三角瓶液体培养)接 种后应放在恒温摇床上振动培养，温度控制在25 ^TC,如没有恒温摇床可以培养架上或 生物培养箱内培养，每天应摇动2 3次为宜。II级溶藻菌菌种培养约5 7天后即可生 长好，生长好的II级菌种可以进行III级溶藻菌种子(母液扩大)培养。C、III级溶藻菌种子(母液扩大)规模化生产培养
①培养基配制利用经上述A步骤中的①②菌种培养基进行III级溶藻菌种子和工 厂化生产成本高，为了降低成本，本发明用下面培养基代替上述A步骤的①(溶藻菌菌种 培养基)培养基即磷酸氢二钾，硫酸镁7-8mg，豆腐废水1000ml，调至pH=7.6。 配制前先将豆腐水用双层纱布过滤，再用自来水或深井水与过滤后豆腐水按照1 :1比例稀 释；然后加入溶解好的磷酸氢二钾和硫酸镁，调节pH至7. 6。②操作
a 溶藻菌III级种子(母液扩大培养)将培养好的II级菌种接种入配制好的C步骤中 的①培养基中，接种量为10%，将接种好的培养基分装入25L的清洗干净的塑料壶或桶中。 把接种好的菌水塑料壶用棉塞或牛皮纸包扎，在壶口插上通气和出气管各一支，在观 32°C条件下通气发酵培养。条件适宜时一般5天左右发酵完成，可以作为规模化生产的种 子。
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规模化生产方法发酵池10m3 ；配制体积浓度为5%的“84”消毒液40L (生产厂 家上海新佳佳美容护肤品有限公司)，喷洒在发酵池壁和底部，24h后，用干净的深井水清 洗发酵池。取配制好的C步骤中的①培养基7 8 m3放入10 m3的发酵池中，加溶藻菌III 级种子(母液)lm3，然后加培养液至10m3，最后用塑料薄膜密封，28 32°C发酵培养。一般 6 8天后即可得到溶藻菌成品。该溶藻菌广泛用于控制水域中蓝藻发生的水华中。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
①溶藻菌的喷洒规模化生产好的溶藻菌成品按照一定浓度(1/10000)喷洒在蓝藻 发生的湖泊、水库、河道、池塘等富营养化水体中。②监控建立的监控条件和标准为蓝藻水体的颜色的变化，叶绿素含量下降，蓝藻 优势度减少，水体富营养化程度降低、水体的透明度上升。③用途说明溶藻菌用于除藻具有以下优点方法容易，操作简单，无污染，安全 性高。相比杀蓝藻的如硫酸铜等化学物质具有明显的优点。使用细菌清除蓝藻不会带来第 二次污染。在较大的水体中形成一种新的生态平衡具有原料来源容易，生产成本低廉，且易 于培养，适宜工业化生产，具有较强的操作性。
具体实施例方式实现例1
一种低成本培养基工业化生产溶藻菌的制备方法，其步骤是 1、采用溶藻菌菌种
溶藻菌为专利菌种(专利号ZL2004100U9324，菌种名为肠杆菌；拉丁文是 Enterobacteriaceae . sp，保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为M204010。) 可在市场上购买。2,1. II级溶藻菌菌种(实验室)培养
①培养基硝酸钠100-1 lOrng，磷酸氢二钾3-%ig，硫酸镁7-8mg，氯化钙，柠 檬酸0. 5-0. 6mg,柠檬酸铁铵0. 5-0. 7mg,乙二胺四乙酸0. 5-0. 7mg,碳酸钠llmg，A5 Solution + Co0.l-0.3ml，蒸馏水(Distilled water)99. 9 ml, 5-6 g/升大豆胰蛋白，混
合溶解后可得培养基。培养基pH=7.6。②灭菌培养基配制好后采用高压蒸汽灭菌，当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时， 水蒸气的温度升高到121°C，经15 30min，即可进行接种。接种应在无菌室内的超净工作 台上进行，接种前将无菌室内和超净工作台内的紫外灯同时打开，灭菌lh。试管、平板和三 角瓶接种应在超净工作台上分别按斜面接种、平板划线和液体培养法进行接种。③培养将实例步骤1中的溶藻菌菌种在上述步骤2的①②步骤试管培养基中繁 殖而成的I级溶藻菌菌种，接种后应放在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在25或 沈或27或观或^TC,每天应摇动2-3次为宜。步骤1中的溶藻菌菌种要定期更换，(试 管)斜面和平板三个月换一次；液体试管或小三角瓶夏季保种19 21天，冬季一个月换 一次培养基。II级溶藻菌种子培养(三角瓶液体培养)接种后应放在恒温摇床上振动培养， 温度控制在25或沈或27或观或^TC,如没有恒温摇床可以培养架上或生物培养箱内培 养，每天应摇动2 3次为宜。II级溶藻菌菌种培养约5 7天后即可生长好，生长好的II级溶藻菌菌种可以进行III级溶藻菌种子(母液扩大)培养。3、III级溶藻菌种子(母液扩大)规模化生产培养
①培养基配制利用上述步骤2中③生长好的II级溶藻菌菌种培养基进行III级溶藻 菌种子和工厂化生产成本高，为了降低成本，本发明用下面培养基代替上述步骤①中的溶 藻菌菌种培养基即磷酸氢二钾，硫酸镁7-8mg，1/2体积的豆腐废水1000ml， pH7. 6。配制前先将豆腐水用双层纱布过滤，再用自来水或深井水与过滤后豆腐水按照1 :1 比例稀释；然后加入溶解好的磷酸氢二钾和硫酸镁，调节pH至7. 6。②操作
a 溶藻菌III级溶藻菌种子(母液扩大培养)取配制好的培养基50L lm3，放入25L 的清洗干净的塑料壶或桶中，再加入50L 1 m3培养好的II级菌种。然后将培养基加 到25L。把接种好的菌水塑料壶用棉塞或牛皮纸包扎，在壶口插上通气和出气管各一支，在 28 32°C条件下通气发酵培养。条件适宜时一般5天左右发酵完成，可以作为规模化生 产的种子。规模化生产方法发酵池10m3 ；配制体积含量为5%的“84”消毒液40L，喷洒在发 酵池壁和底部，24h后，用干净的深井水清洗发酵池。取配制好的培养液7 8 m3放入10 m3的发酵池中，加溶藻菌III级种子(母液)lm3，然后加培养液至10m3，最后用塑料薄膜密封， ^ 32°C发酵培养。一般7天左右即可。4、应用溶藻菌主要用于控制水域中蓝藻发生的水华。①溶藻菌的喷洒规模化生产好的溶藻菌成品按照一定浓度(1/10000)喷洒在 蓝藻发生的湖泊、水库、河道、池塘等富营养化水体中。④监控建立的监控条件和标准为是蓝藻水体的颜色的变化，叶绿素含量下降，蓝 藻优势度减少，水体富营养化程度降低、水体的透明度上升。③用途说明溶藻菌用于除藻具有以下优点方法容易，操作简单，无污染，安全 性高。相比杀蓝藻的如硫酸铜等化学物质具有明显的优点。使用细菌清除蓝藻不会带来第 二次污染。在较大的水体中形成一种新的生态平衡。本发明与现有溶藻菌规模化技术相比 较具有原料来源容易，生产成本低廉，且易于培养，适宜工业化生产，具有较强的操作性。
权利要求
1. 一种低成本培养基工业化生产溶藻菌的制备方法，其步骤是 A、溶藻菌I、溶藻菌II菌种培养基①配制培养基硝酸钠100-110mg，磷酸氢二钾3-%ig，硫酸镁7-8mg，氯化钙， 柠檬酸0.5-0. 6mg，柠檬酸铁铵0.5-0. 7mg，乙二胺四乙酸0.5-0. 7mg，碳酸钠Umg，A5 + Co Solution (々5溶液)，蒸馏水99.9 ml, 5-6 g/升大豆胰蛋白，混合溶解后得培养基，培养 基 Ph=7. 6 ；②灭菌培养基配制好后采用高压蒸汽灭菌，当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸 气的温度升高到121°C，经15 30min灭菌结束，培养基降到常温后，进行接种，接种在无菌 室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超净工作台内的紫外灯同时打开，灭菌lh， 试管、平板和三角瓶接种在超净工作台上分别按斜面接种、平板划线和液体培养接种法进 行接种；B、溶藻菌I、溶藻菌II菌种的培养将溶藻菌原种接种在经过A步骤中的①②灭 菌好的培养基中，将经过A步骤①②试管培养基中繁殖而成的I级溶藻菌菌种接种后应放 在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在25 ^TC,每天应摇动2 3次为宜；培养 的I级溶藻菌菌种要定期更换，斜面和平板三个月换一次；液体试管或小三角瓶夏季保种 19 21天，冬季一个月换一次培养基，II级溶藻菌种子培养接种后放在恒温摇床上振动培 养，温度控制在25 ^°C，每天摇动2 3次，II级溶藻菌菌种培养5 7天后，II级菌种 进行III级溶藻菌种子培养；C、III级溶藻菌种子规模化生产培养①培养基配制用上述(A)步骤的①培养基磷酸氢二钾，硫酸镁7-8mg，豆 腐废水1000ml，调至pH=7. 6，将豆腐水用双层纱布过滤，再用自来水或深井水与过滤后豆 腐水按照1 :1比例稀释；然后加入溶解好的磷酸氢二钾和硫酸镁，调节PH至7. 6 ； ②操作a 溶藻菌III级种子将培养好的II级菌种接种入配制好的(C)步骤中的①培养基，接 种量为10%，将接种好的培养基分装入25L的清洗干净的塑料壶或桶中，把接种好的菌水塑 料壶用棉塞或牛皮纸包扎，在壶口插上通气和出气管各一支，在观 32°C条件下通气发酵 培养，5天发酵完成，作为规模化生产的种子；b:规模化生产方法发酵池10m3 ；配制5% 84消毒液，喷洒在发酵池壁和底部，24h 后，用干净的深井水清洗发酵池，取配制好的(C)步骤中的①培养基7 8 m3放入10 m3的 发酵池中，加溶藻菌III级种子lm3，然后加培养液至10m3，最后用塑料薄膜密封，观 32°C发 酵培养，6 8天后得到溶藻菌成品。
全文摘要
本发明公开了一种低成本培养基工业化生产溶藻菌的制备方法，其步骤A、溶藻菌Ⅰ、溶藻菌Ⅱ菌种培养基①配制培养基；②灭菌培养基配制好后采用高压蒸汽灭菌；B、溶藻菌Ⅰ、溶藻菌Ⅱ菌种的培养将(A)步骤中的第一步①的溶藻菌菌种在上述步骤②中(A)步骤①试管培养基中繁殖的Ⅰ级溶藻菌级菌种接种后放在培养架上或生物培养箱内培养；C、Ⅲ级溶藻菌种子规模化生产培养①培养基配制调节pH至；②操作a溶藻菌Ⅲ级种子:将培养好的Ⅱ级菌种接种入配制好的(C)步骤中的①培养基；b:规模化生产方法得到溶藻菌成品。方法易行，操作简便，降低了富营养化水体，控制了蓝藻水华爆发。原料来源容易，生产成本低廉，适宜工厂化生产。
文档编号C12N1/12GK102093956SQ20101058823
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘军, 刘彬彬, 刘浩, 唐智伟, 赵冰, 项娇 申请人:武汉昌宝环保工程有限公司