专利名称：一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物，具体涉及一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内的生态灾害，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前治理水体富营养化主要是采用物理和化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到国内外环境工作者的广泛关注。国外对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来， 陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到菌一藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。水华鱼腥藻(引起水华的常见藻类)是导致水体富营养化的主要藻种之一，其分布广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然而截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥藻的研究甚是罕见。为此，探讨溶藻菌株对水华鱼腥藻的生长效应和光合色素的影响，对于安全、经济、高效地控制水体富营养化、治理水华具有重要的科学实践价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够有效降解水华鱼腥藻的芽孢杆菌。本发明所述的芽孢杆菌从农业部都市农业(南方)重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，命名为芽孢杆菌Bacillus SSAL-6,已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏日期2012年6月6 日，保藏编号=CGMCC No. 6195。本发明的另一目的是提供一种利用微生物去除水华鱼腥藻的方法，即所述芽孢杆菌Bacillus SSAL-6应用在降解水华鱼腥藻上，以消除当前水华中水华鱼腥藻的大量繁殖带来的环境污染问题。所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%。实验结果表明，在自然条件下，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。本发明所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻效应，能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了有效手段，为微生物治理水华的研究提供了重要基础。
图I为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6在1000X下的染色显微图。图2为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻细胞数的影响。图3为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻干重的影响。图4为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响。图5为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻叶绿素a的影响。
具体实施例方式实施例I、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的分离、纯化及其鉴定
I、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的分离及纯化以农业部都市农业(南方)重点实验室黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离，将分离获得的25株细菌分别置于IOOmLLB液体培养基中，摇床转速为180r · π ιΓ1，〗？！下培养24h，然后分别取800 μ L滴加到水华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具有较高溶藻效应的菌株SSAL-6。经鉴定为芽孢杆菌，命名为Bacillus SSAL-6。将其接入斜面培养基，于冰箱4°C保存；将扩大培养制成的菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为25%，放入-80 V的冰箱保藏。所述的LB液体培养基组分及配比为酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ；蒸馏水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。所述的LB固体培养基组分及配比为酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ；琼脂粉，15g ;蒸馏水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。所述的水华鱼腥藻固体培养基组分及配比为磷酸氢二钾(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸镁(MgSO4 · H2O), O. 125g ;碳酸钙(CaCO3)，O. IOOg ;柠檬酸铁(1% 水溶液),0. 5mL ;柠檬酸(1%水溶液)，O. 5mL ;钥酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，I. 5mL ;琼脂粉，15g ；蒸懼水，1000mL。2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的生理生化鉴定该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状，芽孢为椭圆形，大多中央生菌落呈近橘黄色。使用弓 I 物 7f(5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3，)和1540r (5’ AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)。经序列比对表明，该菌株为芽孢杆菌，将其命名为Bacillus SSAL-6。该芽孢杆菌Bacillus SSAL-6已于2012年6月6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保存号为CGMCCNo. 6195。实施例2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻生长效应和光合色素的影响I、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻生长效应的影响水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法(国家环保部)，采用水生111号无氮培养液培养，pH为7. 5。培养温度30±2°C，连续24h光照，光照强度3000±2001x，
静置培养，每天定期摇动3次。在水华鱼腥藻浓度为5X10^1 X IO5个/mL时，分别向IOOmL藻液中加入芽孢杆菌BacillusSSAL-6 (菌体浓度约为IO9个/mL)，处理浓度(v/v)梯度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%,每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液(LB培养液水生111号无氮培养液)，分别用于培养芽孢杆菌Bacillus SSAL-6和水华鱼腥藻形成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法从接种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的藻液O. ImL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数40 X 10 ，随机取五个视野，数出所看到的细胞数，取其平均值。N=IO X aX Sit/Sft，其中，a—每个视野内细胞平均值，Sif-计数框面积，Sft-视野面积，N-每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法取定量的藻液，离心得藻，加入称量皿，在80°C烘至恒重。不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果如图2所示。结果表明，水华鱼腥藻细胞的去除效果与芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度呈现出一定的浓度相关性，即随着芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度的增长，对水华鱼腥藻细胞的去除作用增强。当芽孢杆菌BaciIIus SSAL-6菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为3%、7%、12%、16%、19%,22%和25%，培养168h后分别变为5%、17%、26%、29%、31%、34%和36%，与对照相比，呈现显著差异(P < O. 05)。不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如图3所示。结果表明，纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当LB液体培养基浓度依次为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养168h后的水华鱼腥藻干重相应增加，分别为 15. 90、16. 40、16. 77、17. 74、18. 11、19. 38 和 22. 04mg/mL。通过排除 LB 液体培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着菌体浓度从5%依次升至35%，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为5%、16%、27%、31%、36%、37%和40%。所述的水华鱼腥藻液体培养基组分及配比为磷酸氢二钾(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸镁(MgSO4 -H2O), O. 125g ;碳酸钙(CaCO3)，O. IOOg ;柠檬酸铁(1% 水溶液)，0. 5mL ;柠檬酸(1%水溶液)，O. 5mL ;钥酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，I. 5mL ;蒸懼水，1000mL。2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻光合色素的影响以Bhandari and Sharma法连续扫描400 750nm波长范围内色素吸收光谱，并对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定取水华鱼腥藻藻液IOmL过O. 45 μ m的混合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用SmL热乙醇于热水浴中萃取2min，将萃取液超声破碎5-20min后，于暗处静置2_6h，离心(5000r/min，4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值(E665b = Absea-Abs75tlb),然后滴加 200 μ L 的 lmol/L盐酸酸化,5min 后于波长 665nm和 750nm处再测吸光值，计算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75tlaX采用热乙醇为萃取溶剂，A=IL 5，K=2. 43，比色皿光程为Icm
27.9 X ( ββ5 - Ε665") X V 叶绿素 a ( pg/mL ) =---不同浓度的芽孢杆菌BaciIIus SSAL-6对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定结果如图4所示。结果表明，不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6作用于水华鱼腥藻时，其色素光谱吸收曲线变化差异较大。高浓度(> 25%)处理下光谱吸收曲线已非常不明显，各处峰值模糊甚微，表明芽孢杆菌Bacillus SSAL-6已大大地抑制了藻体色素的种类和含量。中低浓度(5 25%)处理下，随着菌体浓度的增加，各色素光谱吸收峰值均有降低，这与溶藻菌对藻体细胞数以及干重的影响相一致，谱图充分体现溶藻菌的浓度相关性。叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少，充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻叶绿素a的影响的测定结果如图5所示(A、B、C、D、E、F、G、H分别代表芽孢杆菌BacillusSSAL-6 浓度为 0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%)。结果表明，芽孢杆菌 Bacillus SSAL-6对叶绿素a的抑制作用随着菌体浓度的增加而增强。菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，对芽孢杆菌Bacillus SSAL-6而言，24h对叶绿素a的抑制率分别为8%、14%、21%、29%,35%,42% 和 46%，168h 后依次升至 74%、81%、90%、94%、95%、95% 和 96%。此外，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对叶绿素a的抑制率亦随着时间的延伸而增大，但增势趋缓，如浓度为35%的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6在24 120h内对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率由46%逐渐升至95%，而120 168h由95%仅升至96%。·
权利要求
1.芽孢杆菌(Bacillus)SSAL-6，其特征在于其保藏编号为CGMCCNo. 6195。
2.如权利要求I所述的芽孢杆菌(Bacillus)SSAL-6在降解水华鱼腥藻中的应用。
3.如权利要求2所述的芽孢杆菌(Bacillus)SSAL-6在降解水华鱼腥藻中的应用的方法，其特征在于所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%。
全文摘要
本发明公开了一种芽孢杆菌及其在降解水华鱼腥藻中的应用，所述芽孢杆菌从农业部都市农业(南方)重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，命名为芽孢杆菌Bacillus SSAL-6，已于2012年6月6日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.6195；在自然条件下，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。本发明所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻效应，能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了有效手段，为利用微生物治理水华提供了重要的方法。
文档编号C12R1/07GK102796685SQ20121028507
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者沈健英, 孙秀敏 申请人:上海交通大学