专利名称：筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种筛选细胞周期素依赖性激酶5(cdk5/p25)抑制剂的方法。
背景技术：
阿尔兹海默病(alzheimer’ s disease, AD)是一种进行性神经系统退行性疾病，其主要病理改变为老年斑(senile plaque, SP)和神经元纤维缠结(neurofibrillarytangle, NFT)。后者为高度磷酸化的Tau蛋白聚集而成。细胞周期素依赖性激酶5 (Cyclin-dependent kinase 5, cdk5)与其调节蛋白p25结合后具有生物活性在神经系统中表达丰富，在AD病人Tau的过度磷酸化中发挥重要作用。所以筛选细胞周期素依赖性激酶5的抑制剂对开发新药有着非常重要的意义。
目前用于筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法主要有化学萤光法(chemiluminescent assay)和放身寸法等(Lee V. ; Trojanowski J. Curr. Biol. 1992,2，653-656 ；Evans, D. B. ; Rank Κ. B. ; Sharma S. K. J. Biochem. Biophys. Methods2002，50，151-161 ;Bancher，C., Brunner, C. , Lassmannj H. , Budkaj H. , JellingerjK.，Wichej G.，Seitebergerj F.，Grundke-Iqbalj I.，Iqbal, K. and Wisniewski,H.M. Brain Res. 1989,477, 90-99)。化学萤光法易受到背景干扰，容易得到假阳性或假阴性结果；放射法因为使用到放射性元素，对环境和人体有害，需要专门的实验室及专业的操作人员，放射性废弃物处理需要专门的处理。且以上两种方法均需标记物，极大地增加了筛选成本(Kosik S. K. Alzheimer’s plaques and tangles: advances on both fronts.Trends Neurosci. 1991, 14, 218-219)。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分，近年来在药物筛选中得到了广泛的应用(Lee，V. Μ.-Y.，Balin, B. J., Otvos, L.and Trojanowski, J. Q. Science，1991，251，675-678)。但现有技术中还未有用质谱检测方法筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R. de Boer, Thomas Letzel,Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman, Wilfried M. A. Niessen, and Hubertus Irth.Anal. Chem. 2004，76，3155—3161)。
发明内容
为解决现有的筛选细胞周期素依赖性激酶5的技术中，荧光法易受干扰，放射法对人体有害、污染环境、成本高的的技术问题，本发明提供一种筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法。
本发明提供一种筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其包括以下步骤(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液由三氢甲基氨基甲烷盐酸、二硫苏糖醇和氯化镁制成，或由醋酸铵、二硫苏糖醇和氯化镁制成，PH值为6-8 ；(2)标准品的配制将憐酸化十妝Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；
(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为O. 25-10微摩尔/升的待测物，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在30-37 °C反应30-60分钟后，分别加入有机溶剂终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ；(4)标准品、对照品和样品的检测对标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中分别提取Pro-Lys-Thr(憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+和[M+3H]3+的色谱图，从总离子流图中分别提取 Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+和[M+3H]3+的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和与 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和的比值为纵坐标，得到 Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 浓度的线性方程；对对照品和样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件色谱柱安捷伦SB-C18 3. 0*100毫米，I. 8微米；流动相水和乙腈；梯度洗脱程序0-1分钟,4%乙腈；1-5分钟，4%_8%乙腈；5-10分钟，8%-10%乙腈；10-20分钟，10%-60%乙腈；流速0· 2毫升/分钟；进样量5微升；所述的质谱检测条件毛细管电压3500伏特；
气体温度350摄氏度；雾化器温度350摄氏度；干燥气流速9升/分钟；雾化气气压275. 8千帕；锥孔电压65伏特；(5)待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率分别计算对照品、样品中产物Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和的比值，根 据⑷得到的线性方程中，求得对照品和样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Ρ -Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的浓度，计算出待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率。优选的是，所述的缓冲液的pH为7. 4。优选的是，所述的pH值为6-8的缓冲液是由50毫摩尔/升三氢甲基氨基甲烷盐酸，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁和盐酸配制而成的。优选的是，所述的pH值为6-8的缓冲液是由50毫摩尔/升的醋酸铵，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁和盐酸配制而成的。优选的是，所述的步骤(2)中的标准品溶液是由水、甲醇和乙腈中的一种或两种配制的；更有选的是，所述的步骤(2)中的标准品溶液是由体积比为1:1的水和甲醇配制而成，或由体积比为1:1的水和乙腈配制而成的。优选的是，步骤(3)中，所述的对照品和样品在30°C反应30分钟。优选的是，步骤(3)中，所述的有机溶剂的体积为50微升。优选的是，步骤(3)中，所述的有机溶剂为甲醇或乙腈。本发明的有益效果(I)本发明以十妝 Pro-Lys-Thr -Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 为底物，细胞周期素依赖性激酶5在30-37 V催化底物生成磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,用超高效液相色谱和质谱联用对磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu进行定量，可用于分析天然产物提取物、单体及合成类细胞周期素依赖性激酶5抑制剂对细胞周期素依赖性激酶5的体外抑制率，进而筛选出细胞周期素依赖性激酶5的抑制剂，例如本发明实施例中6-(苄基氨基)-2(R)-[[l_(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rd的抑制率分别为50%，50%, 29%，15%，10%或21%，13%，可以筛选出6-(苄基氨基)-2 (R) -[ [I-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤、人参皂苷Rgl对细胞周期素依赖性激酶5具有较好的的抑制效果；(2)本发明还可用于评价细胞周期素依赖性激酶催化活性，所述的细胞周期素依赖性激酶5催化活性是指在30_37°C，细胞周期素依赖性激酶5催化底物生成磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的量,若酶活性较好，则生成磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的量就多，若酶的活性较差，则生成磷酸化十Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的量就少；
(3)本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数高于O. 99，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了荧光法易受干扰，出现假阳性和假阴性结果，放射法对人体有害、污染环境、成本高的问题。
图I为实施例I中I微摩尔/升的标准品磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱图；图2为实施例I中I微摩尔/升标准品磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的提取色谱图；图3为实施例I中I微摩尔/升内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的提取色谱图； 图4为实施例I中不同浓度磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 标准品的标准曲线；图5为实施例I中6-(苄基氨基)-2 (R) -[ [I-(羟甲基)丙基]氨基]_9_异丙基嘌呤的IC5tl拟合曲线图；图6为实施例2中样品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱图；图7为实施例3中样品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱图；图8为实施例4中样品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱图。
具体实施例方式本发明提供一种筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其包括以下步骤(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升三氢甲基氨基甲烷盐酸或醋酸铵，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调节pH值至6-8，优选pH值为7. 4 ;(2)标准品的配制将憐酸化十妝Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应
对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为O. 25-10微摩尔/升的待测物，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在30-37 °C反应30-60分钟后，分别加入50微升的甲醇或乙腈终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ；(4)标准品、对照品和样品的检测 米用憐酸化十妝Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val为内标，以内标法定量，对标准品进行超高效液相色谱和电喷雾电离源正极模式质谱检测，从总离子流图中分别提取Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的色谱图，从总离子流图中分别提取 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和与Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和的比值为纵坐标，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 浓度的的线性方程y=ax+b式中，y为所述的标准品 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+和[M+3H]3+ 的面积峰之和的比值；x 为标准品 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数r2 ;对对照品、样品溶液进行超高效液相色谱和电喷雾电离源正极模式质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪安捷伦RRLC1200SL ；色谱柱安捷伦SB-C18 (3. 0*100毫米，I. 8微米)；流动相7jC (A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序O-1分钟，4%B ; I -5 分钟，4%B_8%B ; 5_ IO 分钟，8%B-10%B ； 10-20分钟，10%B-60%B ；流速0· 2晕升/分钟；进样量5微升；所述的质谱检测条件质谱仪安捷伦6520;
离子源电喷雾电离源(ESI)正离子模式；细管电压3500伏特；气体温度350摄氏度；雾化器温度350摄氏度；干燥气流速9升/分钟；雾化气气压275. 8千帕； 锥孔电压65伏特；(5)待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率分别计算对照品、样品中Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和，得到对照品、样品中 Pro-Lys-Thr (憐化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和与内标 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+的峰面积之和的比值，根据(4)得到的的线性方程，求得对照品和样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu浓度,待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率按照以下公式计算I样品=(C对照-C样品)/ C对照X 100%式中，为待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率，C5iwS根据线性方程求得的对照品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu浓度，量纲为微摩尔/升、C#s为根据线性方程求得的样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 浓度,量纲为微摩尔 / 升。优选的是，所述的步骤(2)中的标准品溶液是由水、甲醇和乙腈中的一种或两种配制的；更有选的是，所述的步骤(2)中的标准品溶液是由体积比为1:1的水和甲醇配制而成，或由体积比为1:1的水和乙腈配制而成的。优选的是，步骤(3)中，所述对照品和样品在30°C反应30分钟。根据步骤(5)计算出的待测物的抑制率，可以筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂抑制率高，说明待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制效果好，可以作为细胞周期素依赖性激酶5抑制剂；抑制率低，说明待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制效果差，不适合作为细胞周期素依赖性激酶5抑制剂。下面结合实施例进一步说明本发明，实施例中所使用的物质均可通过商购获得。实施例I结合图1-5说明实施例I(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升三氢甲基氨基甲烷盐酸，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调PH值为7. 4 ；(2)标准品的配制磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 标准品的配制用水将磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu标准品分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为O. 25微摩尔/升的6-(苄基氨基)-2 (R) -[ [I-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤(roscovitine)，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu，终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足； 对照品和样品在30 C反应30分钟后，加入50微升的乙臆终止反应，同时加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val,供超高效液相色谱和质谱测定；(4)标准品、对照品和样品的检测米用憐酸化十妝Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 为内标，以内标法定量，对标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中分别提取 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的 m/z=602. 8626的[M+2H]2+和m/z=402. 2432的[M+3H]3+的色谱图，从总离子流图中分别提取Pro-Lys-Thr(憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的 m/z=609. 8663 的[M+2H]2+和m/z=406. 9140的[M+3H]3+的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+的峰面积之和与 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和的比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为156纳摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 浓度的的线性方程y=0. 9514χ-0. 080式中，y为所述的标准品 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+和[M+3H]3+ 的面积峰之和的比值；x 为标准品Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数r2=0. 99 ；对对照品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪安捷伦RRLC1200SL ；色谱柱安捷伦SB-C18 (3. 0*100毫米，I. 8微米)；流动相水㈧和乙腈⑶；梯度洗脱程序O-1分钟，4%B ; I-5 分钟，4%B_8%B ; 5_ IO 分钟，8%B-10%B ； 10-20分钟，10%B-60%B ；
流速0. 2毫升/分钟；进样量5微升；所述的质谱检测条件质谱仪安捷伦6520;离子源电喷雾电离源(ESI)正离子模式；毛细管电压3500伏特；气体温度350摄氏度； 雾化器温度350摄氏度；干燥气流速9升/分钟；雾化气气压275. 8千帕；锥孔电压65伏特；(5)待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率分别计算对照品、样品中Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和的比值，根据⑷得到的线性方程，求得对照品和样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu浓度，待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率按照以下公式计算I样品=(C对照-C样品)/ C对照X 100%式中，为待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率，C5iw为根据线性方程求得的对照品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu浓度，量纲为微摩尔/升、C#s为根据线性方程求得的样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu浓度，量纲为微摩尔/升。图I为实施例I中I微摩尔/升的标准品磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu (峰I)和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val (峰 2)的总离子流色谱图；图2为实施例I中I微摩尔/升标准品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的提取色谱图；图3为实施例I中I微摩尔/升内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的提取色谱图；图4为实施例I中不同浓度磷酸化十肽Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 标准品的标准曲线；图5为实施例I中6-(苄基氨基)-2 (R) -[ [I-(羟甲基)丙基]氨基]_9_异丙基嘌呤IC5tl (半抑制浓度)拟合曲线图；由图1-5可以计算得到O. 25微摩尔/升6_ (苄基氨基)_2 (R) -[ [I-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为50%。实施例2结合图6说明实施例2(I)缓冲液包括50毫摩尔/升醋酸铵，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调pH值为7. 4 ;(2)标准品的配制用50% 甲醇将憐酸化十妝 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；
样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为10微摩尔/升的人参皂苷Rg1标准品，终浓度为50微摩尔/升的底物Pr0-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在32 °C反应30分钟后，加入50微升的甲醇终止反应，同时加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val,供超高效液相色谱和质谱测定；其余同实施例I。图6为实施例2中样品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱图；按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升人参皂苷Rg1标准品对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为50%。实施例3结合图7说明实施例3(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升醋酸铵，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调pH值为7.4 ;(2)标准品的配制用乙腈将磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；
样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为10微摩尔/升的人参皂苷Rb1标准品，终浓度为50微摩尔/升的底物Pr0-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在37 C反应30分钟后，加入50微升的乙臆终止反应，同时加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val,供超高效液相色谱和质谱测定；
其余同实施例I。图7为实施例3中样品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱图；按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升人参皂苷Rb1标准品对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为29%。实施例4结合图8说明实施例4(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升三氢甲基氨基甲烷盐酸，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调PH值为7. 4 ；(2)标准品的配制用甲醇将磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为10微摩尔/升的人参皂苷Rb2标准品，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在35 C反应40分钟后，加入50微升的乙臆终止反应，同时加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val,供超高效液相色谱和质谱测定；其余同实施例I。图8为实施例4中样品产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu和I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的总离子流色谱按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升人参皂苷Rb2标准品对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为15%。实施例5(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升醋酸铵，0. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调pH值为6.0 ;(2)标准品的配制用水将磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均 含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为10微摩尔/升的人参皂苷Rg3标准品，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足； 对照品和样品在30 C反应30分钟后，分别加入50微升的乙臆终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ；其余同实施例I。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升人参皂苷Rg3标准品对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为10%。实施例6(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升的三氢甲基氨基甲烷盐酸，0. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调节pH值至7. 9 ;(2)标准品的配制用50% 乙臆将憐酸化十妝 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为10微摩尔/升的人参皂苷Rd标准品，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在37 C反应60分钟后，分别加入50微升的乙臆终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ；其余同实施例I。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升人参皂苷Rd标准品对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为13%。 实施例7(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液包括50毫摩尔/升的醋酸铵，0. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁，用盐酸调节pH值至7.2 ;(2)标准品的配制用甲醇将磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为10微摩尔/升的人参皂苷Rg3标准品，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在36 C反应30分钟后，分别加入50微升的乙臆终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ；其余同实施例I。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升人参皂苷Rg3标准品对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率为21%。
权利要求
1.筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)酶促反应缓冲液的配制 缓冲液由三氢甲基氨基甲烷盐酸、ニ硫苏糖醇和氯化镁制成，或由醋酸铵、ニ硫苏糖醇和氯化镁制成，pH值为6-8 ； (2)标准品的配制 将磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标； (3)对照品和样品的酶促反应 对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足； 样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为0. 25-10微摩尔/升的待测物，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pix)-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在30-37 V反应30-60分钟后，分别加入有机溶剂终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸it)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ； (4)标准品、对照品和样品的检测 对标准品进行超高效液相色谱和质谱检測，从总离子流图中分别提取Pro-Lys-Thr(憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+和[M+3H]3+的色谱图，从总离子流图中分别提取 Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+和[M+3H]3+的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和与 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和的比值为纵坐标，得到 Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 浓度的线性方程； 对对照品和样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测； 所述的超高效液相色谱的检测条件 色谱柱安捷伦SB-C183. 0*100毫米，I. 8微米； 流动相水和こ腈； 梯度洗脱程序:0-1分钟，4% ZJ青；1-5分钟，4%-8% ZJ青；5-10分钟，8%_10% ZJ青；10-20 分钟，10%-60% こ腈； 流速0. 2晕升/分钟； 进样量5微升； 所述的质谱检测条件 毛细管电压3500伏特； 气体温度350摄氏度； 雾化器温度350摄氏度；干燥气流速9升/分钟； 雾化气气压275. 8千帕； 锥孔电压65伏特； (5)待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率 分别计算对照品、样品中产物Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的[M+2H]2+ 和[M+3H]3+ 的峰面积之和的比值，根据⑷得到的线性方程中，求得对照品和样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的浓度，计算出待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制 率。
2.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在于，所述的缓冲液的PH值为7.4。
3.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(I)中的缓冲液是由50毫摩尔/升三氢甲基氨基甲烷盐酸，0.5毫摩尔/升ニ硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁和盐酸配制而成的。
4.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(I)中的缓冲液是由50毫摩尔/升的醋酸铵，0. 5毫摩尔/升ニ硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁和盐酸配制而成的。
5.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的标准品溶液是由水、甲醇和こ腈中的一种或两种配制的。
6.根据权利要求5所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在干，所述的步骤⑵中的标准品溶液是由体积比为1:1的水和甲醇配制而成，或由体积比为1:1的水和こ腈配制而成的。
7.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在干，步骤(3)中，所述的对照品和样品在30°C反应30分钟。
8.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在干，步骤(3)中，所述的有机溶剂的体积为50微升。
9.根据权利要求I所述的筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在干，步骤(3)中，所述的有机溶剂为甲醇或こ臆。
全文摘要
筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，解决了现有筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂技术中，荧光法易受干扰，放射法对人体有害、污染环境、成本高的的技术问题，本发明以十肽Pro-Lys-Thr -Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu为底物，细胞周期素依赖性激酶5在30-37℃催化底物生成产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu，用超高效液相色谱和质谱对产物定量，进一步计算出待测物的抑制率，本发明的方法准确、快速，可用于评价细胞周期素依赖性激酶5的催化活性及细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的筛选。
文档编号C12Q1/48GK102796805SQ20121028477
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者刘淑莹, 陈宁, 牛俊, 杨洪梅, 宋凤瑞, 刘志强 申请人:中国科学院长春应用化学研究所