专利名称：一种从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域：
本发明属于生物工程下游产物后处理技术领域，涉及从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，简称PHA)是由细菌合成的一种胞内聚酯，在细菌胞内以内含物形式呈颗粒状存在。PHA所具备的热成塑性，力学性能与目前大量应用的以石油化工原料得到的塑料相似，但PHA具有生物可降解性，被认为是一种“新型生物可降解材料”而倍受重视。PHA存在于细菌体内，成分复杂，提取极其困难。已有的下游后处理提取工艺，或者利用有机溶剂(如氯仿，二氯甲烷等)进行抽提，或者采用高温加热结合使用多种价格昂贵的酶类分解细胞中的非聚羟基脂肪酸酯成分以达到提纯的目的，生产工艺复杂，设备投资高，原料成本昂贵，导致聚羟基脂肪酸酯产品价格过高，使这种大有前途的生物可降解塑料难以推广使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效地从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法，是用五和/或四碳醇中的一种或几种破坏形成聚羟基脂肪酸酯的湿或干细胞菌体的细胞壁并提取聚羟基脂肪酸酯。
所述五或四碳醇为异戊醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、异丁醇、1-丁醇或2-丁醇。
所述菌体细胞与五和/或四碳醇的重量体积份数比(g/ml)为1∶1.5-10。
破壁和提取可以同时进行，也可以先在较低的温度下破壁，然后在较高的温度下提取。当破壁和提取同时进行时，破壁提取是在85℃至溶剂的沸点之间条件下进行的，破壁提取时间为0.5-10小时；当破壁提取分开进行时，所述破壁是在0-85℃之间；提取是在85℃至溶剂的沸点之间条件下进行的，破壁提取时间为0.5-10小时，破壁和提取的时间可以根据具体情况分配。
为了达到分离细胞残渣的目的，加入五和/或四碳醇提取液并搅拌提取后，保持PHA不析出的温度静置至分层，收取上清液得到产品。
为了提高湿细胞中PHA的提取效率，提取前可以对湿细胞用既亲水又亲油的双亲试剂进行预处理。所述双亲试剂为丙酮或乙醇，预处理在0℃至预处理试剂的沸点之间的温度条件下搅拌进行；所述湿细胞与预处理双亲试剂的重量体积份数比(g/ml)为1∶0.1-2。预处理试剂的作用有两点其一是预处理试剂能将细胞的结合水置换出来，将湿细胞周围的水环境转变成有机相环境，以利于五和/或四碳醇破壁提取溶剂能接触到细胞，破壁提取PHA；其二是预处理试剂本身就有脱脂的功能，对细胞壁和细胞膜有一定的破坏作用。预处理后，五和/或四碳醇破壁提取溶剂破壁提取PHA更加容易。
利用本发明的方法自湿细胞中提取PHA的具体步骤是1)细菌发酵生产PHA；2)使用絮凝剂沉淀发酵液中的细胞；3)收集絮凝后的湿细胞；4)预处理湿细胞；5)使用五和/或四碳醇中的一种或几种破坏细胞壁并提取PHA；6)保持PHA不析出的温度分离除去细胞残渣，保留溶有PHA的有机溶剂上清液；7)从上清提取液中冷却析出PHA或用溶剂沉淀出PHA；8)将上清提取液中析出或沉淀出的PHA分离出来；9)洗涤PHA；10)干燥得到PHA产品。
利用本发明的方法自干细胞中提取PHA的具体步骤是1)细菌发酵生产PHA；2)使用絮凝剂沉淀发酵液中的细胞；3)收集絮凝后的湿细胞；4)干燥湿细胞；5)使用五和/或四碳醇中的一种或几种破坏细胞壁并提取PHA；6)保持PHA不析出的温度分离除去细胞残渣，保留溶有PHA的有机溶剂上清液；7)从上清提取液中冷却析出PHA或用溶剂沉淀出PHA；8)将上清提取液中析出或沉淀出的PHA分离出来；9)洗涤PHA；10)干燥得到PHA产品。
在上述自湿细胞和干细胞中提取PHA的具体过程中，先后加入3-20g/L CaCl2，10-65g/L Na2HPO4·12H2O和10-200ppm聚丙烯酰胺进行沉淀；所述用以将PHA从上清提取液中沉淀出来的溶剂有甲醇、乙醇、戊烷、己烷、庚烷和/或辛烷；所述洗涤PHA的试剂为乙醇和/或丙醇。所述收集絮凝后湿细胞及从上清提取液中分离出PHA的方法均为离心或过滤。
五或四碳醇不易挥发，有醇香味，在较高温度下能溶解PHA，较低温度下则使PHA析出，集破坏细胞壁功能和提取PHA功能于一身，使破壁和提取能同时进行。同时在预处理试剂的帮助下，五和/或四碳醇能直接作用于湿细胞。本发明的发明人巧妙地运用了这些有机溶剂的特性，使提取PHA的工艺流程得到了简化，减少了生产设备投资，能耗大大降低，缩短了生产时间，加强了生产过程中的安全性，更加适合工业化大规模生产的要求。所用试剂价格均较低廉，产品纯度及产率均较高，使产品的价格更加易于接受。
具体实施例方式
实施例1使用异戊醇从Aeromonas hydrophila的湿细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(丙酮预处理)菌种Aeromonas hydrophila破壁提取溶剂异戊醇破壁提取温度90℃破壁提取时间4h预处理试剂丙酮具体步骤如下使用细菌Aeromonas hydrophila发酵，培养过程同时以月桂酸和大豆油和/或者花生油为碳源来提高PHA的产率↓发酵结束，发酵液60℃加热搅拌，然后静置30min，待残余碳源充分浮于发酵液表面后除去或者重复使用(残余碳源即是月桂酸和大豆油和/或者花生油)↓量取发酵液总体积↓使用5g/L CaCl2，16g/L Na2HPO4·12H2O和100ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞
↓离心收集湿细胞↓取湿细胞30g↓加入20ml丙酮(bp55-56℃)常温搅拌预处理5分钟↓50℃搅拌预处理5分钟↓加入异戊醇150ml，50℃搅拌30分钟，破壁(50℃防止丙酮挥发，搅拌使异戊醇与细胞充分接触)↓90℃充分搅拌，提取3.5小时↓保温，静置30min分层↓将上清提取液(异戊醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心心集PHA↓乙醇洗涤PHA↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为93％；提取率为81％，其中提取率＝(提取分离得到的PHA质量/细胞中PHA质量)×100％。
实施例2使用异戊醇从Aeromonas hydrophila的湿细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(乙醇预处理)菌种Aeromonas hydrophila破壁提取溶剂异戊醇破壁提取温度130℃破壁提取时间1h预处理试剂乙醇具体步骤如下使用菌株Aeromonas hydrophila发酵↓发酵结束，发酵液60℃加热搅拌，然后静置30min，待残余碳源充分浮于发酵液表面后除去或者重复使用↓量取发酵液总体积↓使用7g/L CaCl2，23g/L Na2HPO4·12H2O和80ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞↓离心收集湿细胞↓取湿细胞30g↓加入50ml乙醇(bp78℃)常温搅拌预处理5分钟↓50℃搅拌预处理5分钟↓加入异戊醇200ml，50℃分钟，破壁↓130℃充分搅拌，提取35分钟↓保温，静置30min分层↓
将上清提取液(异戊醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心收集PHA↓乙醇洗涤PHA↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为95％；提取率为74％。
实施例3使用1-戊醇(正戊醇)从Aeromonas hydrophila的湿细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(丙酮预处理)菌种Aeromonas hydrophila破壁提取溶剂正戊醇破壁提取温度86℃破壁提取时间9h预处理试剂丙酮具体步骤如下使用菌株Aeromonas hydrophila发酵↓发酵结束，发酵液60℃加热搅拌，然后静置30min，待残余碳源充分浮于发酵液表面后除去或者重复使用↓量取发酵液总体积↓使用10g/L CaCl2，32g/L Na2HPO4·12H2O和150ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞↓离心收集湿细胞↓
取湿细胞30g↓加入30ml丙酮(bp55-56℃)常温搅拌预处理5分钟↓加入正戊醇250ml，86℃充分搅拌，破壁提取9小时↓保温，静置30min分层↓将上清取液(正戊醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心收集PHA↓乙醇洗涤PHA↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为80％；提取率为64.5％。
实施例4使用异戊醇和异丁醇的混合物从Aeromonas hydrophila的湿细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(丙酮预处理)菌种Aeromonas hydrophila破壁提取溶剂异戊醇和异丁醇的混合物破壁提取温度95℃破壁提取时间6h预处理试剂丙酮具体步骤如下使用菌株Aeromonas hydrophila发酵↓发酵结束，发酵液60℃加热搅拌，然后静置30min，待残余碳源充分浮于发酵液表面后除去或者重复使用
↓量取发酵液总体积↓使用6g/L CaCl2，19g/L Na2HPO4·12H2O和120ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞↓离心收集湿细胞↓取湿细胞30g↓加入15ml丙酮(bp55-56℃)常温搅拌预处理5分钟↓加入异戊醇和异丁醇的混合物180ml(异戊醇50ml，异丁醇130ml)，45℃搅拌10分钟，95℃充分搅拌，破壁提取6小时↓保温，静置30min分层↓将上清提取液(异戊醇和异丁醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心收集PHA↓乙醇洗涤PHA↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为83％；提取率为78.5％。
实施例5使用异戊醇、2-戊醇和3-戊醇的混合物从Pseudomonas stutzeri的湿细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(丙酮预处理)菌种Pseudomonas stutzeri
破壁提取溶剂异戊醇、2-戊醇和3-戊醇的混合物破壁提取温度90℃破壁提取时间3h预处理试剂丙酮具体步骤如下使用细菌Pseudomonas stutzeri发酵生产PHA↓发酵结束，量取发酵液总体积↓使用5g/L CaCl2，16g/L Na2HPO4·12H2O和100ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞↓离心收集湿细胞↓取用湿细胞30g↓加入20ml丙酮(bp55-56℃)常温搅拌预处理10分钟↓加入异戊醇、2-戊醇和3-戊醇的混合物共130ml(三种有机溶剂体积份数相等)，常温搅拌5分钟↓90℃充分搅拌，破壁提取3小时↓保温，静置30min分层↓将上清提取液(异戊醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心收集PHA↓乙醇洗涤PHA
↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为73.5％；提取率为55.6％。
实施例6、使用异戊醇从Aeromonas hydrophila的湿细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(无预处理)菌种Aeromonas hydrophila破壁提取溶剂异戊醇破壁提取温度90℃破壁提取时间2h具体步骤如下使用细菌Aeromonas hydrophila发酵↓发酵结束，发酵液60℃加热搅拌，然后静置30min，待残余碳源充分浮于发酵液表面后除去或者重复使用↓量取发酵液总体积↓使用8g/L CaCl2，26g/L Na2HPO4·12H2O和100ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞↓离心收集湿细胞↓取湿细胞30g↓加入异戊醇100ml，90℃充分搅拌，破壁提取2小时↓保温，静置30min分层↓
将上清提取液(异戊醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心收集PHA↓乙醇洗涤PHA↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为92％；提取率为68％。
实施例7、使用异戊醇从Aeromonas hydrophila的干细胞菌体中提取聚羟基脂肪酸酯菌种Aeromonas hydrophila破壁提取溶剂异戊醇破壁提取温度90℃破壁提取时间3h具体步骤如下使用细菌Aeromonas hydrophila发酵，培养过程同时以月桂酸和大豆油和/或者花生油为碳源来提高PHA的产率↓发酵结束，发酵液60℃加热搅拌，然后静置30min，待残余碳源充分浮于发酵液表面后除去或者重复使用↓量取发醇液总体积↓使用9g/L CaCl2，29g/L Na2HPO4·12H2O和90ppm聚丙烯酰胺沉淀发酵液中的细胞↓离心收集湿细胞
↓干燥湿细胞↓取用干细胞10g↓加入异戊醇60ml，90℃，破壁提取3小时↓保温，静置30min分层↓将上清提取液(异戊醇)全部倒出↓上清提取液充分冷却析出PHA↓离心收集PHA↓乙醇洗涤PHA↓干燥得到PHA产品结果PHA产品纯度为96％；提取率为91％。
权利要求
1.一种从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法，是用五和/或四碳醇中的一种或几种破坏形成聚羟基脂肪酸酯的湿或干细胞菌体的细胞壁并提取聚羟基脂肪酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述五或四碳醇为异戊醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、异丁醇、1-丁醇或2-丁醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述菌体细胞与五和/或四碳醇的重量体积份数比(g/ml)为1∶1.5-10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述破壁和提取是在85℃至溶剂的沸点之间条件下同时进行的，破壁提取时间为0.5-10小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述破壁是在0-85℃之间；提取是在85℃至溶剂的沸点之间条件下进行的，破壁提取时间为0.5-10小时。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于加入五和/或四碳醇提取液并搅拌提取后，控制温度使PHA不析出，静置至分层，收取上清液分离得到产品。
7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的方法，其特征在于提取湿细胞内的聚羟基脂肪酸酯前，用既亲水又亲油的双亲试剂对湿细胞进行预处理。
8.据权利要求7所述的方法，其特征在于所述双亲试剂为丙酮或乙醇，预处理在0℃至预处理试剂的沸点之间的温度条件下搅拌进行；所述湿细胞与预处理双亲试剂的重量体积份数比(g/ml)为1∶0.1-2。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述自湿细胞中提取聚羟基脂肪酸酯的具体步骤是1)细菌发酵生产PHA；2)使用絮凝剂沉淀发酵液中的细胞；3)收集絮凝后的湿细胞；4)预处理湿细胞；5)使用五和/或四碳醇中的一种或几种破坏细胞壁并提取PHA；6)保持PHA不析出的温度分离除去细胞残渣，保留溶有PHA的有机溶剂上清液；7)从上清提取液中冷却析出PHA或用溶剂沉淀出PHA；8)将上清提取液中析出或沉淀出的PHA分离出来；9)洗涤PHA；10)干燥得到PHA产品。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述自干细胞中提取聚羟基脂肪酸酯的具体步骤是1)细菌发酵生产PHA；2)使用絮凝剂沉淀发酵液中的细胞；3)收集絮凝后的湿细胞；4)干燥湿细胞；5)使用五和/或四碳醇中的一种或几种破坏细胞壁并提取PHA；6)保持PHA不析出的温度分离除去细胞残渣，保留溶有PHA的有机溶剂上清液；7)从上清提取液中冷却析出PHA或用溶剂沉淀出PHA；8)将上清提取液中析出或沉淀出的PHA分离出来；9)洗涤PHA；10)干燥得到PHA产品。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述絮凝沉淀是先后加入3-20g/L CaCl2，10-65g/L Na2HPO4·12H2O和10-200ppm聚丙烯酰胺；所述用以将PHA从上清提取液中沉淀出来的溶剂有甲醇、乙醇、戊烷、己烷、庚烷和/或辛烷；所述洗涤PHA的试剂为乙醇和/或丙醇；所述收集絮凝后湿细胞及从上清提取液中分离出PHA的方法均为离心或过滤。
全文摘要
本发明公开了一种从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法，以便能够有效地从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯。本发明的技术方案是用五和/或四碳醇中的一种或几种自形成聚羟基脂肪酸酯的湿/干细胞菌体破壁提取聚羟基脂肪酸酯。为了提高湿细胞中PHA的提取效率，提取前对湿细胞用既亲水又亲油的双亲试剂进行预处理。本发明的方法使提取PHA的工艺流程得到了简化，减少了生产设备投资，能耗大大降低，缩短了生产时间，加强了生产过程中的安全性，产率提高、成本下降，更加适合工业化大规模生产的要求。
文档编号C08G63/00GK1483824SQ0213072
公开日2004年3月24日 申请日期2002年9月18日 优先权日2002年9月18日
发明者陈国强, 甘智雄 申请人:清华大学