一株能耐受高砷锑污染并氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS-1菌株及其用图
【专利摘要】本发明提供了一株既能耐受高砷锑污染又能氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS?1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016190；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明分离筛选的菌株可以将三价砷氧化为五价砷，极大地降低了环境中砷的危害。本发明的AS?1菌株具有很强的氧化性和适应性，在净化砷污染方面能够发挥重要作用。CCTCC NO：M201619020160411
【专利说明】
一株能耐受高砷锑污染并氧化As (m)的包西氏菌AS-1菌株及 其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种包西氏菌菌株，该菌株可耐受和净化高砷锑污染，属于微生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 砷是一种广泛存在于自然界中的元素。长期暴露会导致一系列疾病，例如皮肤病， 癌症等。无机态的砷是砷元素毒性最大是形式，一般情况下土壤、水体、食物中都含有微量 砷。近期的研究发现，砷的毒性远远大于先前的认知，仅孟加拉国就有7700万人口暴露在含 砷水中。尽管砷以各种形式存在于自然界中，但目前发现毒性最大的是水体中的亚砷酸盐 (H 3As03)以及砷酸盐(H3As〇4)。而三价砷的毒性比五价砷大100倍。
[0003] 锑的毒性和砷相似。三价锑化合物的毒性较五价锑强，吸入后会引起溶血和肝、肾 障碍、肺水肿。锑的毒性和砷相似。三价锑化合物的毒性较五价锑强，吸入后会引起溶血和 肝、肾障碍、肺水肿。世界卫生组织规定:饮用水中锑含量不得超过5ug/L。我国的锑矿储量 位居世界第一，锑产量约占世界总量的79.6%，很多地区由于锑矿开采受到严重污染。
[0004] 目前，针对砷锑污染已经出现了一些治理方法，主要有以下几种：一是化学方法， 比如化学沉淀，此法效果明显，但存在二次污染；二是物理方法，比如物理吸附，此法费用 高，不利于大范围应用;三是植物修复方法，将某些能利用砷的植物种植到污染位点，将砷 富集到植物体内，再收集植物体并妥善处理，但此法不适应处理大面积污染环境。三是微生 物氧化方法，随着很多研究者分离筛选出具有氧化能力的菌种，微生物氧化的使用应运而 生，成为当前热点，但大部分菌株耐受浓度和氧化效率较低。
【发明内容】
[0005] 本发明解决了【背景技术】中的问题，提供了一种能耐受高砷锑污染并氧化AS(m)的 包西氏菌AS-1菌株，该菌株可耐受高浓度砷锑污染，并且能高效的将三价砷氧化为五价砷， 极大地降低了环境中砷的毒性并增强了砷的可吸附去除性，达到对环境净化的效果。
[0006] 本发明人筛选到一株新型砷氧化菌，该菌株被命名为AS-1，属一种包西氏菌 (Bosea sp. AS-1)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学； 邮编430072,保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC N0:M2016190;该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007] 由于三价砷比五价砷的毒性强100倍，而且三价砷不带电荷、具有很强的移动性， 不易被去除，对环境的危害更大;所以提供一种能够针对性氧化处理三价砷的微生物是本 领域急需解决的问题。而本发明分离筛选的菌株可以将三价砷氧化为五价砷，极大地降低 了环境中砷的危害。本发明的AS-1菌株具有很强的氧化性和适应性，在净化砷污染方面能 够发挥重要作用。
【附图说明】
[0008] 图1为Bosea sp.AS-1菌株在2mM/L砷浓度环境下的生长曲线图及氧化率曲线图；
[0009] 图2为Bosea sp.AS-1菌株在5mM/L砷浓度环境下的生长曲线图及氧化率曲线图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局 限于以下实施例。
[0011] 菌株的筛选、分离和鉴定
[0012] 本实施例中从中国湖南省锡矿山砷污染的表层土壤，加一定浓度NaAs02进行富集 培养，再对富集培养的土样进行稀释并涂布含有一定浓度NaAs0 2的MMM固体培养基平板，培 养长出砷抗性菌，挑取不同形态的菌落划线得单菌落，再接种到MMM液体培养基，用KMn〇4法 检测出砷氧化菌，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光（HPLC-HG-AFS)测As(m)和As (V )浓度，并计算氧化率。再对检测出的砷氧化菌做16S核糖RNA基因（16S rDNA)、形态学等 相关鉴定工作，最终得到包西氏菌，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013] 详细技术步骤如下：
[0014] (1)样品采取:2015年7月采取湖南省锡矿山尾矿坝渗滤水附近土壤。
[0015] (2)样品富集：精确称量100g于250ml灭菌锥形瓶中，加2.51111的50〇11^的似48〇 2置 30 °C恒温培养箱中培养一周。
[0016] (3)砷抗性菌分离:精确称量NaAs02富集土样10g于装有90ml无菌生理盐水的锥形 瓶中，置于30°C摇床中振荡0.5h。再依次取lml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至10- 3、10-4、 10-5，分别取〇. lml涂布到含5mM/L的MMM固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置30°C 恒温培养箱中培养三天，长出的菌株为砷抗性菌，将平板置4°C冰箱中待用。MMM固体培养基 配方如下，1L 培养基包括：大量元素：7.568g Na2HP04.7H20，lg KH2P04，lg NH4C1， 0.3gMgS04 · 7H20;酵母提取物lg;微量元素5ml和维生素10ml;5mM As(m)，1.5%的琼脂。 大量元素和琼脂121°C高压灭菌，其它过滤灭菌。
[0017] 1L微量元素包括：50g EDTA，22g ZnS04 · 7H20,5.54g CaC12,5.06g MnC12 · 4H20,4.99g FeS04 · 7H20,l.lg(NH4)6Mo7024 · 4H20,1.57g CuS04 · 5H20 andl.61g CoC12 · 7H20.
[0018] 1L维生素包括：0 · 002g b io t in，0 · 002g fo 1 i c ac i d，0 · 01 gpyr i doxine hydrochloride，0·005g nicotinic acid，0.005g pantothenic acid，0.0001g B12， 0.005g p-aminobenzoic acid?and 0.005g thioctic acid〇
[0019] (4)划线分离:将步骤(3)中得到的砷抗性菌挑取不同菌落划线，确保得到单菌落， 划线用MMM培养基平板，待菌长出后放4 °C冰箱中待用并用甘油冷冻管保存三份于-80 °C冰 箱。
[0020] (5)砷氧化菌筛选:将步骤(4)中得到的砷抗性菌的菌落转接到MMM液体培养基中， 砷浓度为5nM/L，置30°C摇床中振荡培养，待菌长浓后用KMn〇4检测其氧化性。方法如下，取 lml上述培养的MMM菌液到1.5ml离心管中，离心，取上清液到新的离心管中，再加入100μ1 0.01Μ ΚΜη〇4溶液，若ΚΜη〇4由粉红色变为橙色说明没有氧化，若ΚΜη〇4仍为粉红色说明发生 氧化(KMn〇4可以将NaAs〇2氧化为Na3As〇4，菌液中如存在NaAs〇2，则KMn〇4发生变色）。嫌疆液体 培养基配方同MMM固体培养基，只是不含琼脂。
[0021] (6)砷氧化菌的分类鉴定:一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用 引物27F(5 'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3 '）和1492R(5 'GGYTACCTTGTTACGACTT3 '）进行PCR扩增， 扩增其16S rDNA并测序，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi .nlm.nih.gov)核苷酸数据库对 比，核苷酸同源性为99%。鉴定为Shinella sp·;二是革兰氏染色分析。Shinella sp.AS-1 菌学特征如下:杆状;革兰氏阴性;菌落呈圆形，中间凸起，呈乳白色，端生鞭毛，无芽孢。大 小约（0.5~1)μπι x(l .5~2)μπι。三是扩增砷氧化酶基因一aoxB，采用引物M1-2F(5'_ CCACTTCTGCATCGTGGGNTGYGGNTA-3 '）和M3-2R(5 '-TGTCGTTGCCCCAGATGADNCCYTTYTC-3 '）进 行PCR扩增，体系为25ul，其中Ex Taq 12.5ul，Ml-2F lul，M3-2R lul，RNA-free water 8 . 5u 1 , DNA 2ul〇 得至Ijl058-llllbp 的条带，再与国际 NCBI GenBank (www.ncbi .nlm.nih.gov)核苷酸数据库对比，核苷酸同源性为97%，确定为砷氧化酶基因。 上述aoxB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示所示。
[0022] (7)锑耐受检测：由于该菌分离与高砷及锑污染土壤，进一步检测此株菌能否耐受 锑污染环境，通过在MMM培养基中添加酒石酸锑钾(KSbC4H4〇7)发现，Bosea sp.AS-Ι至少可 耐受600mg/L 的 Sb(m)。
[0023]菌株的保藏：
[0024]该菌株可以在MMM固体或液体培养基30°C培养，培养后可在4°C下短期保藏。若长 期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管保藏菌株比较合适。该菌株保藏于中国典型培养 物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072,保藏日期为2016年4月11日，保藏编 号为：CCTCC N0:M2016190。
[0025] 菌株的性能研究：
[0026] 下面给出本发明所提供的包西氏菌AS-1菌株的性能研究结果：
[0027] 1、菌株的生长曲线和三价砷氧化曲线
[0028]挑取菌株接种到lOmlMMM液体培养基，置30°C摇床中震荡培养48h作为种子菌液用 于接种。此时细胞密度〇D6QQ为0.25，保存在4°C冰箱做种子菌液备用。以1 %的接种量吸取 lml菌液到新鲜lOOmlMMM培养基中，As浓度分别为2mM/L、5mM/L，，置30°C摇床中震荡培养， 每隔2小时取一次样，直至A S(m)完全氧化。取lml菌液用分光光度法测细胞密度(OD600)，以 不加菌株的培养基为标准;将2mM/L的菌液稀释2000倍(75yg/l)，5mM/L的菌液稀释5000倍 (75yg/l)后取lml，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)测A S(m)和As (V)浓度。依次绘制生长曲线和氧化曲线图，分别如图1和图2所示，图1中：三价砷浓度为 2mM/L;X轴--时间，取样间隔2h;左轴Y--溶液在600nm波长处的吸光度;右Y轴--三价 砷氧化率(As ( V )/As (总））；图2中：三价砷浓度为5mM/L; X轴--时间，取样间隔2h;左轴 Y--溶液在600nm波长处的吸光度;右Y轴--三价砷氧化率(As( V )/As(总））。
[0029 ] 2、检测包西氏菌AS-1菌株的最大耐受砷浓度
[0030]检测包西氏菌AS-1菌株的最大耐受砷浓度，将细菌分别接种到砷浓度分别为5mM/ L、8mM/L、12mM/L、15mM/L、20mM/L、30mM/L、40mM/L和50mM/L的液体培养基中培养，置30 °C 摇 床中震荡培养，观察到多大浓度后培养基不会浑浊。经试验得到AS-1菌株的最大耐受砷浓 度为1100mg/L，证明本发明提供的AS-1菌株能够耐受高浓度砷。
[0031] 3、检测包西氏菌对三价锑的最大耐受浓度
[0032]检测包西氏菌AS-1菌株的最大耐受锑浓度，将细菌分别接种到锑浓度分别为到三 价砷浓度分别为 1 ΟΟμΜ/L、200yM/L、500yM/L、800yM/L、ImM/L、2mM/L、3mM/L、4mM/L 和 5mM/L 的液体培养基中培养，置30°C摇床中震荡培养，观察到多大浓度后培养基不会浑浊。
[0033] 经试验得到Bosea sp.AS-Ι至少可耐受浓度为600mg/L的三价铺。
【主权项】
1. 一株既能耐受高砷锑污染又能氧化As(m)的包西氏菌(Bosea Sp.)AS-l菌株，该菌 株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为 2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC N0:M2016190,该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1 所示。2. 权利要求1所述包西氏菌AS-1菌株的用途，其特征在于：用于将无机三价砷氧化为无 机五价砷。3. 根据权利要求2所述包西氏菌AS-1菌株的用途，其特征在于:用于处理含砷废水。
【文档编号】C12R1/01GK105936884SQ201610531399
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】鲁小璐, 张旖宁, 王红梅
【申请人】中国地质大学（武汉）