一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，该菌株被命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HH?1，保藏编号为CCTCC M2015640。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌的菌剂及其制备方法，该解淀粉芽孢杆菌菌剂对水稻稻瘟病、立枯病有稳定、高效的防治效果。该解淀粉芽孢杆菌具有广谱抑菌活性，能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。CCTCC M201564020151026
【专利说明】
一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
[0001]
技术领域:本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640及其在水稻立枯病、稻瘟病防治方面的应用。
【背景技术】：
[0002] 水稻是我国主要粮食作物之一，我国大部分地区均有水稻种植，水稻种植农户超 过1亿户，以水稻作为主食的人口占60%以上，大约有19个省（市）以水稻作为主要的食品。 水稻生产在我国粮食生产上具有重要的地位。但是农业用地随着世界人口的增加而减少， 环境也因经济的快速发展而遭到破坏，导致粮食安全问题日益严重。因此，提高水稻的产量 是保证国家粮食生产的重要措施之一。
[0003] 世界性水稻病害一稻痕病[Magnaporthe grisea(Hebert)Barr.]是由子囊菌引起 的植物真菌病害，根据发病时期和发病部位的不同可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗 瘟、谷粒瘟等，其中以叶瘟、穗颈瘟最为常见，危害较大。由于它分布广泛，凡种植地区都有 发生的情况，严重时可造成绝产，它已成为影响我国水稻生产的最主要病害之一，因而对稻 瘟病进行防治具有十分重要的意义。
[0004] 水稻立枯病是水稻旱育秧最主要的病害之一，从出苗到插秧的整个育秧阶段均可 发生，但离乳期发病最重。病苗叶无露珠，新叶或上叶片打绺，根少暗黄无新根，茎基部逐渐 黄枯，软化至腐烂，苗提取时与种子分离。一旦发病很难防治，近几年，东北寒地稻区旱育苗 发生较重，轻者成撮成片发生，重者幼苗全部死亡。
[0005] 目前，化学防治作为水稻病害最主要的防治措施之一，具有见效快、成本低、使用 方便、多病兼治等优点，缺点在于长期以来对其大量、不合理的使用，会导致防效降低，其高 毒、高残留的特性不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水、大气造成严重污染，破坏 生态平衡。
[0006] 随着国家和社会对国民健康、食品安全、环境污染的日益关注，有机磷农药的使用 在各国都受到了不同程度的限制，高效、低毒、低残留的生物农药成为农药产业的主要发展 方向。与化学农药相比，生物农药具有安全、高效、不杀害天敌、环境友好等优点，其不仅可 以替代传统化肥，为植物提供养分，而且具有促生、提高植物抵御不良环境、拮抗病原微生 物从而减少化肥农药使用量等作用，其不可估量的应用价值体现在促进作物增产、预防作 物生物灾害、控制生态可持续、生产无污染无公害的绿色食品及减轻农民负担等方面。生物 农药有着难以替代的优势，拥有巨大的发展空间，是绿色和有机食品生产不可或缺的生产 资料，对促进农业增效和农民增收发挥着不可替代的作用。因此，发展生物农药产业对保障 我国粮食和食品安全、提升我国农产品的国际竞争力具有重要意义。
[0007] 目前，防治水稻稻瘟病、立枯病的有益微生物类群主要有放线菌、真菌、细菌等，目 前用于生物防治的细菌主要有芽孢杆菌和假单胞菌，芽孢杆菌是近年来科研工作者研究的 热点。
[0008] 芽孢杆菌中用于防治水稻稻瘟病、青枯病的种类已经报道的主要有枯草芽孢杆菌 (Baci 1 lus subtilis)、短小芽抱杆菌（Bacillus pumi 1 is)和錯状芽抱杆菌（Baci 1 lus cereus)等。彭化贤等利用水稻根际分离获得的蜡样芽孢杆菌Ma-32和枯草芽孢杆菌Xi-55， 进行田间防效试验，连续两年防效均为50%以上。穆常青等研究发现，芽孢杆菌浓度在IX 108cfu/mL时，对穗颈瘟的防效达57.2 %，增产率达9.6 %。高学文等研究发现，枯草芽孢杆 菌B2菌株产生的胞外物质，对小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长均具有抑制作用。朱桂梅， 陈宏州等，利用短小芽孢杆菌TW-2菌株对水稻穗颈瘟进行防治，结果表明：TW-2不仅对稻瘟 病菌具有强烈的抑制作用，对穗颈瘟的防效也达到80%以上。
[0009] 目前，国内利用解淀粉芽孢杆菌防治稻瘟病、立枯病的研究较少。陈成等研究发 现，解淀粉芽孢杆菌HN-06的代谢产物经分离纯化后，对稻瘟病菌具有显著的抑菌作用。在 已报道的解淀粉芽孢杆菌防治稻瘟病的研究中，对于实验室抑菌效果的研究较多，但对于 田间防治效果、实际生产应用的研究较少。所以，出于本领域中还仍旧存在对水稻稻瘟病、 立枯病具有广谱且高效的防效、能够有效增产的新的解淀粉芽孢杆菌菌株的需要。需要改 进筛选方式，获得大量有益菌，并对菌株的田间防治效果进行充分验证，对其实际生产应用 潜力进行准确评估与大力开发。
【发明内容】
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[0010] 本发明在于克服【背景技术】中存在的问题，而提供一种解淀粉芽孢杆菌。该解淀粉 芽孢杆菌，能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。本发 明还提供一种解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用。
[0011] 本发明解决其问题可通过如下技术方案来达到：一种解淀粉芽孢杆菌，命名为解 淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HH_l，保藏编号为CCTCC M2015640。
[0012] 一种包含解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HH_l的菌剂，其活性成 分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌体及其代谢产物。
[0013] -种解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)菌种的分离:采集水稻根际土壤，从中筛分出一种解淀粉芽孢杆菌HH-1;
[0015] (2)种子液的制备：用接菌环挑取HH-1菌株接入装有LB液体培养基中，37 °C、180r/ min摇床培养36h至培养液中有效活菌数1-2亿/ml。
[0016] (3)固体发酵培养基制备:配制好的固体发酵基与水混合均匀，配制成固体发酵培 养基，将其分装于耐高温的塑料方盒中，121°C灭菌30min，冷却备用。
[0 017 ] (4)固体菌剂培养:按10 %接种量接入预先培养好的HH -1种子液至固体发酵培养 基中，混合均匀后置于37°C培养箱中培养2天。
[0018] (5)干燥、粉碎及包装:将上述发酵完的固体培养物置于55°C烘箱中烘至含水率低 于10%，粉碎过筛后，制备成固体粉末状菌剂。
[0019] 本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用。
[0020] 本发明菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HH_l，保藏在中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015640，保藏日期为2015年10月26日。保藏地址 在中国武汉，武汉大学。
[0021] 本发明解淀粉芽孢杆菌株HH-1形态特征是:菌落淡黄色、形状为规则圆形、表面隆 起、干燥;细胞为杆状、产芽孢。
[0022] 本发明解淀粉芽孢杆（Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640生化特性 是:可利用葡萄糖，蔗糖、L-阿拉伯胶、D-木糖、淀粉、乳糖、柠檬酸三钠;不能利用甘油。
[0023] 本发明解淀粉芽孢杆（Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640生长特性 是:在LB平板上划线接种，分别在37°C至45°C下培养均生长良好，在50°C下能够生长。
[0024] 本发明菌株是直接依据实验室离体叶片防效测定结果筛选获得，并经过连续2年 不同地点不同水稻品种的田间防效验证，其田间防效稳定，具有较高的实际应用潜力。
[0025] 本发明与上述【背景技术】相比较可具有如下有益效果：该解淀粉芽孢杆菌，其菌株 是从水稻根际土壤筛选获得，为革兰氏阳性菌，具有广谱抑菌活性，能在真菌性病原菌丝体 表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。本发明的解淀粉芽孢杆菌菌剂对水稻稻 瘟病、立枯病具有更高效的防治作用，且持效期较长，增产效果明显。
【具体实施方式】：
[0026] 下面结合具体的实施例将对本发明作进一步说明：
[0027] 实施例1:解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株 的分离
[0028] 解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株的分离：从 哈尔滨市方正林业局采集水稻农田土壤样品，称取土壤5g放入装有200mL无菌水的三角烧 瓶中，加入玻璃珠，置于30°C摇床中250rpm震荡摇晃30min，使土样与水充分混合。静置待上 层澄清后，取10mL上清液，进行10、100、1000倍稀释，取最后三支土样稀释液，置于80°C水浴 5-7min后，灭活营养细胞，保留芽孢。然后取稀释液O.lmL涂布于LB固体培养基平板上，每个 梯度浓度涂布3个平板，在37°C培养2d后，依据解淀粉芽孢杆菌的主要生物学特征挑取菌落 进行个别单独纯化培养。最终获得一株对稻瘟病菌、立枯丝核菌拮抗能力较好的菌株，即解 淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 〇
[0029] 该菌株于2015年10月26日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为 CCTCC M2015640。
[0030]上述LB固体培养基的配方为，每升蒸馏水含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，lOgNaCl，固 体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为2%的琼脂粉，121°C条件下灭菌20分 钟。
[0031] 实施例2:解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株 的鉴定
[0032] 上述解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株 16S rDNA基因的提取。
[0033] 培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml培养物，6000转/每分钟离心2分钟;沉 淀物加入565μ1的TE缓冲液，TE缓冲液配方如下：10mmol/l的三羟甲基氨基甲烷（Tris)、 lmmol/1的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μ1 质量体积比为10 %的十二烷基磺酸钠（SDS)和5μ1 20mg/mL的蛋白酶Κ，混匀，于37 °C温育1 小时；加入1〇〇μ1，5mo 1/1 NaCl，充分混匀，再加入80μ1的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶 液配方如下：质量体积比为10 %的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mo 1 /1的NaC 1 中，混匀，于65°C温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000转/每分钟离心5分 钟，将上清液转入一个新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000转/每分钟离心5 分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个 封口的离心管将沉淀转移至lml的70 %乙醇中洗涤；12000转/每分钟离心5分钟，弃上清，用 冻干机稍加干燥，重溶于50μ1的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海博尚 生物技术有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μ1反应体系依次混匀下列 试剂：35μ1 Η20,5μ1 10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下： 500mmol/L 的 KCl、30mmol/L 的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L 的用盐酸调整pH为8.8 的Tris 缓 冲液、lmg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2,4yl 25mmol/l MgCl2，lyl 4种dNTP的混合 物，0.5μ1上游引物，0.5μ1下游引物，0.5μ1模板DNA即上述红平红球菌（Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的基因组DNA，0.5yl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。加 入50μ1矿物油再离心5秒钟;将混合物在94°C加热5分钟。94°C变性1分钟，50°C退火1分钟， 72°C延伸2分钟，总共30个循环。最后一个循环后，于72°C下保温10分钟，使反应混合物扩增 充分，得到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640的 16S rDNA的 PCR扩增产物，将产物测序，将测得的菌的基因序列提交到GenBank数据库中，用Blsat进行 相关序列搜索，与GenBank数据库中现有的近缘菌株的ITS序列进行对比，并从数据库中获 得相关序列。
[0034] 测序结果：解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640 16S rDNA基因序列长度为1441bp。
[0035] 解淀粉芽孢杆菌株的生理生化实验测定，结果见表1。根据16S rDNA序列分析结果 和生理生化实验测定结果，可判断CCTCC M2015640菌为解淀粉芽孢杆菌。
[0036]表1解淀粉芽孢杆菌株HH-1的生理生化实验结果
[0038]该菌株已于2015年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015640，分类命名为解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0039] 实施例3:解淀粉芽孢杆菌株固态菌剂的制备方法
[0040] 按如下步骤进行：
[00411 (1)菌种活化：用接种环挑取CCTCC M2015640菌种，将其接种到LB斜面培养基上， 置于37 °C恒温培养箱中培养。
[0042] (2)种子液的制备:挑取活化后的CCTCC M2015640菌株接入装有100mL的LB液体培 养基中，37°C、180r/min摇床培养24h备用.
[0043] (3)固体发酵培养基制备：固体发酵基（玉米粉20 %、麸皮20 %，米糠40 %，菜籽柏 20%，按料:水= 1:1混合均匀，配制成固体发酵培养基，将其分装于耐高温的塑料方盒中， 120°C灭菌30min，冷却备用。
[0044] (4)固态菌剂培养:按10%接种量接入预先培养好的CCTCC M2015640种子液至固 体发酵培养基中，混合均勾后置于37 °C培养箱中培养2天，每隔12h搅拌一次。
[0045] (5)干燥、粉碎及包装:将上述发酵完的固体培养物置于55°C烘箱中烘至含水率低 于10%，用粉碎机将其粉碎。过筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置 于干燥、阴凉处保藏。
[0046] (6)采用稀释平板测数法检测样品中芽孢杆菌的活菌数的浓度在2.0 X108cfu/ mL，符合农用微生物菌剂的要求。
[0047]实施例4:解淀粉芽孢杆菌株M2015640菌剂促进植物生长抗病田间效果试验 [0048] 1.试验地点:试验在黑龙江省大庆市进行，选择地势平坦，肥力一致的田块。
[0049] 2 ·供试作物:水稻(垦稻12)
[0050] 3 .供试肥料:本发明实施例3中制备的微生物菌剂，含有效活菌数2.0 X 108cfu/ mL〇
[0051 ] 4.试验设计：试验设两组处理，每组设有1个对照组（1组加入CCTCC M2015640菌 剂，用M2015640表示;第2组加入相同量的未接菌株的培养基，用CK表示），每个处理三次重 复。小区随机排列，小区面积24m2(4mX6m)，行株距25cmX 15cm，每亩1.8万穴，每穴4株，基 本苗7.2万苗，小区四周打埂，埂宽50cm，上覆薄膜，防止窜水窜肥，区组间挖沟，沟宽lm，试 验四周设保护行。各处理组设计如下：
[0052]处理一:在育苗期间水稻1叶1心时撒施本菌剂，并接种立枯病菌;CK组只接种立枯 病菌。药后7d、15d、25d采用5点取样法调查各小区的病株数，每小区调查500株，计算病株率 及防病效果。
[0053]处理二：用常规的栽培方式进行肥水管理，水稻剑叶抽出前7天接种稻瘟病菌，随 后立即进行第一次撒施本菌剂。到水稻剑叶抽出裂口期是进行第二次撒施。CK组只接种稻 瘟病菌。一次施药前调查，一次施药后二次施药前调查，二次施药后调查，田间测产及室内 考种。调查方法为每小区取5点，每点定1穴，做好标记，防治叶瘟，施药前调查发病基数，二 次施药前和二次施药后10天调查防效;二次施药后10天及田间测产调查穗颈瘟发病指数。 [0054]试验结果表明，施撒本菌剂对水稻立枯病有较好的防效，且持效期较长。试验结果 参见表2。
[0055] 表2M2015640菌剂对水稻立枯病防效效果 [0056]
[0057] 经药后定期观察，各处理药剂对旱育秧无药害出现。
[0058]试验结果表明，施撒本菌剂对水稻稻瘟病有较好的防效，每亩施用10g该产品，对 水稻叶瘟防治效果一般，对水稻穗颈瘟防效达94.9%，较对照空白增产69%，其产量指标穗 实粒数、千粒数和结实率明显高于空白，表现为防效好、增产效果明显。试验结果参见表3、 表4。
[0059]表3本发明菌剂对水稻稻瘟病防效效果
[0061 ] 表4测产考种表
[0062]
[0063]该药剂对作物无明显药害症状，对水稻生长安全。在水稻剑叶抽出前7天和剑叶抽 出裂口期进行茎叶喷雾，可有效预防水稻穗颈瘟，可作为预防类药剂大面积推广。
【主权项】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：命名为解淀粉芽孢杆菌 即e/acieas)HH-l，保藏编号为CCTCC M2015640。2. -种包含如权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂，其特征在于:其活性成分为 解淀粉芽孢杆菌(ifeciDus a野ciaos)菌体及其代谢产物。3. 根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂，其特征在于：所述的菌剂为固态菌 剂。4. 一种如权利要求2或3所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制备方法，其特征在于:包括 如下步骤： (1) 菌种的分离:采集水稻根际土壤，从中筛分出一种解淀粉芽孢杆菌HH-1; (2) 种子液的制备：用接菌环挑取HH-1菌株接入装有LB液体培养基中，37°C、180r/min 摇床培养36h至培养液中有效活菌数1-2亿/ml; (3) 固体发酵培养基制备：配制好的固体发酵基与水混合均匀，配制成固体发酵培养 基，将其分装于耐高温的塑料方盒中，121°C灭菌30min，冷却备用； (4 )固体菌剂培养:按10%接种量接入预先培养好的HH-1种子液至固体发酵培养基中， 混合均匀后置于37°C培养箱中培养2天； (5)干燥、粉碎及包装：将上述发酵完的固体培养物置于55°C烘箱中烘至含水率低于 10%，粉碎过筛后，制备成固体粉末状菌剂。5. 根据权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制备方法，其特征在于:所述的固体发 酵基为玉米粉20%、麸皮20%，米糠40%，菜籽柏20%。6. -种如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用。7. 根据权利要求6所述解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用，其特征在于:所述的 水稻病害包括水稻立枯病、稻痕病。
【文档编号】A01N63/00GK105936880SQ201610333633
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】胡翌
【申请人】哈尔滨亿之隆生物科技开发有限公司