一株空间少动鞘氨醇单胞菌株lct-sp1的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株从“神舟十号”返回舱冷凝水中分离得到菌株少动鞘氨醇单胞菌株LCT?SP1，为棒状的革兰氏阴性菌，可利用葡萄糖、岩藻糖、苹果酸、乙酸和吐温?40等多种碳源。对该菌进行16S rRNA测序，鉴定其为鞘氨醇单胞菌属成员。对该菌进行了全基因组测序，发现该菌基因组大小为4.3 Mbp，包括3864个编码序列和50个RNA基因，COG数据库比对共注释到21组COG功能分类。此专利对研究密闭飞行器内微生物种类分布等提供了一定帮助。CGMCC 1256920160601
【专利说明】
一株空间少动鞘氨醇单胞菌株LCT-SP1
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域;更具体地讲，本发明涉及一株空间环境下分离菌少动 鞘氨醇单胞菌LCT-SP1及其生物学特性、全基因组学测序。
【背景技术】
[0002] 从登月成功到未来的火星探索，随着航天技术的发展，人类探索外太空的活动不 仅越来越频繁，其范围也越来越大。微生物是自然环境中的一部分，很多细菌也存在于人类 皮肤、口腔、鼻咽部和胃肠道等部位。尽管载人飞船及内部物品等都经过严格的真空消毒， 然而载人航天器密闭环境条件下仍然容易滋生细菌、真菌，甚至病毒等微生物，这些微生物 能在密闭舱室内的金属、高分子复合材料等表面形成生物膜，它们的生长繁殖和代谢会对 材料产生腐蚀，严重威胁空间站的长期在轨运行安全，缩短空间站的服役时间，研究密闭航 天器内的微生物种类对于航天器内微生物的安全防护具有重要的意义；另外，有研究发现 在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增强。目前，在空间站中 已检测出包括肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙雷氏菌、蜡状 芽孢杆菌和肠球菌等多种细菌。因此，对这些细菌进行深入研究有助于了解空间环境对这 些细菌的影响极其致病力和耐药性的改变机制，为载人航天提供医学保障。
[0003] 早期对许多环境微生物的认识仅来自于对16S rRNA的研究，一些重要的遗传信息 很难获得。现在越来越多的新的培养和分子生物学方法，例如基因组学、蛋白质组学、宏基 因组学等，被用来研究新获得微生物的潜在特征和功能等。同时随着测序技术的更新换代 和高通量测序技术的出现，细菌基因组的测序成本和所需时间已大幅度降低。
【发明内容】
[0004] 本发明的菌株少动鞘氨醇单胞菌LCT-SP1为"神舟十号"返回舱冷凝水中分离得 到下行菌株。本发明提供的少动鞘氨醇单胞菌LCT-SP1菌株，其保藏号为CGMCC 12569。
[0005] 菌株LCT-SP1可在MH固体平板上形成黄色、表面光滑且边缘整齐的菌落，专性需 氧，为革兰氏阴性菌。菌体呈棒状，分散排布，表面没有鞭毛、菌毛等结构。LCT-SP1菌株可利 用多种碳源，包括D-葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、岩藻糖、苹果酸、乙酸和吐温-40等。对头孢 类、喹诺酮类和青霉素类等抗生素敏感。
[0006] 所述的菌株LCT-SP1菌株，进行全基因组测序并进行分析，发现该菌基因组大小为 4.3 Mbp，包括3864个编码序列和50个RNA基因，C0G数据库比对共注释到21组⑶G功能分 类(表1和2)。
[0007] 表1 LCT-SP1菌株基因特征。
【附图说明】
[0009] 图1菌株LCT-SP1培养ΜΗ平板。
[0010] 图2菌株LCT-SP1的16S rRNA基因序列NJ系统发育树。
[0011] 图3菌株LCT-SP1的革兰氏染色。
[0012]图4菌株LCT-SP1的电子显微镜观察。
[0013] 图5-6菌株LCT-SP1的基因组测序、组装及注释。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0016] 下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0017] 实施实例一:菌株LCT-SP1培养。
[0018] 菌株少动鞘氨醇单胞菌LCT-SP1为"神舟十号"飞船的返回舱内冷凝水分离得到。 菌株分别于37°C培养箱或摇床中进行静置或振荡培养，液体培养基为脑心浸出液培养基 0!11，(^ 〇(1)，配方为37 8/18!11;固体培养基为腿平板（图1)。
[0019]实施实例二:菌株LCT-SP1菌种鉴定及系统发育树构建。
[0020] 少动鞘氨醇单胞菌LCT-SP1接种至BHI液体培养基，37°C，180 rpm过夜培养，6000 rpm离心5 min收集菌体，弃上清。利用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒（Code No. 51304，详细步骤见产品说明书）提取收集的菌体的基因组DNA。以LCT-SP1的基因组DNA为 模板，利用细菌16s rRNA通用测序引物27F(5'_ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R(5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增其 16s rRNA片段并测序，得到其碱基序 列。用 CLUSTALW(http: //www. ebi .ac · uk/Tools/msa/clustalw2/)进行多序列比对，并用 MEGA 5.0构建NJ系统发育树（图2)。
[0021]实施实例三:菌株LCT-SP1的革兰氏染色。
[0022] 采用革兰氏染色试剂盒(Code No. G1060，Solarbio)对LCT-SP1菌体进行染色。 BHI液体培养基过夜培养菌体，将菌液滴于载玻片中央，在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 结晶紫、沙黄染色液对干燥菌体一次染色脱色，详细步骤见产品说明书。染色完成并晾干 后，置于光学显微镜下观察染色情况（图3)。
[0023]实施实例四：菌株LCT-SP1的扫描电子显微镜观察。
[0024]在扫描电子显微镜（SEM)下观察菌体形态。首先用2.5%戊二醛、PBS缓冲液以及1% 锇酸清洗菌体，乙醇梯度脱水并乙酸异戊酯置换，样品干燥后做喷金处理，处理好的样品置 于FEI Quanta 200型扫描电镜下观察（图4)。
[0025]实施实例五:菌株LCT-SP1的基因组测序、组装及注释。
[0026] 基因组DNA样品委托美吉生物有限公司进行全基因组序列测定、基因预测、基因功 能注释、非编码RNA预测等工作，序列分析工作委托美吉生物有限公司和上海瀚宇生物科技 有限公司共同完成。基因组DNA提取后进行质量鉴定，在浓度和纯度达到测序要求后进行 全基因组测序。利用Covaris进行基因组DNA片段化，构建插入片段约300-500 bp的基因组 测序文库，通过桥式PCR扩增得到DNA簇，然后采用11 lumina HiSeq2000测序技术完成该菌 株的基因组扫描测序，获得约1 Gb的原始测序数据。Illumina HiSeq2000测序得到的原 始图像数据经过Base Calling转化为序列数据，结果以FASTQ文件格式来存储，包含测序 read的序列信息以及测序质量信息；原始数据经过预处理去除接头、引物及低质量数据 后，利用SOAPdenovo (http: //soa p · genomics · org · cn/)拼接软件对优化序列进行多个 Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果，并运用GapCloser软件对组装结果进行局部内洞 填充和碱基校正;分别利用RNAmmer和tRNAscan-SE软件对基因组中包含的rRNA和tRNA 进行预测；利用Glimmer 3·0( http://www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/)软件进行基 因预测;利用各种数据库进行基因功能注释和分类(图5、6)。
[0027] 关于保藏的LCT-SP1菌株的说明 A. 菌种的保藏单位名称和地址 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 B. 交机构保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏机构给予的保藏号 CGMCC 12569 D. 分类命名 少动鞘氨醇单胞菌 Sphingomonas paucimobilis〇
【主权项】
1. 一株从"神舟十号"飞船返回舱冷凝水中分离得到下行菌株空间少动鞘氨醇单胞菌 株 LCT-SP1，其保藏号为 CGMCC 12569。2. 根据权利要求1所述的一株从"神舟十号"返回舱冷凝水中分离得到空间少动鞘氨醇 单胞菌株LCT-SP1，其特征在于：为棒状的革兰氏阴性菌，可利用葡萄糖、岩藻糖、苹果酸、 乙酸和吐温-40等多种碳源。3. 根据权利要求1所述的一株从"神舟十号"返回舱冷凝水中分离得到空间少动鞘氨醇 单胞菌株LCT-SP1，进行全基因组测序并进行分析。
【文档编号】C12N1/20GK105936883SQ201610456291
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】刘长庭, 潘磊, 张学林, 姜学革, 刘岩, 郭英华, 周宏 , 徐绸, 李佳, 黄兵, 余昳
【申请人】中国人民解放军总医院