专利名称：一种二氢鞘氨醇羟化酶基因及编码的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物次生物质代谢技术领域。具体的说，本发明涉及一种涉及产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母二氢鞘氨醇羟化酶基因的克隆及编码的多肽技术领域。
背景技术：
麻黄碱(Ι-ephedrine)和伪麻黄碱(d-pseudo-印hedrine)是麻黄植物中生物碱类次生代谢产物，具有重要的药用价值。麻黄碱和伪麻黄碱的生物合成由多基因控制，其代谢途径的相关基因没有任何相关信息，因此长久以来麻黄碱工业化生产主要依靠从天然植物麻黄中直接提取与化学合成两种方法。二氢鞘氨醇羟化酶(sphingosine hydroxylase，简称SUM)是真核生物中可将二氢鞘氨醇C4位羟基化催化产生植物鞘氨醇的酶。鞘氨醇作为真核细胞内的脂类信号分子， 参与细胞内多种生理过程的信号传导过程；参与脂质代谢途径与真核生物细胞膜的合成相关，有维持细胞膜完整性的作用，并参与氨基酸的转运和作为细胞膜上蛋白质的锚定位点等作用。目前二氢鞘氨醇羟化酶仅用于真核生物细胞膜合成以及细胞内信号物质传导的研究。随着生物技术和酶工业的发展，为获得重组酵母菌合成麻黄碱时高表达二氢鞘氨醇羟化酶基因片段打好技术基础。
发明内容
鉴于采用SSH技术分离获得多条重组酵母菌合成麻黄碱时差异表达基因片段，其中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段参与酵母麻黄碱生物合成代谢途径的调控。因此， 本发明旨在提供一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段序列和编码多肽序列，以应用于麻黄碱次生代谢途径的研究，为麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中的整合、表达以及调控研究奠定基础，也为二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的相关研究领域提供新的基因资源。本发明的技术方案通过利用产麻黄碱的转基因重组酵母是新疆大学利用离子束介导野生蓝麻黄基因组DNA在异常汉逊酵母中的随机转化获得重组酵母菌，相关方法和重组菌种已获国家发明专利授权(专利号ZL 200610011402.7)。以出发菌株异常汉逊酵母2. 340和重组酵母CGMCC No. 1499为研究材料，采用抑制差减杂交技术(suppression subtraction hybridization, SSH)获得重组酵母生物合成麻黄碱时差异表达二氢鞘氨醇羟化酶基因片段，获得二氢鞘氨醇羟化酶基因片段片段长438bp，通过美国国立生物技术信息中心序列相似性搜索程序(NCBI Blast)的核酸序列分析，表明与数据库中仅有的Pichia ciferrii 二氢鞘氨醇羟化酶基因同源部分相似性为88%。由此证明从产麻黄碱重组酵母中分离的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段是一个新的二氢鞘氨醇羟化酶基因。具体的，本发明提供了一种二氢鞘氨醇羟化酶基因的碱基序列全长为438bp，其编码由序列表中SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列中101个氨基酸组成的蛋白质。同时，本发明提供了一种二氢鞘氨醇羟化酶基因片断的获得方法，所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因SUR2是来源于产麻黄碱的转基因重组酵母CGMCCNo. 1499，通过SSH实验获得。具体包括如下步骤1.采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedra glauca L.)基因组DNA 在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选， 获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499。2.将出发菌株和转基因酵母菌分别从斜面分别转接入液体培养基，置摇床230r/ minJ8°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体。采用Takara RNAisoReagent对酵母总RNA进行提取，用的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计估计其纯度及浓度。以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，采用Clontech公司的PCR-klectTMcDNA Subtraction Kit和SMART PCRcDNA Synthesis Kit进行抑制差减杂交实验。将第二次 PCR的产物与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞，进行蓝白斑筛选，构建转基因酵母的差减文库。对差减文库中的重组子进行PCR鉴定，将鉴定后的重组子进行测序，测序获得一段438bp的基因片段，该基因片段包含一段ployA的特征序列，证明通过SSH实验分离的基因片段为该基因的3'端序列。测序结果用BLASTn程序在 GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，确定该基因片段为二氢鞘氨醇羟化酶基因。进一步，本发明提供了一种二氢鞘氨醇羟化酶，该二氢鞘氨醇羟化酶蛋白质的碱基序列和SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列，其来源于产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果1.本发明提供了一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因序列和编码多肽序列，该二氢鞘氨醇羟化酶基因的碱基序列全长438bp，其编码由序列表中SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列中101个氨基酸组成的多肽。2.本发明提供的一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因及其二氢鞘氨醇羟化酶应用于麻黄碱次生代谢途径的研究，为麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中的整合、表达以及调控研究奠定基础，也为二氢鞘氨醇羟化酶基因的相关研究领域提供新的基因资源。
图1所示为利用抑制差减杂交技术获得的差异基因表达片段电泳结果图，其中，M 为DNA分子量标准DL2000，1为二氢鞘氨醇基因片段。图2所示为在发菌株和转基因菌株中鉴定二氢鞘氨醇羟化酶基因片段电泳结果图，M为λ-EcoTH I digest DNA Marker，1为从出发菌株内扩增出的二氢鞘氨醇片段，2 为从转基因酵母内扩增出的二氢鞘氨醇片段。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有主要试齐[J =Takara 公司 rTaq DNA 聚合酶，RNAiso Reagent, Clontech 公司PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit，Axygen 公司胶回收试剂盒，Promega公司pGEM-Τ克隆载体，主要仪器IBB Device 1多功能离子注入机，Sigma 3-18K离心机，UV-7M分光光度计，TC-512PCR 仪。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一1.采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedra glauca L.)基因组DNA 在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选， 获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499。2.将出发菌株和转基因酵母菌分别从斜面分别转接入液体培养基，置摇床230r/ minJ8°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体。采用Takara RNAisoReagent对酵母总RNA 进行提取，用的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计估计其纯度及浓度。以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，采用Clontech公司的PCRIelectTM cDNA Subtraction Kit 和 SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit 进行抑制差减杂交实验。将第二次PCR的产物与pGEM-TCasy载体连接，连接产物转大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞， 进行蓝白斑筛选，构建转基因酵母的差减文库。对差减文库中的重组子进行PCR鉴定，将鉴定后的重组子进行测序，测序获得一段438bp的基因片段。测序结果用BLASTn程序在 GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，确定该基因片段为二氢鞘氨醇羟化酶基因。根据得到的基因核苷酸序列，并推测出该基因编码蛋白质的氨基酸序列，参见序列表SEQUENCE LISTING。实施例二 1.菌株培养和总RNA的提取将出发菌株和转基因酵母菌CGMCC No. 1499分别从斜面分别转接入液体培养基， 置摇床230r/min、28°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体。采用Takara RNAiso Reagent对酵母总RNA进行提取，按试剂盒说明书进行。用的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计估计其纯度及浓度。2.采用抑制差减杂交技术(SSH)获得重组酵母菌中二氢鞘氨醇羟化酶基因片段以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，采用Clontech公司的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit 进行抑制差减杂交实验。根据紫外分光光度计测定值所计算的RNA浓度，分别将提取的转基因酵母和出发菌株总RNA用RNA-free water稀释成1 μ g/ μ L，按试剂盒说明书分别合成转基因酵母和出发菌株单链cDNA。将转基因酵母和出发菌株单链cDNA分别合成为双链cDNA，平行做3个样品(实验组和驱动组，另外多做一个样品)，在进行到15个循环时，取出实验组和驱动组PCR样品存放在4°C，并从另外的样品中取出15 μ L留作检测，以后每隔3个循环取样一次，直到M 个循环结束。对取出的样品进行的琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳循环数。将实验组和驱动组样品重新放入PCR仪中，补充循环次数到最佳循环数，实验所得最佳循环数为18。 循环结束后，加入2μ L 0. 5Μ EDTA终止反应。
将获得的双链cDNA用氯仿-异戊醇04 1)纯化2次，4M醋酸铵溶液和300 μ L 95%的乙醇沉淀双链cDNA，80%的乙醇洗涤干燥后用于Rsa I酶切。双链cDNA的Rsa I 37°C水浴酶切1. 后，用的琼脂糖凝胶电泳进行酶切效率的检测。检测后对酶切样品进行苯酚-氯仿-异戊醇05 24 1)纯化，80%的乙醇洗涤沉淀后干燥进行接头连接 (只对实验组进行接头的连接)。分别吸取转基因酵母双链cDNA Rsa I酶切纯化产物各 2 μ L，分别加入不同的接头"Γ4 DNA LigaSel6°C水浴过夜连接，连接产物加入IyL EDTA/ Glycogen终止反应，并72°C水浴5min失活连接酶。向带有不同接头经Rsa I酶切转基因酵母双链cDNA中加入1. 5 μ L驱动组cDNA (经Rsa I酶切)，PCR仪中68°C 8h进行第一次杂交，将第一次杂交的两个样品混合，并立即加入从PCR仪中取出的新变性的驱动组cDNA， 离心混勻，68°C过夜进行第二次杂交，杂交结束后加入400 μ L dilutionbuffer，混勻后，于 PCR仪中68°C加热7min备用。将经过差减杂交的稀释cDNA进行第一次PCR反应，反应结束后将第一次PCR产物稀释10倍，作为第二次PCR的模板进行PCR反应，取8 μ L进行2. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，条带呈现弥散状。按Axygen回收试剂盒说明书对SSH-PCR产物进行回收，回收产物溶解于10 μ L的无菌水中，再按!Iomega公司的pGEM_T Easy载体说明书将回收产物与T-载体16°C连接过夜，连接产物转大肠杆菌感受态细胞进行蓝白斑筛选。对筛选获得的白斑用碱法提取其质粒DNA进行重组子的PCR鉴定，反应结束后，取5 μ L进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，参见附图1。将获得基因片段测序并将序列信息进行Blast同源比对，分别用BLASTn和BLASTx 程序将测序结果片段的碱基序列在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，初步确定该基因片段为二氢鞘氨醇羟化酶基因。实施例三菌株液体培养和麻黄碱含量测定将出发菌株和转基因酵母菌CGMCC No. 1499分别从斜面分别转接入液体培养基， 置摇床230r/min、28°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体以及发酵液。采用反向高效液相对转基因酵母菌发酵液当中的1-麻黄碱含量进行测定，测定结果为11.87mg/L，出发菌株发酵液中不含ι-麻黄碱。实施例四采用抑制差减杂交技术(SSH)获得重组酵母菌中二氢鞘氨醇羟化酶基因片段采用Takara RNAiso Reagent对出发菌株和转基因酵母酵母总RNA进行提取，以转基因酵母总RNA为实验组，出发菌株总RNA为驱动组，采用Clontech公司的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit 进行抑制差减杂交实验。根据紫外分光光度计测定值所计算的RNA浓度，分别将提取的转基因酵母和出发菌株总 RNA 用 RNA-free water 稀释成 1 μ g/ μ L。按试剂盒说明书分别合成转基因酵母和出发菌株单链cDNA。将转基因酵母和出发菌株单链cDNA分别合成为双链cDNA，实验所得最佳循环数为18。将获得的双链cDNA进行纯化，用Rsa I进行酶切，酶切后对实验组进行接头的连接，向带有不同接头经Rsa I酶切转基因酵母双链cDNA中加入过量驱动组cDNA(经RsaI酶切)进行第一次杂交，第一次杂交后混合带有不同接头的两个样品，并立即加入过量的新变性驱动组cDNA，进行第二次杂交。将经过差减杂交的稀释cDNA进行两次的抑制PCR反应，最后将第二次抑制PCR的产物回收，并与PGEM-T Easy载体连接，构建了转基因重组酵母菌的质粒差减文库。由于两次杂交均加入的是过量驱动组cDNA，因此杂交过后只有转基因酵母中特异表达基因和高表达基因才可以最大程度的形成带有不同接头的双链cDNA，在随后的抑制 PCR中得以指数级的富集。将获得基因片段测序并将序列信息进行Blast同源比对，用BLASTn程序将测序结果片段的碱基序列在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，初步确定该基因片段为二氢鞘氨醇羟化酶基因，二氢鞘氨醇羟化酶基因的碱基序列全长为438bp，其编码由序列表中SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列中101个氨基酸组成的蛋白质。实施例五二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的鉴定将出发菌株和转基因酵母菌CGMCC No. 1499分别从斜面分别转接入液体培养基， 置摇床230r/min、28°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体，采用TakaraRNAiso Reagent对出发菌株和转基因酵母酵母总RNA进行提取，并用ployA引物进行反转录。反转录结束后， 用利用该片段设计的特异性引物进行PCR反应，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，参见附图2，结果显示出发菌株和转基因菌株均扩增出相同大小的片段，表明该片段为出发菌株内源基因，但在转基因酵母分泌表达麻黄碱时高表达。
权利要求
1.一种二氢鞘氨醇羟化酶基因，其特征在于，所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的碱基序列全长为438bp，其编码由序列表中SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列中101个氨基酸组成的蛋白质。
2.一种如权利要求1所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因的获得方法，所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因是来源于产麻黄碱的转基因重组酵母CGMCC No. 1499，通过SSH实验获得，其特征在于，具体包括如下步骤(1)采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedraglauca L.)基因组DNA在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选，获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499 ；(2)将出发菌株和转基因酵母菌分别从斜面分别转接入液体培养基，置摇床230r/ min,28 "C 30 "C培养72h，离心分别收集菌体；采用Takara RNAisoReagent对酵母总RNA进行提取，用的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计估计其纯度及浓度；以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，采用Clontech公司的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMART PCRcDNA Synthesis Kit 进行抑制差减杂交实验；将第二次PCR的产物与pGEM-T fesy载体连接，连接产物转大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞，进行蓝白斑筛选，构建转基因酵母的差减文库；对差减文库中的重组子进行PCR 鉴定，将鉴定后的重组子进行测序，测序获得一段335bp的基因片段；测序结果用BLASTn程序在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，确定该基因片段为二氢鞘氨醇羟化酶基因，并推测出该基因编码蛋白质的氨基酸序列。
3.一种二氢鞘氨醇羟化酶，其特征在于，该二氢鞘氨醇羟化酶蛋白质是由权利要求1 所述的基因所编码如序列表SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列，其来源于产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。
全文摘要
本发明公开一种二氢鞘氨醇羟化酶基因及编码的多肽。所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的碱基序列，全长为438bp，其氨基酸序列中101个氨基酸组成的蛋白质。本发明克隆分离了一种在酵母中可催化二氢鞘氨醇在C4位羟基化生成植物鞘氨醇的二氢鞘氨醇羟化酶基因的核苷酸序列，并提供了其编码的蛋白质的氨基酸序列，以应用于麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中整合后，由于代谢途径重构造成异常汉逊酵母基因表达谱发生变化的研究，并为二氢鞘氨醇羟化酶基因的相关研究提供新的基因序列信息。扩大了二氢鞘氨醇羟化酶基因的资源，同时为转基因重组酵母生物合成麻黄碱的代谢途径研究和利用该基因构建基因工程菌提供了依据，具有广泛的应用领域。
文档编号C12N15/53GK102154335SQ201110003398
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者吕杰, 毛培宏, 金湘 , 马媛 申请人:新疆大学