专利名称：一种乙醇脱氢酶基因及编码的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物次生物质代谢技术领域。具体的说，本发明涉及一种涉及产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母乙醇脱氢酶基因的克隆及编码的多肽技术领域。
背景技术：
乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，简称ADH)是广泛分布的含锌金属酶，NAD+、 NADP+或PQQ为辅酶。ADH广泛分布于大自然中，在人和哺乳动物的肝脏、植物组织以及微生物细胞中都有发现。ADH具有广泛的底物特异性，是许多有机体中的主要短链醇代谢的关键酶，它的生理作用在于可逆的催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物。在微生物体内，ADH是主要的短链醇代谢的关键酶，可逆的催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物，在不同的微生物中，其生理作用有所不同，微生物来源的ADH 中，酵母和一些嗜温细菌ADH的报道较多，不同微生物来源的ADH分子量、催化特性等有所不同。乙醇脱氢酶参与酵母维生素A代谢、酪氨酸代谢、脂肪酸代谢和葡萄糖代谢多个代谢过程。随着生物技术和酶工业的发展，ADH的研究已经成为研究热点，正被广泛应用于医学分析、工业生产和科学研究等方面。此外在产麻黄碱重组酵母CGMCC. No. 1499中利用SSH 技术分离的乙醇脱氢酶作为重组菌中高表达基因，对重组菌生物合成麻黄碱的研究和开发具有重要的意义。
发明内容
鉴于采用SSH技术分离获得多条重组酵母菌合成麻黄碱时差异表达基因片段，其中高表达的乙醇脱氢酶基因参与酵母麻黄碱生物合成代谢途径的调控。因此，本发明旨在提供一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的乙醇脱氢酶基因序列和编码多肽序列，以应用于麻黄碱次生代谢途径的研究，为麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中的整合、表达以及调控研究奠定基础，也为乙醇脱氢酶基因的相关研究领域提供新的基因资源。本发明的技术方案通过利用产麻黄碱的转基因重组酵母是新疆大学利用离子束介导野生蓝麻黄基因组DNA在异常汉逊酵母中的随机转化获得重组酵母菌，相关方法和重组菌种已获国家发明专利授权(专利号ZL 200610011402.7)。以出发菌株异常汉逊酵母2. 340和重组酵母CGMCC No. 1499为研究材料，采用抑制差减杂交技术(suppression subtraction hybridization, SSH)获得重组酵母生物合成麻黄碱时差异表达乙醇脱氢酶基因片段，获得乙醇脱氢酶基因片段长36;3bp，通过美国国立生物技术信息中心序列相似性搜索程序(NCBIBlast)的核酸序列分析，表明与数据库中已登记的乙醇脱氢酶同源性最高为77%，由此证明从产麻黄碱重组酵母中分离的乙醇脱氢酶基因是一个新的乙醇脱氢酶基因。具体的，本发明提供了一种乙醇脱氢酶基因具有如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列，
3全长为ΙΜ^ρ，其编码由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中375个氨基酸组成的蛋白质。同时，本发明提供了一种乙醇脱氢酶基因的获得方法，所述的乙醇脱氢酶基因ADH 是来源于产麻黄碱的转基因重组酵母CGMCC No. 1499，通过SSH和cDNA3'和5'末端快速扩增(RACE)获得。具体包括如下步骤1、采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedra glauca L.)基因组DNA 在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选， 获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499。2、将步骤1中所获得转基因酵母菌和出发菌株进行培养，并分别提取其总RNA，以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，进行抑制差减杂交实验，构建了转基因酵母与出发菌株之间的差减文库。PCR鉴定重组子进行测序，获得一段36;3bp的基因片段。测序结果用BLASTn程序在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，确定该基因片段为乙醇脱氢酶基因。3、将步骤2获得乙醇脱氢酶基因片段分别设计cDNA 3'和5' RACE的嵌套式引物各一对。提取重组酵母CGMCC No. 1499总RNA，利用已设计的3 ‘和5 ‘ RACE引物，对乙醇脱氢酶的3'和5'末端进行扩增。将3'和5' RACE扩增结果进行回收，连接T-载体， 检测重组子后进行测序，测序获得乙醇脱氢酶基因3'和5'端序列信息。将获的乙醇脱氢酶基因片段用GeneTool软件进行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。进一步，本发明提供了一种乙醇脱氢酶，该乙醇脱氢酶蛋白质的基因所编码具有如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其来源于产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。根据本发明所述的乙醇脱氢酶基因全长为ΙΜ^ρ，该序列编码375个氨基酸。通过NCBI Blast的核酸序列分析，表明与数据库中已登记的比对得分最高的4种酵母菌乙醇脱氢酶同源性最高为77%，参见附图1。由此证明从产麻黄碱重组酵母中分离的乙醇脱氢酶基因是一个新的乙醇脱氢酶基因。编码产物即本发明乙醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0. 2 所示。如本领域的技术人员所知，本发明乙醇脱氢酶基因也可以是编码由SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的衍生物，可以是SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的乙醇脱氢酶活性的序列2衍生蛋白质，包括在蛋白质C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。相应地，本发明乙醇脱氢酶基因也可以是编码这些本发明乙醇脱氢酶衍生物或类似物的氨基酸序列。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果1.本发明提供了一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的乙醇脱氢酶基因序列和编码多肽序列，该乙醇脱氢酶基因具有如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列，全长为ΙΜ^ρ，其编码由序列表中SEQID N0. 2所示的氨基酸序列中375个氨基酸组成的蛋白质。2.本发明提供的一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的乙醇脱氢酶基因及其乙醇脱氢酶应用于麻黄碱次生代谢途径的研究，为麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中的整合、表达以及调控研究奠定基础，也为乙醇脱氢酶基因的相关研究领域
4提供新的基因资源。
图1所示为获得乙醇脱氢酶ADH与其它4种酵母同源比对系统进化树。图2所示为利用抑制差减杂交技术获得的差异基因表达片段电泳结果图，图中，M 为DNA分子量标准DL2000，1为乙醇脱氢酶片段。图3所示为获得的乙醇脱氢酶基因片段设计RACE实验引物示意图。图4所示为利用抑制差减杂交技术获得的差异基因表达片段电泳结果图，图中，M 为λ-EcoTH I digest DNA Marker，1为从出发菌株内扩增出的乙醇脱氢酶片段，2为从转基因酵母内扩增出的乙醇脱氢酶片段。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有主要试剂Takara公司 daq DNA 聚合酶，RNAiso Reagent, 3' -Full RACECore Set Ver 2.0 和 5' -Full RACE Kit，Clontech 公司 PCR-klectTMcDNASubtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit，Axygen 公司胶回收试剂盒，Promega 公司 pGEM_T 克隆载体，主要仪器IBB Device 1多功能离子注入机，Sigma 3-18K离心机，UV-7M分光光度计，TC-512PCR 仪。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一1、采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedra glauca L.)基因组DNA 在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选， 获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499。2、将步骤1中所获得转基因酵母菌和出发菌株进行培养，并分别提取其总RNA，以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，进行抑制差减杂交实验，构建了转基因酵母与出发菌株之间的差减文库。PCR鉴定重组子进行测序，获得一段363bp的基因片段。测序结果用BLASTn程序在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，确定该基因片段为乙醇脱氢酶基因。3、将步骤2获得乙醇脱氢酶基因片段分别设计cDNA 3'和5' RACE的嵌套式引物各一对。提取重组酵母CGMCC No. 1499总RNA，利用已设计的3 ‘和5 ‘ RACE引物，对乙醇脱氢酶的3'和5'末端进行扩增。将3'和5' RACE扩增结果进行回收，连接T-载体， 检测重组子后进行测序，测序获得乙醇脱氢酶基因3'和5'端序列信息。将获的乙醇脱氢酶基因片段用GeneTool软件进行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。实施例二1、菌株培养和总RNA的提取将出发菌株和转基因酵母菌CGMCC No. 1499分别从斜面分别转接入液体培养基，置摇床230r/min、28°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体。采用Takara RNAiso Reagent对酵母总RNA进行提取，按试剂盒说明书进行。用的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计估计其纯度及浓度。2、采用抑制差减杂交技术(SSH)获得重组酵母菌中乙醇脱氢酶基因片段以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，采用Clontech公司的PCR-%Iect cDNA Subtraction Kit和SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit进行抑制差减杂交实验。根据紫外分光光度计测定值所计算的RNA浓度，分别将提取的转基因酵母和出发菌株总RNA用 RNA-free water稀释成1 μ g/μ L，按试剂盒说明书分别合成转基因酵母和出发菌株单链 cDNA。将转基因酵母和出发菌株单链cDNA分别合成为双链cDNA，平行做3个样品(实验组和驱动组，另外多做一个样品)，在进行到15个循环时，取出实验组和驱动组PCR样品存放在4°C，并从另外的样品中取出15 μ L留作检测，以后每隔3个循环取样一次，直到M 个循环结束。对取出的样品进行的琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳循环数。将实验组和驱动组样品重新放入PCR仪中，补充循环次数到最佳循环数，实验所得最佳循环数为18。 循环结束后，加入2μ L 0. 5Μ EDTA终止反应。将获得的双链cDNA用氯仿-异戊醇04 1)纯化2次，4M醋酸铵溶液和300 μ L 95%的乙醇沉淀双链cDNA，80%的乙醇洗涤干燥后用于Rsa I酶切。双链cDNA的Rsa I 37°C水浴酶切1. 后，用的琼脂糖凝胶电泳进行酶切效率的检测。检测后对酶切样品进行苯酚-氯仿-异戊醇05 24 1)纯化，80%的乙醇洗涤沉淀后干燥进行接头连接 (只对实验组进行接头的连接)。分别吸取转基因酵母双链cDNA Rsa I酶切纯化产物各 2 μ L，分别加入不同的接头"Γ4 DNA LigaSel6°C水浴过夜连接，连接产物加入IyL EDTA/ Glycogen终止反应，并72°C水浴5min失活连接酶。向带有不同接头经Rsa I酶切转基因酵母双链cDNA中加入1. 5 μ L驱动组cDNA (经Rsa I酶切)，PCR仪中68°C 8h进行第一次杂交，将第一次杂交的两个样品混合，并立即加入从PCR仪中取出的新变性的驱动组cDNA， 离心混勻，68°C过夜进行第二次杂交，杂交结束后加入400 μ L dilutionbuffer，混勻后，于 PCR仪中68°C加热7min备用。将经过差减杂交的稀释cDNA进行第一次PCR反应，反应结束后将第一次PCR产物稀释10倍，作为第二次PCR的模板进行PCR反应，取8 μ L进行2. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，条带呈现弥散状。按Axygen回收试剂盒说明书对SSH-PCR产物进行回收，回收产物溶解于10 μ L的无菌水中，再按!Iomega公司的pGEM_T Easy载体说明书将回收产物与T-载体16°C连接过夜，连接产物转大肠杆菌感受态细胞进行蓝白斑筛选。对筛选获得的白斑用碱法提取其质粒DNA进行重组子的PCR鉴定，反应结束后，取5 μ L进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，参见附图2。将获得基因片段测序并将序列信息进行Blast同源比对，分别用BLASTn和BLASTx 程序将测序结果片段的碱基序列在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，通过NCBI Blast的核酸序列分析，表明与数据库中已登记的比对得分最高的4种酵母菌乙醇脱氢酶同源性最高为77%，参见附图1。由此证明从产麻黄碱重组酵母中分离的乙醇脱氢酶基因是一个新的乙醇脱氢酶基因，初步确定该基因片段为乙醇脱氢酶基因。
实施例三1、乙醇脱氢酶基因RACE实验引物设计
利用获得乙醇脱氢酶基因片段分别设计cDNA 3'和5'末端快速扩增(RACE)的嵌套式引物各一对，参见附图3。2、在重组酵母菌中进行乙醇脱氢酶基因的克隆。将转基因酵母菌置摇床230r/minJ8°C 30°C培养72h，离心收集菌体。采用 Takara RNAiso Reagent对酵母总RNA进行提取，利用已设计的3 ‘和5 ‘ RACE引物，采用 Takara公司的 3' -Full RACE Core Set Ver 2.0 和 5' -Full RACE Kit 试剂盒对乙醇脱氢酶的3'和5'末端进行扩增。3、乙醇脱氢酶基因3' RACE实验将转基因酵母总RNA进行反转录，反转录结束后，对反转录产物进行OuterPCR反应，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测无特异性条带，将Outer PCR反应液稀释50倍进行Inner PCR反应，反应结束后3'端第二轮PCR扩增结果进行电泳分析，得到400bp左右大小条带， 将3' RACE扩增结果进行胶回收，回收产物分别与pGEM-T fesy载体连接，连接产物转大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞，进行蓝白斑筛选，PCR鉴定重组子，测序获得乙醇脱氢酶基因 3'端序列信息。4、乙醇脱氢酶基因5' RACE实验使用Alkaline Phosphatase (CIAP)对iTotal RNA中裸露的5'磷酸基团进行去磷酸化反应。去磷酸反应后加入3M CH3COONa (pH5. 2)和RNase Free dH20充分混勻，用酚 /氯仿/异戊醇05 24 1)进行纯化，异丙醇进行沉淀，70%冷乙醇(RNase Free dH20 配制)漂洗沉淀，弃上清后干燥。干燥后加入7 μ L的RNase Free dH20溶解沉淀，得到 CIAP-treated RNA。去磷酸化总 RNA 用 TobaccoAcid Pyrophosphatase (TAP)去掉 mRNA 的 5'帽子结构，保留一个磷酸基团。处理后的CIAP/TAP-treated RNA与5' RACE Adaptor 进行连接，并用苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1)进行纯化，获得Ligated RNA。随后对 Ligated RNA进行反转录反应，Ligated RNA和Random 9 mers的混合物于70°C变性10分钟后，冰上放置2min，再加入反转录反应的其余试剂进行反转录反应。反转录结束后，对反转录产物进行Outer PCR反应，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测无特异性条带，将Outer PCR反应液稀释50倍进行^mer PCR反应，反应结束后5 ‘端第二轮 PCR扩增结果进行电泳分析，得到600bp左右大小条带，将5' RACE扩增结果进行胶回收， 回收产物分别与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞，进行蓝白斑筛选，PCR鉴定重组子，测序获得乙醇脱氢酶基因5'端序列信息。5、乙醇脱氢酶基因的拼接。将获的乙醇脱氢酶基因片段用GeneTool软件进行拼接，得到完整的基因核苷酸序列，见SEQ ID N0. 1，该基因编码蛋白质的氨基酸序列，见SEQ ID N0. 2。实施例四1、菌株液体培养和麻黄碱含量测定将出发菌株和转基因酵母菌CGMCC No. 1499分别从斜面分别转接入液体培养基， 置摇床230r/min、28°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体以及发酵液。采用反向高效液相对转基因酵母菌发酵液当中的1-麻黄碱含量进行测定，测定结果为11.87mg/L，出发菌株发酵液中不含ι-麻黄碱。2、采用抑制差减杂交技术(SSH)获得重组酵母菌中乙醇脱氢酶基因片段采用Takara RNAiso Reagent对出发菌株和转基因酵母酵母总RNA进行提取，以转基因酵母总RNA为实验组，出发菌株总RNA为驱动组，采用Clontech公司的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit 进行抑制差减杂交实验。根据紫外分光光度计测定值所计算的RNA浓度，分别将提取的转基因酵母和出发菌株总 RNA 用 RNA-free water 稀释成 1 μ g/ μ L。按试剂盒说明书分别合成转基因酵母和出发菌株单链cDNA。将转基因酵母和出发菌株单链cDNA分别合成为双链cDNA，实验所得最佳循环数为18。将获得的双链cDNA进行纯化，用Rsa I进行酶切，酶切后对实验组进行接头的连接，向带有不同接头经Rsa I酶切转基因酵母双链cDNA中加入过量驱动组cDNA(经RsaI酶切)进行第一次杂交，第一次杂交后混合带有不同接头的两个样品，并立即加入过量的新变性驱动组cDNA，进行第二次杂交。将经过差减杂交的稀释cDNA进行两次的抑制PCR反应，最后将第二次抑制PCR的产物回收，并与PGEM-T Easy载体连接，构建了转基因重组酵母菌的质粒差减文库。由于两次杂交均加入的是过量驱动组cDNA，因此杂交过后只有转基因酵母中特异表达基因和高表达基因才可以最大程度的形成带有不同接头的双链cDNA，在随后的抑制 PCR中得以指数级的富集。将获得基因片段测序并将序列信息进行Blast同源比对，分别用BLASTn和BLASTx 程序将测序结果片段的碱基序列在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，初步确定该基因片段为乙醇脱氢酶基因。3、乙醇脱氢酶基因片段的鉴定将出发菌株和转基因酵母菌CGMCC No. 1499分别从斜面分别转接入液体培养基， 置摇床230r/min、28°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体，采用TakaraRNAiso Reagent对出发菌株和转基因酵母酵母总RNA进行提取，并用ployA引物进行反转录。反转录结束后， 用利用该片段设计的特异性引物adh3-Fl和&(&5-1 1进行？0 反应，参见附图3，1.0(%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，参见附图4，结果显示出发菌株和转基因菌株均扩增出相同大小的片段，表明该片段为出发菌株内源基因，但在转基因酵母分泌表达麻黄碱时高表达。
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权利要求
1.一种乙醇脱氢酶基因，其特征在于，所述的乙醇脱氢酶基因具有如SEQ IDN0. 1所示的碱基序列，全长为1245bp，其编码由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中375个氨基酸组成的蛋白质。
2.一种如权利要求1所述的乙醇脱氢酶基因的获得方法，所述的乙醇脱氢酶基因ADH 是来源于产麻黄碱的转基因重组酵母CGMCC No. 1499，通过SSi^PcDNA 3'和5'末端快速扩增(RACE)获得，其特征在于，具体包括如下步骤(1)采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedraglauca L.)基因组DNA在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选，获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499 ；(2)将步骤1中所获得转基因酵母菌和出发菌株进行培养，并分别提取其总RNA，以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，进行抑制差减杂交实验，构建了转基因酵母与出发菌株之间的差减文库；PCR鉴定重组子进行测序，获得一段36;3bp的基因片段；测序结果用 BLASTn程序在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，确定该基因片段为乙醇脱氢酶基因；(3)将步骤2获得乙醇脱氢酶基因片段分别设计cDNA3'和5' RACE的嵌套式引物各一对；提取重组酵母CGMCC No. 1499总RNA，利用已设计的3'和5' RACE引物，对乙醇脱氢酶的3'和5'末端进行扩增；将3'和5' RACE扩增结果进行回收，连接T-载体，检测重组子后进行测序，测序获得乙醇脱氢酶基因3'和5'端序列信息；将获的乙醇脱氢酶基因片段用GeneTool软件进行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。
3.—种乙醇脱氢酶，其特征在于，该乙醇脱氢酶蛋白质是由权利要求1所述的基因所编码，具有如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其来源于产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。
4.如权利要求1所述的一种乙醇脱氢酶基因，其特征在于，所述的乙醇脱氢酶基因编码由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的衍生物，如SEQID NO. 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的乙醇脱氢酶活性的序列2 衍生蛋白质，包括在蛋白质C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。
全文摘要
本发明公开一种乙醇脱氢酶基因及编码的多肽。所述的乙醇脱氢酶基因的碱基序列，全长为1245bp，其氨基酸序列中375个氨基酸组成的蛋白质。本发明以利用低能氩离子(Ar+)注入介导蓝麻黄基因组DNA在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)2.340中的随机转化所获得的产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母CGMCC No.1499为材料，从中分离出的一种可逆催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物的新乙醇脱氢酶基因，扩大了乙醇脱氢酶基因的资源，同时为转基因重组酵母生物合成麻黄碱的代谢途径研究和利用该基因构建基因工程菌提供了依据，具有广泛的应用领域。
文档编号C12N15/10GK102154334SQ20111000339
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者吕杰, 毛培宏, 金湘 , 马媛 申请人:新疆大学