专利名称：新的7α-羟类固醇脱氢酶敲除突变体及其用途的制作方法
新的 α-羟类固醇脱氢酶敲除突变体及其用途本发明涉及新的微生物7α-羟类固醇脱氢酶(7C1-HSDH)敲除突变体，和将其用于产生不同功能性的其他的HSDHs (例如3 α -、7 β -或者12 a -HSDH)的用途，以及由此产生的HSDH酶在胆酸化合物的酶促反应中，并且特别是在熊去氧胆酸(UDCA)的产生中的用途；本发明尤其涉及合成UDCA的新方法。发明背景:活性物质熊去氧胆酸(UDCA)和相关的非对映异构体鹅去氧胆酸(⑶CA)已经多年被应用于胆结石的药物治疗。这两种化合物仅在第7位的C原子上的羟基的构型不同(UDCA: β-构型，⑶CA: α-构型)。在现有技术中，描述了产生TOCA的多种方法，其完全用化学方法进行或者由化学和酶处理步骤的组合组成。在每种情况下，起点是胆酸(CA)或者从胆酸生成的⑶CA。因此产生UDCA的经典的化学方法可以以图示表示如下:
权利要求
1.重组微生物，其中抑制了7α-羟类固醇脱氢酶(7C1-HSDH)的酶活性，同时可表达地含有功能不同的羟类固醇脱氢酶(例如，3 α -、3 β -、7 β _、11 α -、11 β -、12 α -、12 β _、17 α -、17 β -、20 α -或 20 β -HSDH,尤其 3α-、7β -或 12 α -HSDH)的酶活性。
2.权利要求1要求保护的重组微生物，其中通过同源重组或者通过基因破坏(特别是通过插入抑制编码的基因产物的酶功能的核酸序列)敲除编码7 a -HSDH的核酸序列。
3.前面权利要求的一个要求保护的重组微生物，其来源于表达7a -HSDH的前体微生物，特别是内源表达7 a -HSDH的前体微生物，特别是埃希氏菌属细菌，尤其大肠杆菌。
4.前面权利要求的一个要求保护的重组微生物，其重组表达在功能上不同于7 a -HSDH 的 HSDH,特别是如 3 α -、7 β -和 / 或 12 a -HSDH0
5.前面权利要求的一个要求保护的重组微生物，其中所述被敲除的7a -HSDH具有根据SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或者由根据SEQ ID ΝΟ:9的核酸序列编码。
6.前面权利要求的一个要求保护的重组微生物，其中所述表达的功能上不同于7 a -HSDH的HSDH含有以下的氨基酸序列的一个: a)3 a -HSDH 序列，其选自 SEQIDNO: 29 和 31 b)7 β -HSDH 序列，其选自 SEQIDNO: 25 和 c)12 a-HSDH 序列，其选自 SEQIDNO: 12，14，16 ;或 d)从上述衍生的氨基酸序列，其编码与a)，b)和c)下的序列的一个具有至少50%的同一性程度的HSDH。
7.用于重组产生功能上不同于7a -HSDH的所希望的HSDH的方法，其中在表达所希望的HSDH的条件下培养7 a -HSDH酶活性受抑制的如前述权利要求之一要求保护的重组微生物，并且分离由此表达的HSDH，其中在所述分离的HSDH中基本上检测不到功能性的7 a -HSDH0
8.重组HSDH，其选自 3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β_、17α-、17β-、20 α -或20 β -HSDH,特别地选自3 α -、7 β -和12 a -HSDH,所述重组HSDH不被7 a -HSDH酶或酶活性污染，可从权利要求1至6的一个要求保护的重组微生物获得。
9.权利要求8要求保护的重组HSDH，其包含选自下组的氨基酸序列: a)3 a -HSDH 序列，其选自 SEQIDNO: 29 和 31 b)7 β -HSDH 序列，其选自 SEQIDNO: 25 和 c)12 a-HSDH 序列，其选自 SEQIDNO: 12，14，16 ;和 d)从上述衍生的氨基酸序列，其与a)，b)和c)下的序列的一个具有至少50%的同一性程度。
10.选择性地酶促氧化羟类固醇的方法，所述羟类固醇除了在类固醇结构的3α-、3β _、11 α -、11 β -、12 α -、12 β _、17 α -、17 β -、20 α -或 20 β -位的至少一个，特别是在类固醇结构的12α-位上含有羟基外，还在类固醇结构的7α-位上含有至少一个另外的羟基，其中在 3 α -、3β _、11 α -、11 β -、12 α -、12 β -、17 α -、17 β -、20 α -或 20 β -HSDH 的存在下，特别是在权利要求8或9要求保护的12 a -HSDH的存在下，或者在权利要求1至6的一个要求保护的重组微生物的存在下，羟类固醇被反应，并且任选地从反应批次分离所形成的至少一种氧化产物。
11.权利要求10要求保护的方法，其中所述羟类固醇是胆酸(CA)或胆酸衍生物，如，特别是胆酸的盐、酰胺或者烷基酯。
12.权利要求11要求保护的方法，其中所述CA或其衍生物反应产生12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-⑶CA)或者产生相应的衍生物。
13.用于产生通式(I)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
14.选择性地酶促还原酮类固醇的方法，所述酮类固醇除了在类固醇结构的3、11、12、17或20位，特别是在类固醇结构的12位和/或3位上具有至少一个酮基外，还在类固醇结构的7位上具有至少一个另外的酮基，其中在3 α -、3 β _、7 β -Ul α -、11 β -、12 α -、12 β -、17 α -、17 β-、20 α -或20 β -HSDH的存在下，特别是在权利要求8或9要求保护的7 β -HSDH和/或3 a -HSDH和/或12 a -HSDH的存在下，或者在权利要求1至6的一个要求保护的重组微生物的存在下，酮类固醇被反应，并且任选地从反应批次分离所形成的至少一种还原产物。
15.权利要求10至14的一个要求保护的方法，其中所述催化所希望的反应的至少一种HSDH (如，特别是7 β -HSDH,3 a -HSDH和/或12 a -HSDH)以溶解的、分散的或者固定化形式使用；或者其中所述方法在权利要求1至6的一个要求保护的重组微生物的全细胞，任选地固定化细胞的存在下进行。
16.产生通式(I)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
17.权利要求10至16的一个要求保护的方法，其中将所述酶促氧化还原步骤与(特别是酶促)辅因子再生步骤偶联。
全文摘要
本发明涉及新的微生物7α-羟类固醇脱氢酶(7α-HSDH)敲除突变体，和将其用于产生具有不同功能性的其他的HSDHs(例如3α-、7β-或者12α-HSDH)的用途，以及由此产生的HSDH酶在胆酸化合物的酶促反应中，并且特别是在熊去氧胆酸(UDCA)的产生中的用途。本发明尤其涉及合成UDCA的新方法。
文档编号C07K14/245GK103097400SQ201180036506
公开日2013年5月8日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者R·施密德, M·布劳恩, L·刘, A·艾格纳, D·沃伊斯特－博茨 申请人:细胞制药有限公司