所需样品量仅 需50-100微升，约是膜芯片的十分之一。可应用于自动化操作，方便技术员一天完成几百 个芯片的检测工作。采用激光扫描仪来检测荧光信号，荧光信号可维持数月，适用于蛋白浓 度的定量分析。利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和参考值的信号来确定样品 中的未知因子的含量，其结果具有一致性和可靠性且节省时间和样品量。
[0024] 本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒具有以下优点：采用本发明 的早期肝癌的抗体芯片试剂盒，能够同时检测出8种肝癌相关蛋白，并且能够实现多样本 多指标的并行检测，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺 陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化应用。
[0025] 另外本发明的抗体芯片试剂盒所用到的将特异性抗体固定于玻片的方法，由于其 采用了全自动点样仪，为实现检测早期肝癌的抗体芯片试剂盒的高通量、多位点提供了一 种可能；另外，通过对在点样和包被过程中用到的玻片进行优选，也优化了抗体芯片试剂盒 在灵敏度、准确性、高通量等方面的性能。
[0026] 本发明采用的抗体芯片是多个夹心ELISA法同时进行定量检测的系统，它结合了 ELISA法高特异性和灵敏度及芯片高通量的优势。通过在玻片上固定多个特异性捕获抗体， 一次实验可定量检测至少上千个蛋白，检测样品体积仅需50~100微升。利用荧光素作为 检测信号，通过比较未知样品和参考值的信号来确定样品中的未知因子的含量，其结果具 有一致性和可靠性且节省时间和样品量。本发明同时采用了玻片式抗体芯片平台的优势。 玻片式芯片是抗体预先固定在标准大小的玻片上，并用16或64孔的框架形成的多通量的 芯片。玻片式芯片与膜芯片相比有以下优点：首先多个阵列在同一个标准大小玻璃片上，通 量大大增加，其次，所需样品量更少，约是膜芯片的十分之一。最后，可应用于自动化操作， 方便技术员一天完成几百个芯片的检测工作。玻片式芯片制作成本较低，价格比膜芯片便 宜约20%，适合于膜芯片的样品都可以用于玻片式芯片。玻片式芯片激光扫描仪来检测突 光信号，几乎相同原理的扫描仪都可以使用。玻片式芯片荧光信号可维持数月，适用于蛋白 浓度的定量分析。采用多种标志物组合方式，对于早期肝癌的辅助诊断及术后的疾病进展 观察有积极的作用。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于AFP抗体的检测结果的相关 性比较图，其趋势方程为y = 4. 494x-30. 55,相关系数为0. 965。
[0028] 图2是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于AFP-L3抗体的检测结果的 相关性比较图，其趋势方程为y = 4642X+92. 42,相关系数为0. 991。
[0029] 图3是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于DCP抗体的检测结果的相关 性比较图，其趋势方程为y = 119. 8x-588. 9,相关系数为0. 980。
[0030] 图4是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于AFU抗体的检测结果的相关 性比较图，其趋势方程为y = 5. 364X+104,相关系数为0. 98。
[0031] 图5是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于GP73抗体的检测结果的相 关性比较图，其趋势方程为y = 6. 925X+45. 09,相关系数为0. 943。
[0032] 图6是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于SCCA抗体的检测结果的相 关性比较图，其趋势方程为y = 7. 172X+44. 52,相关系数为0. 962。
[0033] 图7是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于CK19抗体的检测结果的相 关性比较图，其趋势方程为y = 3. 908X+124. 7,相关系数为0. 942。
[0034] 图8是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于VEGF抗体的检测结果的相 关性比较图，其趋势方程为y = 8. 177X+54. 54,相关系数为0. 932。
[0035] 图9显示本发明的试剂盒所用抗体的交叉反应结果。
[0036] 图10是本发明所述抗体芯片试剂盒检测肝癌血清样本的结果示意图。
[0037] 图11显示16孔固相载体硬质芯片框架结构图。
[0038] 图12显示64孔固相载体硬质芯片框架结构图。
【具体实施方式】
[0039] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0040] 实施例1 :试剂盒的制备。
[0041] 一、抗体的筛选和来源
[0042] 以AFP抗体筛选举例，采用本抗体检测6份临床样本（临床样本的检测值已知，采 用电化学发光法测得），将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点图，其相关性 如下：电化学发光检测结果与本试剂盒的检测结果基本相当。
[0043] 以AFP抗体为例，采用本抗体检测6份临床样本（临床样本的检测值已知，采用电 化学发光法测得，为光吸收峰值通过软件转化为数值），将临床样本检测值与本试剂盒的检 测值对比画成散点图（见图1)，其相关性如下：电化学发光检测结果与本试剂盒的检测结 果基本相当。
[0044] 对于其他抗体，方法同AFP。将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点 图，见图2至图8。
[0045] AFP 临界值为 20ng/ml，AFP-L3 临界值为 10%，DCP 临界值为 40m AU/ml，GP73 临 界值为150ug/ml，SCCA临界值为2ug/ml，VEGF临界值为200pg/ml，AFU临界值为38U/L， CK19 临界值为 2. 2ug/ml。
[0046]
[0047] 二、特异性抗体的筛选：
[0048] 从以下8种肝癌肿瘤标志物中筛选可以将其对应抗体组合在一起，并通过全自动 点样仪将特异性抗体固定在玻片上，从而实现在一个小的方阵内同时检测多个指标。
[0049] 各特异性抗体采用美国伯乐公司或钼金艾尔默公司生产的全自动点样仪器固定 于玻片。而在具体的操作过程中，各特异性抗体蛋白质的排布可以按照实验设计需要进行 调整，根据不同的蛋白质芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。 [0050] 将8种肝癌肿瘤标志物相应抗体按照图2所示点样示意图进行点样。采用全自动 点样仪进行点样，具体方法为：
[0051 ] 1)特异性抗体与含有1. 4~2 %酪蛋白的pH7. 4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合 物。
[0052] 2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0. 01~2ng固定于所述点样孔，每个抗体设 置2至4个重复孔。
[0053] 3)抗体芯片点阵排布于玻片。
[0054] 准备两个固定有8种肝癌肿瘤标志物相应抗体的芯片，左边的芯片中加入肿瘤组 织样本裂解液，左边的芯片中加入正常组织样本裂解液。具体操作如下：
[0055] 1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20~30min后， 将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1~2小时。
[0056] 2、芯片操作流程：每个孔中加50~100 μ 1的样品，组织裂解液经蛋白浓度测定后 加入50~500ug/ml的量。
[0057] 3、清洗：抽去每个孔中的样品，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔 150μ 1的IX洗涤液，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20X洗涤液。
[0058] 4、检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1. 4ml的样品稀 释液，混合均匀后再次快速离心。添加80 μ 1的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小 时。
[0059] 5、清洗：抽去每个孔中的检测抗体，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每 孔150 μ 1的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。
[0060] 6、Cy3-链霉亲和素的孵育：离心Cy3-