用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂和诊断方法

专利名称：用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂和诊断方法
技术领域：
本发明涉及用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂及其制备方法，以及乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断方法。
在发现澳大利亚抗原-一种特异的肝炎病毒抗原后，Dane于1970年在肝炎患者的血清中发现了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和完整的HBV颗粒(Seo，J.H.，Park，B.C.肝炎病毒(1)，生命科学2(3)163-174，1992)。至今已经在HBV的基因中发现了6个开放阅读框。在由它们所表达的蛋白中，24kd SHBs(S位点)，31kd MHBs(Pre S2+S)和38kd LHBs(Pre S1+Pre S2+S)组成了HBV的病毒外壳。用电泳测定来自血浆中的HBsAg时，发现似乎HBsAg彼此之间具有不同分子量的p-24和糖基化的p-30。在自然条件下，HBsAg不是以单独的蛋白质存在，而是以含有糖和脂类的复合蛋白的形式存在。HBsAg以具有约3,000,000的分子量和约20nm的直径的大颗粒的形式存在。当被乙肝病毒感染后，HBcAg(乙肝核心抗原)，HBsAg和HBeAg(乙肝e抗原)的抗体产生。其中，只有HBsAg抗体已被证实对HBV的再次感染具有免疫保护作用。
因此，至今开发针对乙肝病毒的保护疫苗的目标是通过施用疫苗产生HBsAg抗体。一个人是否获得了对乙肝的免疫力取决于HBsAg抗体的存在。通常，当他/她的HBsAg抗体浓度高于10mIU/ml时，即认为已经获得了抗HBV的免疫力。如果抗体水平低于10mIU/ml就推荐再次接种疫苗。
很多公司已经生产出了检测抗HBsAg抗体的诊断试剂。反应原理利用了夹层法，即加入的血浆或血清同固定在固体支持物(例如平板，珠或其它同类的东西等)上的HBsAg发生反应从而使HBsAg抗体同表面抗原结合，然后用酶或同位素或其它类似技术标记的第二HBsAg同抗体结合。根据标记的方法，在诊断试剂中所用的分析方法被分成几类；酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)和其它同类的方法。现在已经使用的用于检测HBsAg抗体的大多数诊断试剂利用由血浆中纯化的HBsAg。但是由血浆纯化的HBsAg不是纯的表面抗原蛋白，而是含有糖类和脂类的复合蛋白。因此，可能检测出不是由HBsAg抗体蛋白而是由除HBsAg蛋白以外的成分的抗体或同其具有亲和性的材料所造成的错误阳性信号。虽然使用了低浓度的标记的第二抗原以降低这样的错误阳性信号，但是在这种情况下诊断试剂的灵敏度降低。作为克服这些方法的低灵敏度的尝试，有一种试剂盒(Abbot，美国)，它利用了将生物素共价连接到第二HbsAg上和使用用辣根过氧化酶标记的抗生物素抗体的技术。
发明的公开本发明的一个目的是提供用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的具有更高灵敏度和特异性的诊断试剂。
本发明的另一个目的是提供用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂的制备方法。
本发明的另一个目的是提供灵敏度和特异性更高的诊断乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的方法。
本发明提供了一种使用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其特征在于该诊断试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。本发明进一步提供了一种使用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其特征在于该诊断试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
本发明还提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该方法包括将由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原包含在诊断试剂中的步骤。本发明进一步提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该方法包括将由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原包含在诊断试剂中的步骤。
另外，本发明提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断方法，其特征在于该诊断方法利用由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。本发明进一步提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断方法，其特征在于该诊断方法利用由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
例如根据来源(例如来自血浆的HBsAg和重组HBsAg)或一对第一和第二抗原的纯化方法，本发明的诊断试剂包含两种互不相同的HBsAg。
检测乙肝抗体的常规的诊断试剂利用了通过乙肝病毒表面抗原(HBsAg)检测抗体的方法。在这种情况下使用的HBsAg是从人血浆中获得的HBsAg或重组HBsAg(Ostrow，D.H.等，通过自动微粒酶免疫法定量测定乙肝表面抗体，病毒学方法杂志32(1991)265-276)。但是，HBsAg是一种膜蛋白。这种纯蛋白质自己不能保持其天然构象。因此，HBsAg含有大量的碳水化合物和脂类。而且，由于HBsAg的颗粒结构，几乎不可能以纯蛋白质的形式分离出HBsAg。换句话说，用于检测乙肝抗体的诊断试剂中的乙肝表面抗原不可避免地含有大量杂质。本发明能够通过结合两种，例如根据来源或纯化方法而互不相同的HBsAg来减少由这样的杂质所引起的非特异性反应。
按照本发明，提供了具有更高灵敏度和特异性的用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂，及其制备方法。另外，根据本发明，提供了用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的具有更高灵敏度和特异性的诊断方法。根据下面的说明和所附的权利要求将使本发明的其它特征、方面以及优点更易于理解。
特别地，本发明提供了一种以夹层免疫分析作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其特征在于该诊断试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。本发明进一步提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其特征在于该试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
优选的，本发明的诊断试剂可以含有源于血浆的表面抗原和重组表面抗原作为一对乙肝表面抗原。更优选的是，本发明诊断试剂中的重组表面抗原可以包括源于酵母或源于动物细胞的表面抗原。另外，本发明的诊断试剂可以含有由不同纯化方法得到的互不相同的两种表面抗原作为一对乙肝表面抗原。在本发明诊断试剂的一个实施例中，固定在支持物上的第一抗原可以是源于血浆的表面抗原，同标记物结合的第二抗原可以是重组表面抗原。在本发明诊断试剂的另一个实施方案中，固定在支持物上的第一抗原可以是重组表面抗原，同标记物结合的第二抗原可以是源于血浆的表面抗原。在本发明诊断试剂中的标记物可以包括酶、放射性物质、微颗粒、染色剂或其它同类的物质。
另外，本发明提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析方法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该方法包括将由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物相结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原包含在诊断试剂中的步骤。本发明进一步提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析方法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该方法包括将由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物相结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原包含在诊断试剂中的步骤。
另外，本发明提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析方法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断方法，其特征在于该方法利用了由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物相结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。本发明进一步提供了一种利用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断方法，其特征在于该方法利用了由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物相结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
下文将对本发明做出详细描述。将乙肝病毒表面抗原(第一抗原)固定在如微孔平板、膜或微颗粒一类的固体支持物上是为了用于结合HBsAg特异抗体。然后，使用同标记物结合的另一个表面抗原(第二抗原)检测与固定在支持物上的第一抗原结合的抗体。例如，根据来源或纯化方法，所使用的第二抗原不同于第一抗原。例如，可以用从血浆获得的HBsAg和重组HBsAg分别作为第一和第二抗原。也可以用重组HBsAg和从血浆获得的HBsAg分别作为第一和第二抗原。在这些情况下，重组HBsAg包括从酵母中获得的和从动物细胞或同类的细胞中获得的。另外，以不同方法纯化的HBsAg可以分别用作第一或第二抗原。可以通过上述标记物检测乙肝抗体的浓度。与第二抗原结合的标记物包括象放射性同位素一类的放射性物质，象碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶一类的酶，象微颗粒、胶体金一类的荧光物质或染料，或诸如此类的物质。利用上面的方法，本发明的诊断试剂能以更高的灵敏度和特异性检测乙肝抗体。
上面描述的本发明具有很多优点，包括提供了具有更高灵敏度和特异性的用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂，提供了其制备方法，并且提供了具有更高灵敏度和特异性的的用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断方法。
下面结合以下实施例对本发明作出更详细的描述，这些实施例应当认为仅仅是作为示范而不是对本发明的限制。实施例1 从血浆中纯化乙肝病毒表面抗原在冰浴中，将59ml饱和硫酸铵缓慢加入到140ml乙肝表面抗原阳性血液中并搅拌1小时。将溶液在离心机中以12,000rpm离心20分钟，将得到的200ml上清液转入冰浴的500-ml玻璃烧杯中。将80ml的饱和硫酸铵缓慢加入到上清液中并搅拌2小时。去除上清液后，加入30ml磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残余物质。使该溶液通过装有2L琼脂糖凝胶CL-4B(Pharmacia，瑞典)并用PBS平衡的柱。然后，以每次40ml收集洗脱液。用LG HBsAg-ELISA(LG household & health Care，韩国)测定每部分洗脱液的抗原效价以收集含有抗原的部分。向收集液中加入氯化铯(CsCl)以使最终浓度达到25％并溶解，然后在45,000rpm下超速离心48小时。收集含有抗原的部分后，将其在1L的PBS中透析3次并储存在冰箱中。实施例2 从重组酵母中纯化乙肝病毒表面抗原将70g表达乙肝病毒抗原的重组酵母，啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)pYLBC GAP-UB-HBs/AB110(于1996年1月5日保藏在韩国生物科学技术研究所典型培养物保藏中心，保藏号KCTC 8722P，参考韩国专利号177307)悬浮在细胞裂解液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.1M磷酸盐缓冲液，0.5％ Triton X-100，pH 7.0)，用Bead Beaor(Biospec Product，美国)玻璃珠裂解酵母细胞。将5N的盐酸(HCl)加入到该溶液中以调整pH到3.8，然后通过离心获得澄清的上清液。该上清液被滴定到pH为7.0后，向上清液中加入硅石粉(Aerosil-380)然后在冷室中搅拌12小时以使表面抗原固定在硅石上。通过离心收集固定了表面抗原的硅石并用PBS洗涤两次以去除没有吸附上的杂质。在50mM pH9.5的碳酸盐缓冲液中搅拌3小时以使乙肝表面抗原从硅石上解吸附，然后离心溶液以获得上清液。然后将上清液进行DEAE层析和凝胶过滤层析，从重组酵母中纯化表面抗原并用于分析。实施例3 制备同辣根过氧化物酶(HRP)结合的乙肝表面抗原在Centriprep(Amicon，美国)中将上面实施例2中制备的纯化的重组乙肝表面抗原溶液重复离心(3,000rpm，10分钟)浓缩到1ml。当用商业上可获得的BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度时，用PBS稀释浓缩物到最终蛋白浓度为10mg/ml。将10mg/ml的抗原溶液在1升pH9.6的0.01M的碳酸钠缓冲液中于4℃下透析1天。在透析过程中更换3次缓冲液。测量5mg的HRP并将其溶解于装有0.5ml蒸馏水的试管中。为氧化HRP，将42mg/ml的NaIO4100μl加入到0.5ml 10mg/ml的HRP溶液。并将试管用箔包裹后在室温下振荡30分钟进行氧化反应。在上述溶液中加入60μl1M的甘油以终止氧化反应。然后，将用箔包裹的试管在室温下振荡1小时以进行反应。将上述溶液在1L 0.01M pH9.6的碳酸钠缓冲液中于4℃下透析1天进行结合反应。在透析过程中更换3次缓冲液。透析后，将氧化的HRP溶液转入新的试管中，然后向新试管中加入上述10mg/ml的抗原溶液250μl。用箔包裹试管并于室温下振荡3小时以进行反应。在3小时的反应过程中，制备4mg/ml的NaBH4(即称量4mg的NaBH4并溶于1ml的去离子水中)。为了稳定HPR-抗原结合物，将40.8μl 4mg/ml的NaBH4溶液加入到试管中，将用箔包裹的试管在4℃下振荡反应2小时。为了将酶-抗原结合物从没有结合的酶中分离出来，使用在纯化结合物的前一天用PBS平衡的琼脂糖凝胶CL-6B柱(1cm×45cm，Pharmacia，瑞典)。以PBS作为缓冲液将结合物溶液通过上述柱。流速大约为0.4ml/min，每分钟收集一次。绘制了每一收集部分所代表的蛋白浓度的图形，收集相应于图中第一个峰的部分。用商业上可获得的BCA检测试剂盒测定收集部分的蛋白质浓度。向样品中加入最终浓度为1％的牛血清清蛋白(BSV)后在-20℃下储藏。实施例4 制备检测乙肝表面抗原抗体的96孔平板96孔平板(Nunc International，美国)的每一个用作酶免疫测定(EIA)的孔中分别加入100μl上述实施例1中源自血浆的纯化的乙肝表面抗原溶液。用0.1M的碳酸钠缓冲液(pH9.5)稀释抗原溶液以使蛋白质的最终浓度达到0.5μg/ml，然后使用。用密封带密封平板并放置在冷室中过夜以使抗原结合到孔的表面。然后，去掉密封带，也去除抗原溶液。在每个孔中加入250μl含有1％BSA的PBS，然后将平板在室温下放置2小时。去掉孔中的溶液，然后将平板置于室温下干燥以去潮。将平板和去湿剂放在密闭容器中并储存于4℃的冰箱中备用。实施例5 乙肝表面抗原抗体的检测用实施例1和2的方法获得血浆和重组抗原后，用实施例4的方法将血浆抗原或重组抗原固定到96孔平板上以制备每一个用于检测的平板，用实施例3的方法将辣根过氧化物酶(HRP)结合到血浆抗原或重组抗原上以检测HBsAg抗体。检测抗体的诊断实验以4种不同的组合进行，取决于固定到平板上的抗原和酶结合抗原的组合(A组固定到平板上的重组抗原和重组抗原-酶结合物；B组固定到平板上的重组抗原和血浆抗原-酶结合物；C组固定到平板上的血浆抗原和重组抗原-酶结合物；D组固定到平板上的血浆抗原和血浆抗原-酶结合物)。
将抗体阴性血浆样品和抗体阳性血浆样品各100μl加入到制备好的平板的各孔中。然后，将25μl的结合物溶液加入到每个孔中，然后轻轻敲打平板框使其很好地混和。将平板转入到反应器中在37℃下反应60分钟。
用每次300μl含有吐温20的PBS洗涤平板孔5次，然后向每个孔中加入100μl的底物溶液(100μg/ml的四甲基联苯胺，0.006％的过氧化氢，pH4.5的柠檬酸磷酸盐缓冲液)。在暗处显色30分钟后，向每个孔中加入100μl的反应终止液(2N的硫酸)。用96孔平板读出器(Molecular Devices，美国)在450nm下测定(参考波长620nm)吸光度。结果如下面的表1中所示。
表1

上面的表1的结果证明了如果用同一类型的HBsAg组合作为第一和第二抗原那么非特异性反应率高。另一方面，用不同类型的HBsAg作为第一和第二抗原的组合的B和C组则具有低的非特异性和高的阳性/阴性水平。实施例6 同商业上可获得的产品的灵敏度的比较在四种不同的商业上可获得的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂(对比例1-4)和按照实施例5(本发明的实施例)的C组诊断试剂之间进行灵敏度对比实验。在下面表2中，对比例1的诊断试剂来自美国Abbott实验室的AUSABXEIA；对比例2的诊断试剂是来自德国Dade Behring的EnzygnosteAnti-HBs micro；对比例3的诊断试剂是来自韩国Green Cross的GENEDIAAnti-HBs ELISA 3.0；而对比例4的诊断试剂是来自韩国DongA Pharmaceutical Co.的DongA Anti-HBs ELISA。
灵敏度实验中使用的抗体是WHO(世界卫生组织)的标准抗体。用1，2.5，5，10，50和100mIU/ml的WHO标准测定吸光度以确定灵敏度。结果如下面的表2所示。表2

一般通过给阴性值加0.05-0.07以测定产品的截流值。
如上面的表2所示，当每种抗体浓度分别超过10mlU/ml，5mlU/ml，10mlU/ml和10mlU/ml时，对比例1，2，3和4中的每种诊断试剂显示出阳性信号。相反，当抗体浓度超过2.5mlU/ml时，根据本发明实施例的诊断试剂显示阳性信号，所以它比其它对比例具有更高的灵敏度。
应当清楚上述实施例仅仅是为了作为示范而不是对本发明的限制。虽然根据上面的特定的实施方案对本发明进行了详细的描述，但仍然可能有其它的实施方案。因此在不脱离本发明的精神和范围的各种修改和变化对本领域技术人员来说应当是显而易见的并且这样的修改和改变会包括在下面的权利要求的范围中。
权利要求
1.一种使用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其特征在于该诊断试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原以及同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
2.根据权利要求1的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其中的诊断试剂含有源于血浆的表面抗原和重组表面抗原作为所述的一对乙肝表面抗原。
3.根据权利要求2的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其中所述的重组表面抗原包括从酵母或动物细胞中得到的重组表面抗原。
4.根据权利要求1的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其中的诊断试剂含有用不同纯化方法获得的互不相同的两种表面抗原作为所述的一对乙肝表面抗原。
5.根据权利要求1的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其中所述的固定在固体支持物上的第一抗原是从血浆中得到的表面抗原，而同标记物结合的第二抗原是重组表面抗原。
6.根据权利要求1的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其中所述的固定在固体支持物上的第一抗原是重组表面抗原，而同标记物结合的第二抗原是从血浆中得到的表面抗原。
7.根据权利要求1的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂，其中所述的标记物包括酶、放射性物质、微颗粒、染料或类似的物质。
8.一种使用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其特征在于该诊断试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原以及同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
9.根据权利要求8的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其中的诊断试剂含有源于血浆的表面抗原和重组表面抗原作为所述的一对乙肝表面抗原。
10.根据权利要求9的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其中所述的重组表面抗原包括从酵母或动物细胞中得到的重组表面抗原。
11.根据权利要求8的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其中的诊断试剂含有用不同纯化方法获得的互不相同的两种表面抗原作为所述的一对乙肝表面抗原。
12.根据权利要求8的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其中所述的固定在固体支持物上的第一抗原是从血浆中得到的表面抗原，而同标记物结合的第二抗原是重组表面抗原。
13.根据权利要求8的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其中所述的固定在固体支持物上的第一抗原是重组表面抗原，而同标记物结合的第二抗原是从血浆中得到的表面抗原。
14.根据权利要求8的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂，其中所述的标记物包括酶、放射性物质、微颗粒、染料或类似的物质。
15.一种使用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该方法包括将由固定在固体支持物上的第一抗原以及同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原包含在诊断试剂中的步骤。
16.一种使用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该方法包括将由固定在固体支持物上的第一抗原以及同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原包含在诊断试剂中的步骤。
17.一种使用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该诊断方法利用了由固定在固体支持物上的第一抗原以及同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
18.一种使用夹层免疫测定作为乙肝病毒抗体的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗体的诊断试剂的制备方法，其特征在于该诊断方法利用了由固定在固体支持物上的第一抗原以及同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。
全文摘要
本发明涉及一种使用夹层免疫测定作为乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的定量或定性的分析方法的用于乙肝表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断试剂，其特征是每种诊断试剂含有由固定在固体支持物上的第一抗原和同标记物结合的第二抗原组成的互不相同的一对乙肝表面抗原。本发明也提供了其制备方法。本发明进一步提供了用于乙肝病毒表面抗原抗体和乙肝病毒抗体的诊断方法。与单独使用一种乙肝病毒表面抗原的诊断试剂和方法相比较，本发明所提供的诊断试剂和方法的灵敏度和特异性有显著地提高。
文档编号G01N33/576GK1416463SQ01804338
公开日2003年5月7日 申请日期2001年1月31日 优先权日2000年2月1日
发明者林国镇, 吴宰勳, 孙美进, 柳承范, 李相翊 申请人:株式会社Lgci