专利名称：一种在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原的植物表达载体的制作方法
一种在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原的植物表达载体
为了培育具有疫苗功能的香蕉果实，我们将乙肝表面抗原基因构建含有果实特 异表达启动子和乙肝表面抗原基因的融合植物表达载体，转化香蕉。
本发,明提供的技术方案为 一种在果实中特异表达乙肝表面抗原的植物表达载 体，其特征在于载体中启动子为香蕉凝集素基因启动子，载体中目的基因为乙肝病毒 表面抗原基因。
上述在果实中特异表达人类乙肝表面抗原的植物表达载体的构建方法为乙肝 病毒表面抗原基因克隆、香蕉BanLec启动子序列PCR括增、香蕉BanLec启动子序 列与乙肝病毒表面抗原基因连接、连接产物测序、测序正确的连接产物通过酶切连 接反应与植物表达载体pCAMBIA2300构建果实特异表达乙肝表面抗原的融合植物表 达载体pCAMBIA2300HBS。
一. 乙肝表面抗原基因克隆
根据NCBI中登录的人类乙肝表面抗原基因HBsAg序列设计一对PCR引物(HBS1: ACCGAACA宁GGAGAACAC; HBS2: CGTTTGGTTTTATTAGGG)，以厦门大学赠送的含有乙肝表 面抗原基因的载体YEPFLAG-HBS质粒为模版，进行PCR反应，目的条带进行测序，与 NCBI报道序列99M同源。
对上述乙肝表面抗原基因的载体YEPFLAG-HBS质粒用EcoR I和BamH I进行双 酶切，回收目的基因片段。
二. 香蕉果实特异表达启动子序列克隆
根据本实验室克隆并已获得国家发明专利授权的Lectin启动子序列设计一对 PCR引物，并在5，和3，引物上分别引入HindIII和BamHl酶切位点(下划线部分)。 两引物序列分别为 BP1: GCAAGCTTGGTATCTATTTATGAAATC; BP2: GCGGATCCATCGACGTCAACACATAACG 。
以载体pBIL2载体为模版进行启动子序列扩增，回收乙肝表面抗原基因并用BamH I进行酶切，回收酶切产物。
三. 启动子Lectin2与HBsAg基因的连接及Lectin2-HBsAg片段的克隆、鉴定1. 将回收的经过酶切的Lectin PCR产物与回收的HBsAg基因片段进行连接在10 u L 体系中，分别加入Lectin和HBsAg回收产物各4 y L、T4DNA连接酶1 u L、连接Buffer lyL， 16。C连接12h。
2. 连接产物Lectin-HBsAg片段的克隆、鉴定以1 u L连接产物为模板，以BP1、 HBS2 和BP1、 BP2以及HBS1、 HBS2为引物进行PCR反应，回收以BP1、 HBS2为引物进行 PCR扩增所获得约1400bp的PCR产物，该产物定名为Lectin-HBsAg片段。
3. THL2 (Lectin-HBsAg片段PCR产物插入T-Vector)阳性克隆的筛选与鉴定
(1) THL2阳性克隆的PCR鉴定从Lectin-HBsAg PCR产物与T-Vector连接后的抗 性平板挑取单菌落，接种在含lOOug/mL安节青霉素的4 mL LB液体培养基中，培 养8h。提_取培养菌液的质粒，稀释100倍，取luL为模板，在25uL的体系中，分 别以BP1、 BP2和HBS1、 HBS2为引物进行PCR反应，鉴定所获得的阳性克隆定名为 THL2。
(2) 筛选的THL2阳性克隆中Lectin2-朋sAg片段插入T-Vector方向的判定将PCR 反应鉴定的阳性克隆的质粒用HindIII单酶切。将酶切鉴定的反向插入T载体的阳性 克隆送公司测序。
四. 重组植物表达载体pCAMBIA2300HBS阳性克隆的筛选与鉴定
从Lectin2-HBsAg片段与pCAMBIA2300连接后的抗性平板上挑取单菌落，接种 在含100ug/mL卡那霉素抗性的4 mL LB液体培养基中，培养8h。提取培养菌液的 质粒，在W5u L的体系中，分别以BP1、 BP2和HBS1、 HBS2为引物进行PCR反应。 将PCR所鉴定的阳性克隆再用EcoRl、 Hindin双酶切鉴定。将所鉴定的阳性克隆定 名为pCAMBIA2300HBS。
五、 结果分析
(一) 启动子Lectin2和HBsAg基因的获得用引物BP1、 BP2从pBIL2质粒上扩 增到Lectin2的特异性条带，大小约670bp，与预期大小相符。用EcoR I 、 BamH I 双酶切YEPFLAG-HBS质粒，切下约700bp的HBsAg基因片段，与预期大小相符。
(二) Lectin2-HBsAg片段的克隆与鉴定以lpL连接产物为模板，分别以BP1、 HBS2禾n BP1、 BP2以及HBS1、 HBS2为引物进行PCR反应，分别扩增出约1400bp、 670bp、 7Q0bp、的特异片段，说明Lectin2启动子与HBsAg基因已通过BamH I粘 性末端连成一个片段。利用DNA连接酶将该片段与T-Vector连接，经过鉴定插入有 目的片段的载体命名为THL2。
7(三) THL2重组质粒中Lectin-HBsAg片段插入T载体方向的判定用HindIII酶切 PCR所鉴定的阳性克隆，并进行序列测定，测序结果表明该克隆Lectin-HBsAg片段 与GenBaffl<中HBsAg(ABV21701)基因的序列同源性为98%，与BanLec启动子序列同 源性为99%，而且该片段两端引入了 HindIII和EcoR I酶切位点。
(四) 重组植物表达载体pCAMBIA2300HBS的构建与鉴定在25wL的体系中， 分别以BP1、 BP2和HBS1、 HBS2为引物进行PCR反应，扩增出的特异片段分别约 为670bp、 700bp，与预期大小相符。用EcoRl、 HindIII双酶切PCR所鉴定的阳性 克隆质粒THL2 DNA和载体pCAMBIA2300 DNA，回收1400bp的目的片段和酶切的 载体pCAMBIA2300片段，DNA连接酶对二者进行连接反应。连接产物转化大肠杆 菌,涂板鉴定，表明Lectin-HBsAg片段已正确插入载体pCAMBIA2300中，命名为 pCAMBIA2300鹏。
(五) 转基因香蕉分子检测及目的产物测定对获得的6株抗性植株经过PCR检测
证明4株抗性筛选的香蕉插入了目的基因，即外源的人类乙肝表面抗原(HBsAg)基
因已经插入到香蕉基因组中。提取转化香蕉植株果实总蛋白，用酶联免疫(ELISA)
检测HBsAg活性含量(ng/g鲜重)分别为50. 6、 41. 2、 48. 9和25. 3。实验结果证
实我们构建的植物表达载体能够在植物的果实中特异表达乙肝表面抗原。
具体实施方式
一种在果实中特异表达乙肝抗原的植物表达载体，其特征在于载体中启动子为 香蕉凝集素基因启动子。载体中目的基因为人类乙肝表面抗原基因。下面结合实施
方式对本发明进行详细说明
一、 材料
香蕉(MusaAAAgroupcv. Brazilian)由中国热带农科院生物技术研究所提供。
二、 方法
(一)凝集素基因启动子连接乙肝表面抗原基因植物表达载体 pCAMBIA2300HBS的构建
1、乙肝表面抗原基因PCR扩增
根据NCBI中登录的人类乙肝表面抗原基因HBsAg序列设计一对PCR引物 HBS1: ACCGAACATGGAGAACAC; HBS2: CGTTTGGTTTTATTAGGG)， 以厦门大学赠送的含有乙肝表面抗原基因的载体YEPFLAG-HBS为模版,进行PCR反应，取5.0ixl PCR扩增反应液进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm恒电压条件下电泳
30min后，通过凝胶成像系统观察并照相。获得一条长约700bp的条带，测序证明是
乙肝表面抗原基因。
2、香蕉果实特异表达启动子序列克隆
根抵本实验室克隆并已获得国家发明专利授权的Lectin启动子序列设计一对 PCR引物，并在引物上分别引入Hindin和BamHI酶切位点(下划线部分)。两引物序 列分别为
BP1: GCAAGCTTGGTATCTATTTATGAAATC; BP2: GCGGATCCATCGACGTCAACACATAACG 以载体pBIL2载体为模版进行启动子序列扩增。
采用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QAGEN)回收人类乙肝表面抗原基因和 Lectin启动子PCR产物。
3、 Lectin-HBsAg片段的克隆与鉴定 在lOpL体系中，分别加入Lectin和HBsAg回收产物各2pL、T4DNA连接酶l|aL、 连接Buf^rlpL， ddH20 2nL， 16。C连接12h。
Lectin启动子 2.0叱
乙肝表面抗原基因 2.0叱
T4DNAlagase 1.0礼
10 X lagation buffer 1.0 PL
ddH20_4.0 uL
Total 10.0 uL
以上述l^L连接产物为模板，以BP1、 HBS2和BP1、 BP2以及HBSl、 HBS2 为引物进行PCR反应，回收以BP1、 HBS2为引物进行PCR扩增所获得约1400bp 的PCR产物，该产物定名为Lectin-HBsAg片段。将Lectin-HBsAg片段与T-Vector 连接、转t七大肠杆菌涂平板。
从上述抗性平板中挑取单菌落，接种在含lOOu g/mL安苄青霉素的4 mLLB液体 培养基中，振荡培养8h。提取培养菌液的质粒，稀释100倍，取luL为模板，在 25uL的体系中，分别以BP1、 BP2禾QHBS1、 HBS2为引物进行PCR反应，分别扩 增到670bp和700bp目的条带,证明己成功将启动子与乙肝表面抗原基因连接，鉴定 所获得的阳性克隆定名为THL2。
4.重组植物表达载体pCAMBIA2300HBS的构建和鉴定将下列反应体系分别加入到两个无菌的1.5ml离心管中，37°C， 3h进行酶切。
THL2 DNA 3服
Buffer K 2，L
EcoR I 5服 HindIII BSA
ddH20_29.5叱
Total 50肌
取酶切产物20ul电泳检测，切下约1400bp的片段,回收目的片段。
将pCAMBIA2300载体DNA按照上述相同反应体系进行酶切,琼脂糖电泳检测， 回收载体片段。
将回收的1400bp片段和pCAMBIA2300载体片段，按照下列反应体系在16。C连 接12h。
1400bp片段 2.0叱
pCAMBIA2300载体片段 2.0 ML T4DNAlagase 1.0 PL
10 Xlagation buffer 1.0叱
ddH20_4.0 uL
Total 10.0 uL
连接产物转化大肠杆菌涂于抗性培养基上，挑取阳性克隆提取质粒DNA。按照下列反
应体系酶切鉴定
质粒DNA
Buffer K 2.5^
EcoR I 5.0ML
HindIII 5.0)^
BSA 5魁
ddH20_
Total 50.(mL
取酶切产物20ul电泳检测，切下约1400bp的片段，证明载体构建成功。 (二) pCAMBIA2300HBS载体导入农杆菌GV3103
10采用三亲交配法将含有Rifamycin (简称Rif)和Streptomycin (简称Str)抗性 的农杆菌GV3103、含有Kan抗性的大肠杆菌"协助"质粒PRK2013和含有Kan抗 性的带有pCAMBIA2300HBS植物表达载体的新鲜活化的大肠杆菌等体积混匀，涂 布于不含任何抗生素的YEP固体培养基上，28。C过夜培养。菌生长到0D6QQ为0.5 左右时，用接种环将长出的菌落转接到含有100mg/LKan、 25mgLRif和25 Str的 YEP固体培养基上，挑取三亲交配后经抗性培养长出的独立菌落，于三抗液体培养 基(Kanl00mg/L, Rif25mg/L, Str25mg/L)，摇菌提取质粒DNA，检测外源目的基因是 否导入农杆菌。
(三)GV3103介导的香蕉遗传转化
1. ^蕉愈伤组织的诱导及植株再生
取香蕉未成熟雄花花蕾，徒手剥去其外层苞片，至其长度约5cm时，用75%酒 精喷洒其表面消毒，迅速放入超净台中，用手术刀继续除去其外层苞片，至其最终 长度约3cm左右，再将其沿轴切成2-3mm的薄片，随后，将薄片平铺在香蕉愈伤组 织诱导固体培养基上。将培养的外植体转入28'C、 SHP生化暗培养箱中培养。
外植体在愈伤组织诱导培养基诱导下，经约5周时间，可在其表面观察到白色、 致密愈伤组织。此时的愈伤组织为非胚性愈伤组织,不能直接诱导出芽,需进一步诱导 为胚状体组织。诱导出的愈伤组织，转入胚状体诱导培养基中，光照强度20001x， 每天12h光/12h暗的光周期下培养，每25天转换一次培养基，两个月后可出现黄白 色或绿色球状胚状体，然后分化出丛生芽，待小芽有l-3cm高时，切下转移到生根 培养基上、诱导生根。小苗的根系发达后即可敞开瓶盖炼苗，1周后将小植株移植于营 养土。
2. 农杆菌培养
1) 从平板上挑取单菌落，接种于三抗YEP液体培养基中，28"培养24小时以上， 至OD600为0.6-0.8 ;
2) 将菌液分装于10mL离心管中，4'C 4000rpm，离心5min，弃上清；
3) 将菌体重悬于等倍体积1/2MS液体培养基中，附加100mg/L乙酰丁香酮 (Acetosyringone AS)及10%DMSO。
3. 侵染
将菌液倒入无菌小烧杯内，将受体材料放入菌液中，分别浸泡5min、 10min、 15min、 26min、 25min、 30min，取出薄片置于无菌滤纸上吸去多余菌液。
4. 共培养
将侵染过的薄片接种于MS改良培养基附加6-BA 1.0mg/L, NAA0.2mg/L的培养基上，在28""C暗培养2-6天。
5. 脱菌及诱导胚状体培养
将经过共培养的外植体转移到含有250mg/L羧节霉素(Carbenicillin)中脱菌分化 培养基上，继续在28"C生化培养箱中暗培养90-120天，待出现黄白色胚状体时，转 入1500Lx、 28'C光照条件下进行诱芽培养。
6. 生根选择培养
待丛生芽长到3-5cm时，切下单个芽转入1/2MS +1.0mg/LNAA附加15mg/L的 潮霉素的选择培养上进行生根选择培养。
7. 聚合酶链式反应扩增(PCR)法检测外源基因的整合
(1) CTAB法提取香蕉基因组DNA
1) 称取(X2g新鲜嫩叶于预冷的研钵中，用液氮研磨至粉末状。
2) 将未化解的粉末转入O. 5mlDNA提取缓冲液中，再加入SOuI50ul偏重亚硫酸钠 (1% Na2S205;^D25ul (3-巯基乙醇，小心研磨至粉末完全溶化。
3) 65。C水浴3 0min间或摇动。冷却至室温，加50 ul 20% PVP混匀，加等体积氯仿: 异戊醇(24: 1)混匀。室温，12,000rpm离心10min取上清至另一管。加入等体积 氯仿:异戊醇(24: l混匀。室温，12,000rpm离心10min取上清至另一管。
4) 加入2倍体积的无水乙醇(或等体积的异丙醇)和1/10倍体积3 mol/LNaAc(pH 5.2 于-20。C沉淀3 0min。
5) 4°C， 12,000 rpm离心10 min弃上清。用75%乙醇洗沉淀三次，吹干沉淀，溶于 20 ul TE(pH8.0)中。加入RNase 37。C放置30 min消化RNA。加水至总体积750 u 1 加入等体积Tris饱和酚pH^7.5混匀。4 。C ,12,000 rpm离心10 min取上清至另一管。 加入等体积的氯仿:异戊醇(24: O混匀。4 。C,12,000 rpm离心10 min取上清至另一管。
基因组DNA在TE(pH 8.0)中于-2(TC保存。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完 整性，用紫外分光光度计230mm、 260mm和280mm处的吸收值，检测DNA的含量 和纯度。
(2) PCR扩增目的基因
PCR反应
质粒pl301HBS为阳性对照、非转化植株为阴性对照。 Primer HBS1: ACCGAACATGGAGAACAC Pri證HBS2: CGTTTGGTTTTATTAGGG两引物间的核苷酸序列长度为703bp。
在200ul无菌硅化PCR薄壁管中，分别以被检香蕉总DNA、阴性对照非转化香蕉总DNA、阳性对照质粒pl301HBS为模板，并设置没有DNA的空白对照。向各管中依次加入下列试剂
Sample DNA(100ng)10 X BufferdNTP U0uMeach)Taq PolymerasePrimer HBS1 (10uM)Primer HBS2(10uM)ddH20
1.0叱2.5叱0.5叱0.5叱1.5 PL1.5 ML18 PL
Total
25 PL
混匀，瞬时离心，收集管壁上液滴至管底。PCR程序94 °C 5min
94 °C 40sec 、
53 °C72 。C72 °C
40sec40seclOmin
34循环
取3.(^1 PCR扩增反应液进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm恒电压30 min通过凝胶成像系统观察并照像。
8.香蕉蛋白抗原活性的ELISA检测
(1) 从香蕉果实中提取总蛋白
称取l.Og转化及非转化香蕉果肉，液氮下在研钵中迅速研碎，转入10ml离心管中，1: 3(w/v)加磷酸盐缓冲液混匀置液氮中，13000rpm离心30min ，吸取上清液，加入3倍体积冰冷的丙酮，-20°(:放置4小时，13000rpm离心30min，沉淀用冰冷丙酮洗3次，空气中吹干，加入100ul提取缓冲液溶解，-20°C保存备用(Masonetal. 1992)。
(2) ELISA检测(HBsAg酶联检测试剂盒)
1) 将试剂盒从4'C中取出，室温平衡30min。
2) 加样分别在相应孔中加入待测样品、阴、阳性对照各50pl。3) 加酶分别在每孔中加酶联试剂l滴(5(^1)，在旋涡混合器上混匀。
4) 温育置37。C温育30min。
5) 洗涤将孔内液体甩干，PBST洗涤液充分洗漆5次，最后一次扣千。
6) 显色每孔加显色剂A、 B各l滴(50^1)，在旋涡混合器上混匀置37'C，显色15min。
7) 终止每孔加终止液l滴(50W)，轻拍混勾。
8) 测定用酶标仪双波长450nm和630nm测定各孔OD值。(3)香蕉果实中乙肝表面抗原(HBsAg)的测定
将初次粗测后结果呈阳性的株系的蛋白粗提液稀释成l、 2、 4、 10倍。HBsAg抗原的标准蛋白浓度为4ng/ml。当样品稀释至OD值和标准样相同或相近时，粗提液中蛋白含量为4ng/ml。再根据取样量，计算出HBsAg的相对含量。
1权利要求
1.一种在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原的植物表达载体，其特征在于载体中启动子为香蕉凝集素基因启动子。载体中目的基因为乙肝病毒表面抗原基因。
2. 根据权利要求1所述的用香蕉凝集素基因启动子替代植物表达载体pBI121 上的CaMV35S启动子。
3. 根据权利要求1要求所述的目的基因为乙肝病毒表面抗原基因,其特征在于用 乙肝病毒表面抗原基因置换权利要求2所述载体中的gus泰因，构建成在香 蕉凝集素基因启动子下游含有乙肝病毒表面抗原基因的果实特异表达乙肝表 面抗原的植物表达载体。
全文摘要
本发明涉及一种在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原的植物表达载体，该载体利用香蕉果实特异表达的凝集素基因启动子取代植物表达载体pBI121上的组成型35S启动子，以乙肝病毒表面抗原基因置换pBI121上的gus基因，构建重组植物表达载体pCAMBIA2300HBS。利用农杆菌介导法将该载体转化香蕉，PCR检测证明外源基因已插入香蕉基因组中；ELISA检测证明香蕉凝集素基因启动子驱动乙肝病毒表面抗原基因在香蕉果实中特异表达。该载体的获得，为在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原提供了有利的工具，特别是利用该载体生产乙肝口服疫苗奠定了基础。因此，该载体在今后的转基因研究中具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/82GK101643748SQ20091016493
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月24日 优先权日2009年7月24日 公开号200910164933.发明者刘菊华, 张建斌, 徐碧玉, 伟 胡, 谭光兰, 贾彩红, 金志强 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所;农业部热带作物生物技术重点开放实验室;中国热带农业科学院海口实验站 被以下专利引用 (1),