一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用。本发明运用噬菌体表面呈现技术，采集乙肝疫苗免疫后具有高滴度表面抗体者的外周血淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体命名为HBFab21。HBFab21轻链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明不仅为阻止乙肝病毒感染，同时也为其治疗的研究奠定了基础；以此为基础，可以获得具有中和乙肝病毒感染的抗体产物，制成临床上用于乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的应用。
【专利说明】一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程抗体技术，特别是涉及一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体；本发明还涉及该抗体在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]乙肝病毒感染是世界范围内的一个主要的公共健康问题，急性乙型肝炎过后有5% - 10%的持续HBV感染发展为慢性肝病包括慢性活动性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌。据估计全世界每年有500，000到1，000,000人死于与HBV有关的各种肝脏疾病。我国是肝炎大国，乙肝病毒携带率为人口的9.75%。全世界乙肝病毒感染者4.2亿，我国约有1.3亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒的传播方式大致可分为垂直传播和水平传播两大类。垂直传播指HBV携带者母亲对胎儿的传播，绝大部分发生在妊娠的最后三个月。婴儿一旦感染乙肝病毒，他们中85% — 90%会发展成慢性带乙肝病毒状态，其中25%于成年后将死于肝硬化和肝癌。99年的研究显示，我国乙肝病毒感染者也就是乙肝病毒携带者和慢性乙型肝炎中有80%-85%来源于父母在生殖生育过程中的感染。水平传播可以概括为围产期传播、家庭内传播、医源性传播和性传播，而其中围产期传播较严重。
[0003]关于慢性乙型肝炎的治疗目前还没有一个令人满意的方法，对于肝功能有损害的病人通过保肝治疗绝大部分可以使肝功能得到恢复，但要清除乙肝病毒却是十分困难的。乙肝病毒慢性携带者更是如此。其原因主要是免疫耐受，也就是乙型肝炎病毒感染者的体内免疫系统对乙型肝炎病毒不能产生有效的清除作用。免疫耐受的原因是人体感染乙肝病毒的时间较早，普遍认为是在3岁以前感染的。
[0004]在没有找到合适的治疗方法之前，阻止病毒感染就显得十分重要。目前对于乙肝病毒的预防有主动免疫和被动免疫两种。主动免疫即注射乙肝疫苗，自70年代末首次出现血源性乙肝疫苗，经过几十年的发展到现在已有了成熟的基因工程疫苗。乙肝疫苗的免疫效果好，是预防乙型肝炎传播的有效手段之一。被动免疫为注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，主要用于阻断母婴传播(与乙肝疫苗联合使用)和意外事故的被动免疫。有研究表明采用乙肝疫苗联合HBIG阻断母婴传播效果优于单用疫苗者并且能减少慢性感染的比例。目前HBIG均来源于人抗一 HbsAg的阳性血清，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。如同当初血源性疫苗向基因工程疫苗的转变，现在也急需用基因工程乙肝表面抗体替代血源性HBIG，嗜菌体抗体库技术为这一问题的解决另辟蹊径。
[0005]含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法，但缺乏特异性和均一性。继而建立的B淋巴细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb),其特异性强，性质均一，易于大量生产。然而McAb多为鼠源性，鼠源McAb的异源性反应极大地限制了 McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白(Vaccinia immune globulin, VIG)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清,从获得阳性血清到通过安全性检测均需花费大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。因此使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，而人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。
[0006]80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(Antibody Drug)。如同当初血源性疫苗向基因工程疫苗的转变，现在也急需用基因工程抗体替代血源性VIG，如通过嵌合抗体技术(Boulianne GL, Hozumi N, Shulman MJ.Production of functionalchimaeric mouse/human antibody.Nature.1984 Dec 13-19;312(5995):643-6;MorrisonSL, Oi VT.Transfer and expression of immunoglobulin genes.Annu RevImmunol.1984; 2:239-56.)、人源化抗体技术(Jones PT, Dear PH, Foote J, NeubergerMS, Winter G., Replacing the complementarity-determining regions in a humanantibody with those from a mouse.Nature.1986 May 29-Jun 4; 321 (6069):522-5.)、携带人单抗的转基因小鼠技术(Green, L.L.et al., Antigen-specific human monoclonalantibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs.NatGenet.1994 May; 7 (I): 13-21.)、异体杂交瘤技术(James, K.et al.Human monoclonalantibody production.Current status and future prospects.J Tmmunol Methods.1987Jun 26; 100 (1-2): 5-40.)、曬菌体表面展不技术(Barbas, C.F.et al.Assembly ofcombinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site.Proc NatlAcad Sci USA.1991 Sep 15; 88 (18):7978-82.)等产生人源化抗体，现已成为国内外研究的重大方向，并正在逐步走向成功。
【发明内容】
[0007]本发明的第一个目的在于提供一种人源抗乙肝表面抗原基因工程抗体及其活性片段。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。
[0009]本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的应用。
[0010]本发明运用噬菌体表面呈现技术，采集乙肝疫苗免疫后具有高滴度表面抗体者的外周血淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体命名为HBFab21。[0011]这株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(⑶Rs)特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合乙肝病毒的功能性抗体。它们特异性识别乙肝表面抗原，且均针对“a”决定簇，与乙肝病毒表面抗原具有明显的酶联免疫(ELISA)反应和较高的亲和力，有阻止HBV感染敏感细胞的中和功能。[0012]HBFab21特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗乙肝病毒表面抗原抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国乙肝疫苗免疫者外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，HBFab21隶属于抗体重链家族VH4，抗体轻链家族VK3。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定发明中抗体的抗原结合特征和抗乙肝病毒功能特征。决定每株中和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸详细序列及其比较结果如表1所示:[0013]表1抗体轻链和重链可变区氨基酸详细序列及其比较结果
[0014]
【权利要求】
1.一种人源抗乙肝表面抗原基因工程抗体及其活性片段，其特征在于，该人源抗乙肝表面抗原基因工程抗体Fab段命名为HBFab21，HBFab21轻链可变区的CDRl为QSVSSN、CDR2为 GAS、CDR3 为 QQYNNWPQT，HBFab21 重链可变区的 CDRl 为 SITGSSYY、CDR2 为 IYSTSGTT、CDR3为ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV ;优选地，HBFab21轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如权利要求1所述的抗体及其活性片段，其特征在于，其氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗体及其活性片段，其特征在于，在非高变区将具有类似性质的氨基酸进行替换，如将HBFab21的轻链VL序列的第14位的Gly替换为Ala。
4.如权利要求1所述的抗体及其活性片段，其特征在于，将所述Fab段的轻链可变区和重链可变区进行重组，所获得分子量更小的单链抗体。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体及其活性片段的编码基因。
6.如权利要求5所述的编码基因，其特征在于，编码HBFab21轻链可变区的基因序列如SEQ ID N0.3所示，其重链可变区的基因序列如SEQ ID N0.4所示。
7.包含权利要求5或6所述的编码基因的载体。
8.包含权利要求5或6所述的编码基因的宿主细胞。
9.权利要求1-4任一项所述的抗体及其活性片段、权利要求5或6所述的编码基因、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主细胞在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的应用。
10.制备权利要求1-4任一项所述的抗体及其活性片段的方法。
【文档编号】C12N5/10GK103588874SQ201310557164
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】梁米芳, 毕胜利, 孙丽娜, 郭瑜, 刘洋, 张福顺, 李川, 李德新 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所