一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒及其应用，属于疾病检测产品领域。本发明的试剂盒包含β-地中海贫血基因五种常见突变位点的扩增引物对，还包括2xconc.Master?Mix、镁离子。使用该试剂盒对分析样本进行PCR扩增，然后进行高分辨率熔解曲线分析，与五种突变位点的阳性熔解曲线进行比对从而确定此五个位点是否存在突变以及突变的类型。该试剂盒可以同时检测β-地中海贫血的五个突变位点包括-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-Ⅱ-654中的一个或者一个以上组合，无需特异性探针和测序，所需样品量少，其检测快速、准确、成本低，更适用于大规模检测。
【专利说明】一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于疾病检测产品领域，特别涉及一种快速检测五种β -地中海贫血突变的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]β_地中海贫血是由于珠蛋白基因突变导致珠蛋白肽链合成障碍为特征的遗传性溶血性贫血，为我国南方各省发病率最高、影响最大的遗传病之一。迄今为止，全世界已报道200多种β-珠蛋白基因突变，而我国也发现了 30多种，其中-28、⑶17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654这五种突变占了我国β -珠蛋白基因突变的90%以上。β-地中海贫血患者根据珠蛋白链合成程度不同其临床轻重不一:轻型患者无症状或仅有轻度贫血，临床容易漏诊；中间型可有中度贫血，脾脏轻或中度大；重型患者表现为严重的慢性进行性贫血，需依靠输血和去铁治疗维持生命，致死性极高，预防还是最佳的应对措施，临床上主要通过对可疑β -地中海贫血患者进行基因诊断(包括产前诊断)来达到控制重型地中海贫血患儿出生的目的。
[0003]目前最常用的基因诊断方法是反向斑点杂交技术和DNA直接测序法。反向斑点杂交技术能够一次性检测β -珠蛋白基因的17个常见突变位点，但是该法耗时长，操作繁琐，检测结果受PCR反应体系、缓冲液、DNA纯度等因素影响，容易造成误诊甚至漏诊，而DNA直接测序法仪器试剂成本较高、检测周期长，对杂合突变、富集GC的样本很难一次检测获得准确数据，也有报道将TaqMan探针法、基因芯片技术应用于β -地中海贫血基因突变的检测，然而，这些技术操作复杂、实验需要精密仪器和特殊的标记引物、试剂耗材成本昂贵，在临床上无法普遍推广应用。
[0004]高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是最近兴起的用于突变扫描和基因分型的技术，其基本原理为利用双链DNA受热解离成为单链的核酸物理特性，采集解链时释放的荧光信号绘制熔解曲线，再通过熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异。HRM具有高灵敏度、特异性好、操作简单、完全闭管操作等优点，其检测不受突变碱基位点和种类的限制。
[0005]申请号为201210382305.4的中国专利公开了 “HRM法检测突变型a-地中海贫血基因的试剂盒和方法”，该试剂盒可同时检测6种突变型a-地中海贫血，目前国内尚未有关于应用高分辨率熔解曲线(HRM)检测β -地中海贫血基因突变方面的专利报道。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒。所述五种β-地中海贫血突变指的是_28(c.-78A>G)、⑶17(c.52A>T)、CDs41/42 (c.126_129delCTTT)、CDs71/72 (c.216_217insA)、IVS-11-654(c.316_197C>T)。
[0007]本发明的另 一目的在于提供应用上述试剂盒进行快速检测五种β -地中海贫血突变的方法。
[0008]本发明的再一目的在于提供所述试剂盒的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种快速检测五种地中海贫血突变的试剂盒，包括-28位点引物对、⑶S41/42和⑶S71/72位点引物对、⑶17位点引物对和IVS-11-654位点引物对:
[0010]-28位点引物对:
[0011]上游引物为:5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3’ ；
[0012]下游引物为:5’-ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGT-3’ ；
[0013]CDs41/42 和 CDs71/72 位点引物对:
[0014]上游引物为:5’-GAAGACTCTTGGGTTTCTGA-3’ ；
[0015]下游引物为:5’-AGAAAACATCAAGGGTCCCA-3’ ；
[0016]⑶17位点引物对:
[0017]上游引物为:5’-AGACACCATGGTGCACCTGAC-3’ ；
[0018]下游引物为:5’-GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3’ ；
[0019]IVS-11-654 位点引物对:
[0020]上游引物为:5’-GTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’ ；
[0021]下游引物为:5’-GGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3’。
[0022]所述的快速检测五种β -地中海贫血突变的试剂盒优选为将-28位点引物对及⑶S41/42和⑶S71/72位点引物对按1:1的比例在放置在一起，用于同一个PCR体系中进行反应，CD17位点引物对、IVS-11-654位点引物对分别放置，分别用于另外的PCR体系中反应；3个反应体系即可检测-28、CDs41/42、CDs71/72、CD17和IVS-11-654五个突变位点。
[0023]所述的快速检测五种β -地中海贫血突变的试剂盒还包含Taq DNA聚合酶、dNTP、染料、MgCl2、PCR缓冲液、水和对照模板；
[0024]所述的染料优选为SYBR Green I ；
[0025]所述的水为能用于PCR级别的水，优选为双蒸水或超纯水；
[0026]所述的对照模板包括正常样本和已知阳性对照突变位点样本；
[0027]所述的正常样本为经测序证实的无β -珠蛋白基因突变的人DNA模板样本；
[0028]所述的已知阳性对照突变位点样本为-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654位点突变的纯合子及杂合子的人的阳性DNA模板；
[0029]所述的快速检测五种地中海贫血突变的试剂盒优选含有-28位点引物对、CDs41/42和CDs71/72位点引物对、CD17位点引物对、IVS-11-654位点引物对、2倍浓度的Master Mix (含有染料SYBR Green I )、MgCl2、水和对照模板;
[0030]所述的2倍浓度的Master Mix即为罗氏制药有限公司生产的LightCycle:1 R 480High Resolution Melting Master 中的浓度为 2 X conc.的 Master Mix，其中含有 laq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP和染料；
[0031]所述的MgCl2的浓度优选为25mM。
[0032]一种应用上述试剂盒进行快速检测五种β -地中海贫血突变的使用方法，包括以下步骤:
[0033](1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；[0034](2)配制反应体系，具体如下:取3个PCR反应管，PCR反应管I中加入_28位点的引物对及CDs41/42和CDs71/72位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反应管2中加入CD17位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反应管3中加入IVS-11-654位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl2和水；
[0035](3)分别用步骤(2)配制的反应体系进行PCR扩增，分别得到相应的PCR产物，同时扩增含有对照模板的反应体系；
[0036](4)将步骤(3)得到的PCR产物使用LightCycler ?, 480进行高分辨率熔解曲线分析(HRM)；
[0037](5)结果判断:以无β_珠蛋白基因突变的正常样本曲线作为基线，得到对应的熔解曲线图，与阳性对照突变位点熔解曲线图进行比对从而确定是否存在突变，熔解曲线形状与已知阳性对照突变位点熔解曲线图不一致的，需重新检测或者测序明确基因型；
[0038]步骤(1)中所述的样本为外周血、绒毛、羊水或脐血样品中的一种；
[0039]步骤(2)中所述的反应体系中各组分的浓度为:各引物:0.I~0.2ymol/L ；DNA模板:1~2ng/y L ;镁离子:2.5mmol/L，剩余体积用双蒸水补足，反应体积优选为20 μ L ;
[0040]步骤(2)中所述的PCR反应管I中优选为含有-28位点引物浓度为0.1 μ mol/L,CDs41/42位点和CDs71/72位点引物浓度为0.1 μ mol/L ;所述的β -PCR反应管2中优选为含有⑶17位点引物浓度为0.1 μ mol/L ;所述的β-PCR反应管3中优选为含有IVS-11-654位点引物浓度为0.1 μ mol/L；
[0041]步骤(3)中所述的PCR扩增反应的条件优选为:95°C预变性8~lOmin，然后95°C变性15~30s，54~58°C退火15~30s，72°C延伸15~30s，35~45个循环；
[0042]步骤(4)中所述的使用LightCycler ? 480进行高分辨率熔解曲线分析的条件为95°C变性I~3min，40°C复性I~3min，然后以0.1~0.5°C /s的速度从60°C升温至90°C收集熔解曲线数据进行分析；所述的熔解曲线分析的操作依照LightCycler ?_ 480用户手册标准操作程序进行；
[0043]所述试剂盒应用于临床尤其是产前诊断五种β -地中海贫血基因突变。
[0044]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0045](I)本发明能同时对五种β-地中海贫血基因突变进行检测,所需样本量少且来源广泛，外周血、绒毛、羊水和脐血样品都可以进行诊断。
[0046](2)本发明通过通过3个反应体系即可检测-28、CDs41/42、CDs71/72、CD17和IVS-11-654五个突变位点，极大的简化了检测反应的步骤。
[0047](3 )本发明快速、高通量、高灵敏度，可以在24小时内完成96/384孔板的PCR产物检测。
[0048](4)本发明借助于LightCycler R 480荧光定量PCR设备进行结果分析，自动化程
度高，重复性好。
[0049](5)本发明检测成本低，完全闭管操作，解决了 PCR产物污染问题，适用于大规模检测。
[0050](6)加入的染料不影响后续的测序。
[0051](7)选用的五个突变位点覆盖了中国β-珠蛋白基因突变位点的90%以上。由于每段DNA在长度、GC含量及碱基的互补性等方面存在差异，因此每个DNA片段都有独特的熔解曲线，根据每个位点的独特熔解曲线形状来判断是否存在突变，诊断的准确率可达到99%。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1是本实验的操作流程示意图。
[0053]图2是本发明实施例对羊水样品行HRM检测发现无CD17位点突变的熔解曲线图。
[0054]图3是本发明实施例对羊水样品行HRM检测发现CD17位点杂合突变的熔解曲线图。
[0055]图4是本发明实施例对羊水样品行HRM检测发现CD17位点纯合突变的熔解曲线图。
[0056]图5是本发明实施例对羊水样品行HRM检测发现异常曲线的熔解曲线图。
[0057]图6是-28杂合子、-28纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。
[0058]图7是⑶17杂合子、⑶17纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。
[0059]图8是⑶S41/42杂合子XDs41/42纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。
[0060]图9是⑶S71/72杂合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。
[0061]图10是IVS-11-654杂合子、IVS-11-654纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。`
【具体实施方式】
[0062]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0063]实施例
[0064]对羊水样品进行地中海贫血五种突变位点检测(操作流程示意图见图1)，具体步骤如下:
[0065](I)羊水标本放入离心机离心，2000rpm离心10分钟；把标本上清倒入玻璃管，剩下大概200 μ L沉淀，用滤芯吸头移液到1.5mLEP管准备DNA提取。
[0066](2)使用 DNA 提取试剂盒(Quick Gene SP kit DNA whole blood, FUJIFILM)进行DNA 提取得到基因组 DNA。DNA 浓度使用 30ng/ μ L, 280/260>l.8，230/260>2.5。
[0067](3)进行LightCycler ?, 480荧光定量PCR扩增，在PCR反应管1、PCR反应管2、PCR反应管3中进行，同时检测一例经测序证实的无β -珠蛋白基因突变的正常样本以及-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654位点突变的纯合子及杂合子阳性DNA作为对照。PCR反应体系(总反应体积20 μ L)如下表1~3所示:
[0068]表1 PCR反应管I的体系成份[0069]
【权利要求】
1.一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于包括-28位点引物对、CDs41/42和CDs71/72位点引物对、CD17位点引物对和IVS-11-654位点引物对:-28位点引物对: 上游引物为:5’ -CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3’ ；下游引物为:5’ -ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGT-3’ ；CDs41/42和CDs71/72位点引物对:上游引物为:5’ -GAAGACTCTTGGGTTTCTGA-3’ ；下游引物为:5’ -AGAAAACATCAAGGGTCCCA-3’ ；⑶17位点引物对:上游引物为:5’ -AGACACCATGGTGCACCTGAC-3’ ；下游引物为:5’ -GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3’ ；IVS-11-654位点引物对:上游引物为:5’ -GTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’ ；下游引物为:5’ -GGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3’。
2.根据权利要求1所述的快速检测五种β_地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒将-28位点引物对及⑶S41/42和⑶S71/72位点引物对按1:1的比例在放置在一起，⑶17位点引物对、IVS-11-654位点引物对分别放置。
3.根据权利要求1所述的快速检测五种β_地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒还包含Taq DNA聚合酶、dNTP、染料、MgCl2、PCR缓冲液、水和对照模板；所述的染料为SYBR Green I ；所述的水为双蒸水或超纯水；所述的对照模板包括正常样本和已知阳性对照突变位点样本。
4.根据权利要求3所述的快速检测五种β_地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于:所述的正常样本为经测序证实的无珠蛋白基因突变的人DNA模板样本；所述的已知阳性对照突变位点样本为-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654位点突变的纯合子及杂合子的人的阳性DNA模板。
5.根据权利要求1所述的快速检测五种β_地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于:含有-28位点引物对、CDs41/42和CDs71/72位点引物对、CD17位点引物对、IVS-11-654位点引物对、2倍浓度的Master Mix、MgCl2、水和对照模板；所述的2倍浓度的Master Mix为罗氏制药有限公司生产的LightCycler R 480HighResolution Melting Master 中的浓度为 2 X conc.的 Master Mix,其中含有 Taq DNA 聚合酶、PCR缓冲液、dNTP和染料。
6.一种应用上述试剂盒进行快速检测五种β_地中海贫血突变的使用方法，其特征在于包括以下步骤:(1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；(2)配制反应体系，具体如下:取3个PCR反应管，PCR反应管1中加入-28位点的引物对及CDs41/42和CDs71/72位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反应管2中加入CD17位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反应管3中加入IVS-11-654位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl2和水；(3)分别用步骤（2)配制的反应体系进行PCR扩增，分别得到相应的PCR产物，同时扩增含有对照模板的反应体系；(4)将步骤（3)得到的PCR产物使用LightCycler_? 480进行高分辨率熔解曲线分析；(5)结果判断：以无β_珠蛋白基因突变的正常样本曲线作为基线，得到对应的熔解曲线图，与阳性对照突变位点熔解曲线图进行比对从而确定是否存在突变，熔解曲线形状与已知阳性对照突变位点熔解曲线图不一致的，需重新检测或者测序明确基因型。
7.根据权利要求6所述的应用试剂盒进行快速检测五种β-地中海贫血突变的使用方法，其特征在于：步骤（1)中所述的样本为外周血、绒毛、羊水或脐血样品中的一种；步骤（2)中所述的反应体系中各组分的浓度为：各引物：0. 1~0. 2ymol/L ;DNA模板：1~2ng/ μ L ;镁离子：2. 5mmol/L,剩余体积用双蒸水补足,反应体积为20 μ L。
8.根据权利要求7所述的应用试剂盒进行快速检测五种β-地中海贫血突变的使用方法，其特征在于：步骤（2)中所述的PCR反应管1中含有-28位点引物浓度为0. lymol/L，⑶s41/42位点和⑶S71/72位点引物浓度为0. 1 μ mol/L ;所述的PCR反应管2中含有⑶17位点引物浓度为0. lymol/L;所述的PCR反应管3中含有IVS- II -654位点引物浓度为0.1 μmol/L。
9.根据权利要求6所述的应用试剂盒进行快速检测五种β_地中海贫血突变的使用方法，其特征在于：步骤（3)中所述的PCR扩增反应的条件为：95°C预变性8~lOmin，然后95°C变性15~30s，54~58°C退火15~30s，72°C延伸15~30s，35~45个循环；步骤（4)中所述的使用Lig`htCycler ? 480进行高分辨率熔解曲线分析的条件为95°C变性1~3min，40°C复性1~3min，然后以0. 1~0. 5°C /s的速度从60°C升温至90°C收集熔解曲线数据进行分析；所述的熔解曲线分析的操作依照LightCycler ? 480用户手册标准操作程序进行。
10.权利要求1~5任一项所述的快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒在产前诊断五种地中海贫血基因突变中应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103602736SQ201310556987
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】尹爱华, 张彦, 何天文, 陈汉彪, 杜丽 申请人:广东省妇幼保健院