专利名称：一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HB sAg)抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其制备方法，特别是一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)单链抗体及其制备方法，属于生物制品领域。
背景技术：
乙型肝炎是一种世界范围的流行性传染病，全球乙肝病毒携带者有三亿人之多，其中我国乙肝病毒携带者有一亿多，乙型肝炎患者一千多万。据世界卫生组织统计，全世界每年死于该病者多达一百多万，临床缺乏有效的治疗方法。由于目前还没有治疗乙型肝炎的有效手段，因此预防其感染在控制该病的传染上显得尤为重要，使预防成为防治乙型肝炎的重点。
血源性抗乙肝表面抗原抗体可用于乙型肝炎的被动免疫，可有效地预防乙肝病毒急性感染。能与乙肝病毒表面抗原结合并阻止其侵袭肝细胞的乙肝表面抗体或其抗体片段是唯一能用于紧急预防的被动免疫生物制品，单独或与疫苗制成的免疫复合物还可防止乙型肝炎的母婴传播。但是，血源性抗体的来源却相当有限且具有潜在的传染性，给它的应用带来限制。开发重组人源性抗HBsAg抗体可以弥补血源性抗体的缺陷。基因工程生产的人源性抗体或其单链抗体可代替血源性抗体在临床上具有防治乙型肝炎病毒的很好的应用前景，如防治新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播、肝脏移植病人的病毒控制和用于制备治疗性乙肝疫苗等。
对于基因工程人乙肝表面抗体的研究，目前国内外均应用噬菌体展示文库技术获得其Fab段(抗原结合段，fragment of antigen binding)基因，然后应用大肠杆菌表达，但其问题是Fab抗体呈双链，在大肠杆菌中进行分泌型表达，表达量很低，进行包涵体表达又难以复性。单链抗体(Single chain Fv，ScFv)是由抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的1/6，分子量约为27KDa，它具有以下优点(1)能较好保持亲本抗体结合抗原的特性和功能，而抗原性大大减少；(2)分子量小，能穿透血管壁，容易进入实体瘤的微循环；(3)没有FC片段(可结晶段，fragmentof crystallizable)，不能与非靶细胞的FC受体结合，有利于作为导向作用的载体；(4)能与分布于病毒表面的抗原结合，有利于抗病毒治疗；(5)在单链抗体基因末端可以接上适宜的酶、免疫毒素细胞因子等效应分子基因构建双功能单链抗体，用于肿瘤及其它疾病的诊断与治疗；(6)易于基因操作和基因工程大量生产。单链抗体可在多种不同的表达系统中进行表达，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫等表达系统。其中最常见的是大肠杆菌和酵母表达系统。使用大肠杆菌作为宿主，易于基因工程操作和发酵生产且成本低廉。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg单链抗体，所述抗体具有较强的HBsAg结合活性和抗原特异性和结合乙肝表面抗原的能力。
本发明的另一目的在于提供一种制备用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg单链抗体的方法，所述方法采用原核表达载体pQE40，转化大肠杆菌M15[pREP4]，表达量高，表达出的抗体片段与原始基因序列推导出的一致，适合于大规模工业化生产。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg单链抗体，具有下述序列结构蛋白质的氨基酸序列结构MetGlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArgSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerArgHisGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaValIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysAlaGlyGlyAlaAlaAlaGlyThrGlyThrAlaTyrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuThrGlnSerProGlyThrLeuSerLeuSerSerGlyGluGlyAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerAsnGlyGlnLeuThrTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIleTyrGlyAlaSerSerArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerArgLeuGluProGluAspPheAlaValTyrTyrCysHisGlnTyrAspGlySerProGluThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleAsnArg蛋白质的基因序列结构GAATTCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTA
TATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGAGGGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGTAGCGACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTNTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACGGCCAATTAACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGATAAAAGCTT本发明所述的用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg单链抗体的制备方法可以通过以下方法实现利用噬菌体展示技术克隆人源性HBsAg抗体的Fab段基因，在大肠杆菌内表达；通过重叠PCR获得抗HBsAg单链抗体基因，并将其插入原核胞质表达载体，在大肠杆菌中获得高效表达，然后对重组单链抗体进行纯化和复性。
其中通过噬菌体展示技术获得抗体片段基因所采用的方法为对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血，分离单核细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA，用设计好的引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链(L链)基因和重链(H链)Fd(Fab中约1/2H链部分，约占225个氨基酸残基)的片段基因，分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒；用该质粒转化XL1-Blue，重组菌体在SB培养基中培养，然后加入噬菌体VCSM13培养，其上清即为噬菌体抗体库。
其中，抗乙肝表面抗原单链抗体(以下简称为ScFv)基因的克隆，原核表达载体构建中的引物设计为上游引物P15′-TTG GAT CCC AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3′下游引物P25′-GCA AGC TTT TAT CGA TTG ATT TCC ACC TTG GT-3′以pGEM3zf-ScFv为模板，在PCR反应缓冲液中加入DNA聚合酶反应，反应产物用琼脂糖凝胶电泳回收。将PCR产物回收酶切，插入经同样条件酶切过的pQE40载体上，获得重组表达质粒pQE-ScFv，进行序列测定。
所述的PCR反应缓冲液可为500mM KCl，100mM Tris.Cl PH8.3，20mM MgCl2。
其中人源性抗HBsAg单链抗体基因插入原核胞质表达载体，在大肠杆菌中获得高效表达的过程包括重组单链抗体的诱导表达、细菌细胞的裂解和包涵体的后处理。
重组单链抗体的诱导表达采用的方法为重组质粒pQE40-ScFv转化表达宿主菌M15[pREP4]，挑选单克隆接种LB培养基，37℃震荡培养过夜，转入含同样抗生素的LB中，37℃剧烈振摇至OD值为0.8～1.0，加入IPTG继续培养5小时，离心收集菌体。电泳鉴定目的蛋白表达量，目的蛋白表达量为20-30％。
细菌细胞的裂解方法为离心收获菌体，加入裂解缓冲液洗涤一次后弃上清，再加入同样体积的TE，并加入溶菌酶，混匀后置-20℃保存12-48小时，冻融，冰浴超声、离心收集包涵体。
冻融可以置于冰箱中低温融化。
包涵体的后处理主要为包涵体的洗涤，其步骤如下(1)以TE重悬包涵体，离心洗涤至少一次，弃上清，余下部分为包涵体；(2)以含Trition X-100(购自Amresco公司)的TE重悬包涵体，离心洗涤至少一次，弃上清，余下部分为包涵体；(3)以含尿素的溶液重悬包涵体，离心洗涤至少一次，弃上清，余下部分为包涵体；(4)用缓冲液裂解包涵体，离心洗涤至少一次，上清用滤膜过滤后得到澄清的包涵体裂解液。
其中重组单链抗体的纯化和复性包括Ni2+离子金属螯合层析和离子交换纯化，透析复性。
由于ScFv表达产物的N端融合有6×His标记，因此可用镍离子螯合亲和层析柱纯化ScFv。所述的Ni2+离子金属螯合层析为先用缓冲液平衡离子螯合亲和层析柱(Pharmacia)；然后上样，并用同样缓冲液冲洗层析柱，再用缓冲液平衡，最后用缓冲液将目的蛋白洗脱下来。纯化后目的蛋白的纯度达到90％以上。
所述的离子交换为第一步纯化的样品上SP-Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱，最后用缓冲液洗脱，收集目的峰。经凝胶成像分析，目的蛋白的纯度达到97％以上。
重组单链抗体的复性是采用直接稀释结合逐步透析的方法来进行复性。其中蛋白浓度为0.5mg/ml，具体步骤如下用含4M尿素的缓冲液透析24小时，再用含2M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用含1M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用0.5M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用0M尿素的相同缓冲液透析24小时；其中在对1M尿素透析时加入400mM的精氨酸和50倍于ScFv摩尔浓度的GSSG；在对0M尿素透析时加入5％的甘露醇作为稳定剂来减少蛋白质聚集沉淀。
单链抗体(ScFv)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经连接肽拼接后形成的小分子抗体。这种新的抗体片段保持原有抗体结合位点的特异性及亲和力，并有分子量小、穿透力强、体内半衰期短与免疫原性低等特点，且易于与效应分子相结合，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。生物活性研究表明本发明的用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体经纯化、复性后得到的单链抗体具有与HBsAg结合的活性，并且经质谱测定其蛋白的一级结构完全正确。说明本发明所构建的单链抗体有可能取代血源性抗体，可用于乙型肝炎的被动免疫并可在其基础上进一步开发具有治疗作用的导向药物。
图1噬菌体展示技术的原理图2本发明抗HBsAg Fab抗体基因测序结果图3本发明抗HBsAg Fab抗体基因同源性比较结果具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
一、噬菌体展示技术获得抗HBsAg Fab抗体片段基因对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后第五天取血，分离单核细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA，用设计好的引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的片段基因，分别插入到载体pComb3H(Carlos F.Barbas and Dennis R.Burton，1994，ColdSpring Harbor Laboratory，Monoclonal Antibodies from combinatorial Libraries)的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒。用该质粒转化感受态细菌XL1-Blue，重组菌体在SB培养基[Super-Broth，含3％Tryptone(购自OXOID公司)，2％yeastextract(购自OXOID公司)，1％Mops，PH7.0]中培养2小时后加入噬菌体VCSM13(CarlosF.Barbas and Dennis R.Burton，1994，Cold Spring Harbor Laboratory，MonoclonalAntibodies from combinatorial Libraries)培养过夜，其上清即为噬菌体抗体库。
1、引物设计重链(VH)5’引物VH1a CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGGVH1f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG
VH2f CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3a GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGVH4f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4g CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6a VAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重链3’引物CG1a GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCG2a CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3a TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTTCG4a GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGAK链5’引物；V1a GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAV2a GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCAV3a GAAATTGAGCTGACGCAGTCTCCAK链3’引物GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGATCTCAG2、PCR的扩增分别取1ul上述反应物为模板，10倍的PCR缓冲液(500mM KCl，100mM Tris.ClPH8.3，20mM MgCl2)，1.5ul的0.1mM dNTP，1.2ul的20uM不同组合的3’，5’端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶，12.75ul的双蒸水。反应30个循环(94℃*45秒，50℃*60秒，72℃*120秒)，反应产物用1.2％琼脂糖电泳回收。
3、噬菌体抗体的筛选向预先包被HBsAg的微孔板内，每孔加入全套抗体库液50ul，37℃温育2小时，弃上清，用适量的0.5％Tween20的TBS(含50mmol/L Tris Base，150mmol/L NaCl)清洗数遍。每孔加入50ul洗脱缓冲液，吸出孔内液体，室温放置10min，用适量的2mol/L Tris调PH至中性。用洗脱液感染2ml新鲜制备的XL1-blue，培养6-8小时，加辅助噬菌体VCSM13继续培养过夜，重新获得噬菌体，重复上述步骤，3轮筛选后收集感染的细菌，提取双链噬菌体DNA(含Fab抗体基因)。
4、阳性克隆的序列分析及同源性比较从筛选到的抗HBsAg的Fab阳性的克隆，即为含Fab抗体基因的克隆。将抗体的轻、重链基因片段插入到测序载体测序鉴定，结果见图2，同源性比较见图3。
二、基因的克隆，原核表达载体构建1、抗HBsAg单链抗体基因的克隆引物设计为上游引物P1 5′-G AAT TCA TGC AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3′下游引物P2 5′-GCA AGC TTT TAT CGA TTG ATT TCC ACC TTG GT-3′GAATTCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGAGGGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGTAGCGACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTNTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACGGCCAATTAACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGATAAAAGCTT2、表达质粒的构建引物设计为上游引物P1 5′-TTG GAT CCC AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3′下游引物P2 5′-GCA AGC TTT TAT CGA TTG ATT TCC ACC TTG GT-3′以pGEM3zf-ScFv为模板，在50ul反应体系中加入5ul反应缓冲液(500mMKCl，100mM Tris.Cl PH8.3，20mM MgCl2)，1.5ul 0.1mol/L的dNTPs，1ul的20uM的P1、P2引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶，补加双蒸水至50ul。反应30个循环(95℃*45秒，60℃*60秒，72℃*120秒)，反应产物用1.2％琼脂糖电泳回收。将PCR产物回收酶切，插入同样条件酶切过的pQE40载体(购自QIAGEN公司，详情见QIAexpressDetection and Assay Handbook)上，获得表达质粒pQE-ScFv；序列测定结果表明，重组ScFv ORF(开放读码框)序列与预期结果一致。
三、人源性抗HBsAg的单链抗体的原核表达及生产1、重组单链抗体的诱导表达重组质粒pQE-ScFv转化表达宿主菌M15[pREP4](购自QIAGEN公司，详情见QIAexpressDetection and Assay Handbook)，挑选单克隆接种2ml含氨苄青霉素(Amp)100mg/L，卡那霉素(kana)25mg/L的LB培养基[Luria-Bertani，含1％Tryptone(购自OXOID公司)，0.5％yeast extract(购自OXOID公司)，1％Nacl]，37℃震荡培养过夜，次晨按5％接种量转入含同样抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇约3小时至OD值为0.8～1.0，加入异丙基-b-硫代半乳糖苷(IPTG)(购自华美生物工程公司)至终浓度为1mmol/L，继续培养5小时，离心收集菌体，电泳鉴定目的蛋白表达量，目的蛋白表达量为30％。
2、细菌细胞的裂解以6000rpm，20min，4℃离心收获菌体，按湿菌重量的10％加入裂解缓冲液TE(10mMTris，1mM EDTA，pH8.0)，洗涤一次，弃上清，加入同样体积的TE，并加入菌体重量的3‰的溶菌酶(购自华美生物工程公司)，混匀后置-20℃过夜保存。次日于冰箱中低温融化，冰浴下400W，5秒，停10秒，共10次超声，10,000rpm，20min，4℃下离心收集包涵体。
3、包涵体的洗涤(1)以TE重悬包涵体，12,000rpm，20min，4℃洗一次，弃上清，余下部分为包涵体；(2)以含1％Trition X-100的TE重悬包涵体，12,000rpm，20min，4℃洗一次，弃上清，余下部分为包涵体；(3)以含2M尿素的TE重悬包涵体，12,000rpm，20min，4℃洗一次，弃上清，余下部分为包涵体；(4)用缓冲液(8M脲，0.1M Na2HPO4，0.01M Tris，pH8.0，10mMβ-巯基乙醇)裂解包涵体，12,000rpm，离心20min，4℃，上清用0.45滤膜过滤后得到澄清的包涵体裂解液。
四、重组单链抗体的纯化和复性
1、ScFv的纯化采用两步纯化的方法，第一步为Ni2+离子金属螯合层析，第二步为离子交换层析。
(1)Ni2+离子金属螯合层析由于ScFv表达产物的N端融合有6×His标记，因此可用镍离子螯合亲和层析柱(购自Pharmacia公司)纯化。先用缓冲液平衡柱子，缓冲液为6M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris，pH8.0；然后上样，并用同样缓冲液洗柱，再用4M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris，pH6.3缓冲液洗脱，最后用4M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris，pH4.0缓冲液将目的蛋白洗脱下来，纯化后目的蛋白的纯度达到90％以上。
(2)离子交换层析经第一步纯化的样品上SP-Sepharose CL-4B柱(购自Pharmacia公司)，最后用4M尿素，0.01M NaH2PO4，1MNaCl pH5.5缓冲液洗脱，收集目的峰，经凝胶成像分析，目的蛋白的纯度达到97％以上。
2、ScFv的复性将蛋白浓度调整到0.5mg/ml，用直接稀释结合逐步透析的方法来进行复性，步骤如下用含4M尿素的缓冲液(0.1M NaH2PO4，0.1M Tris)透析24小时，再用含2M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用含1M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用0.5M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用0M尿素的相同缓冲液透析24小时；在对1M尿素透析时加入400mM的精氨酸(购自北京鼎国生物技术发展中心)和50倍于ScFv摩尔浓度的GSSG(氧化型谷胱甘肽，购自华美生物工程公司)；在对0M尿素透析时加入5％的甘露醇作为稳定剂来减少蛋白质聚集沉淀。
五、ScFv的活性分析及结构确证1、竞争性ELISA参照文献(基础免疫学实验指导；第四军医大学免疫学教研室，1990.12)进行，包被50ng HBsAg抗原，加入固定量(7ng/孔)的鼠抗HBsAg单克隆抗体，并分别以10ng到80ng量的ScFv作为竞争性抗体与鼠抗竞争，以羊抗鼠-HRP作为酶标抗体，显色后测A450/630。直接ELISA的结果表明纯化复性后的ScFv具有较强的抗原结合能力。并在此基础上进行了竞争性ELISA实验，结果加入鼠源抗HBsAg单抗的量为7ng，可以看出复性后的单链抗体能够与鼠源抗HBsAg单抗竞争，从而抑制鼠源抗HBsAg单抗与HBsAg结合的能力，抑制率为40.3％。
2、单链抗体亲和常数测定非竞争酶免疫法测定。分别用3mg/L、1.5mg/L、0.75mg/L、0.375mg/L四种浓度的HBsAg包被ELISA板；调整单链抗体蛋白浓度至10-7mol/L水平，倍比稀释1∶2～1∶256，加至不同包被量的反应孔中；再加鼠RGS-HisTMAntibody及HRP标记的羊抗鼠IgG反应，TMB显色，测450nm/630nm吸光值。测定其亲和常数经非竞争酶免疫测定确认为0.23×108mol/L。
3、分子量的确证将复性好的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后扫描纯度达到95％ScFv，透析脱盐，用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS，BRUKER公司，仪器型号Bruker Reflex III，中山大学分析测试中心)测定ScFv的分子量，样品ScFv的分子量为27314Da；根据顺序计算的理论分子量为27322.31Da。
4、质量肽图的鉴定ScFv冻干样品溶解于100μl 1％NH4HCO3中，分两次加入1/50样品量的胰蛋白酶(经TPCK处理)；置37℃恒温水浴24小时，取出水解液进行MADLI-TOF-MS检测。
理论预测的21个肽中，有11个肽均能在质谱图上看到，超过理论预测肽段总数的50％。
5、重组人源性抗乙肝表面抗原单链抗体的氨基酸序列测定氨基酸测序分析结果如下N-端N-MRGSHHHHHHGSQVQ……C-端……INR-C
权利要求
1.一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体，其特征在于具有下述序列结构蛋白质的氨基酸序列结构MetGlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArgSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerArgHisGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaValIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysAlaGlyGlyAlaAlaAlaGlyThrGlyThrAlaTyrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuThrGlnSerProGlyThrLeuSerLeuSerSerGlyGluGlyAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerAsnGlyGlnLeuThrTyrTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIleTyrGlyAlaSerSerArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerArgLeuGluProGluAspPheAlaValTyrTyrCysHisGlnTyrAspGlySerProGluThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleAsnArg蛋白质的基因序列结构GAATTCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGAGGGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGTAGCGACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTNTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACGGCCAATTAACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGATAAAAGCTT。
2.一种重组人源性抗HBsAg抗体的制备方法，包括如下步骤1)利用噬菌体展示技术克隆人源性HBsAg抗体的Fab段，在大肠杆菌内表达，并通过重叠PCR获得抗HBsAg单链抗体基因；2)将HBsAg单链抗体基因插入原核胞质表达载体，在大肠杆菌中获得高效表达，然后对重组单链抗体进行纯化和复性。
3.根据权利要求2所述的抗体的制备方法，其中通过噬菌体展示技术获得人源性HBsAg抗体的Fab段基因所采用的方法为对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血，分离单核细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA，用引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的片段基因，分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒；用该质粒转化XL1-Blue，重组菌体在SB培养基中培养，然后加入噬菌体VCSM13培养，其上清即为噬菌体抗体库。
4.根据权利要求3所述的抗体的制备方法，其中所述引物为上游引物P15′-TTG GAT CCC AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3′下游引物P25′-GCA AGC TTT TAT CGA TTG ATT TCC ACC TTG GT-3′以pGEM3zf-重组人源性抗HBsAg为模板，在缓冲液中加入聚合酶反应，反应产物用聚丙酰胺电泳回收；将PCR产物回收酶切，插入同样条件酶切过的pQE40载体上，获得重组表达质粒pQE-重组人源性抗HBsAg，进行序列测定。
5.根据权利要求2所述的抗体的制备方法，其中将人源性抗HBsAg单链抗体基因插入原核胞质表达载体、在大肠杆菌中获得高效表达的过程包括重组单链抗体的诱导表达、细菌细胞的裂解和包涵体的后处理。
6.根据权利要求5所述的抗体的制备方法，其中重组单链抗体的诱导表达采用的方法为重组质粒pQE40-ScFv转化表达宿主菌M15[pREP4]，挑选单克隆接种LB培养基，37℃震荡培养过夜，转入含同样抗生素的LB中，37℃剧烈振摇至OD值为0.8～1.0，加入IPTG继续培养5小时，离心收集菌体，电泳鉴定目的蛋白表达量为20-30％。
7.根据权利要求6所述的抗体的制备方法，其中LB培养基为含有Amp 100mg/L，Kana 25mg/L的LB培养基，LB培养基的量为2ml，加入IPTG至终浓度为1mmol/L。
8.根据权利要求5所述的抗体的制备方法，其中细菌细胞的裂解方法为离心收获菌体，加入裂解缓冲液洗涤一次后弃上清，再加入同样体积的TE，并加入溶菌酶，混匀后置至少-20℃保存12-48小时，冻融，冰浴超声、离心收集包涵体。
9.根据权利要求5所述的抗体的制备方法，其中包涵体的后处理包括(1)以TE重悬包涵体，离心洗涤至少一次，弃上清，余下部分为包涵体；(2)以含Trition X-100的TE重悬包涵体，离心洗涤至少一次，弃上清，余下部分为包涵体；(3)以含尿素的溶液重悬包涵体，离心洗涤至少一次，弃上清，余下部分为包涵体；(4)用缓冲液裂解包涵体，离心洗涤至少一次，上清用滤膜过滤后得到澄清的包涵体裂解液。
10.根据权利要求2所述的抗体的制备方法，其中重组单链抗体的纯化和复性包括Ni2+离子金属螯合层析和离子交换纯化，透析复性；所述的Ni2+离子金属螯合层析为先用缓冲液平衡离子螯合亲和层析柱；然后上样，并用同样缓冲液冲洗层析柱，再用缓冲液平衡，最后用缓冲液将目的蛋白洗脱下来，纯化后目的蛋白的纯度达到90％以上；所述的离子交换为第一步纯化的样品上SP-Sepharose CL-4B柱，最后用缓冲液洗脱，收集目的峰，经凝胶成像分析，目的蛋白的纯度达到97％以上；重组单链抗体的复性是采用直接稀释结合逐步透析的方法来进行复性，其中蛋白浓度为0.5mg/ml，具体步骤如下用含4M尿素的缓冲液透析24小时，再用含2M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用含1M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用0.5M尿素的相同缓冲液透析24小时，再用0M尿素的相同缓冲液透析24小时；其中在对1M尿素透析时加入400mM的精氨酸和50倍于ScFv摩尔浓度的GSSG；在对0M尿素透析时加入5％的甘露醇作为稳定剂来减少蛋白质聚集沉淀。
全文摘要
本发明公开了一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)单链抗体及其制取方法，利用噬菌体展示技术克隆人源性HBsAg抗体的Fab段基因，在大肠杆菌内表达；通过重叠PCR获得抗HBsAg单链抗体基因，并将其插入原核胞质表达载体，在大肠杆菌中获得高效表达，然后对重组单链抗体进行纯化和复性；本发明用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg单链抗体具有与HBsAg结合的活性，并且经质谱测定其蛋白的一级结构完全正确，本发明所构建的单链抗体有可能取代血源性抗体，可用于乙型肝炎的被动免疫并可在其基础上进一步开发具有治疗作用的导向药物。
文档编号C12N15/63GK1569898SQ0314596
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月18日 优先权日2002年7月19日
发明者余宙耀, 粟宽源, 任向荣, 高辉, 杨安钢 申请人:余宙耀, 粟宽源, 高辉