专利名称：抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程抗体，涉及一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体及 其在预防性被动免疫和慢性乙型病毒性肝炎潜在的治疗药物开发中的应用。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率 很高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过3亿,我国约占9300万。 乙肝病毒携带者中1/3会转为慢性肝炎，10%的慢性肝炎患者会发展为肝硬化，10%的肝硬 化患者会进一步发展为肝癌。因而乙型病毒性肝炎是一种流行极广，危害极重而且没有有效 治疗方案的传染病。虽然主动的疫苗接种可以有效地预防乙肝，但是绝大部分的人群并没有 接受疫苗接种，因而这些人群仍然暴露于乙肝病毒感染的高度危险之下。中和性的乙肝病毒 免疫球蛋白可以有效预防母亲为乙肝患者的新生儿、意外暴露于乙肝病毒的成年人免受乙肝 病毒的感染，有效预防肝硬化或肝癌患者肝移植后乙肝的复发，有效控制爆发性肝炎患者体 内乙肝病毒的大量繁殖和扩散；而且由于抗体可以介导抗体依赖的、细胞介导的细胞毒性作 用(ADCC)和补体介导的细胞毒性作用(CDC)，所以对于慢性肝炎患者以及乙肝病毒携带 者具有潜在的治疗作用。然而，目前临床上用到的乙肝病毒免疫球蛋白都是从接受乙肝疫苗 接种的正常人血清中分离出来的，属于血液制品，因而具有传播某些血液传播感染性疾病的 潜在危险，如艾滋病，丙肝，所以它的应用价值受到了很大的限制。而通过抗体库技术获得 的重组中和性乙肝病毒抗体就可以克服这一缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的、具有中和活性的、 人源性单链抗体，能用来预防、控制和治愈乙肝病毒的感染。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗 体，该单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 。
作为本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的改进抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。
作为本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的进一步改进该抗体的 轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。
本发明还提供了上述抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体在制备预防性被动 免疫药物中的应用。
本发明还提供了上述抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体在制备治疗慢性乙 型病毒性肝炎药物中的应用。
噬菌体抗体库技术无需经过杂交瘤，可以从接受乙肝疫苗接种后具有高滴度保护性乙肝 抗体的正常人外周血中分离淋巴细胞，进而扩增出全部抗体基因并建成噬菌体展示抗体库， 从中筛选出高亲和力的抗乙肝病毒a决定簇的中和抗体。研究表明，乙肝表面抗原中的a决 定簇介导乙肝病毒与肝细胞表面的受体结合并感染，所以抗a决定簇的抗体具有中和活性。
本发明采用噬菌体表面展示技术，从3位接受乙肝疫苗接种后具有高滴度保护性抗体的 正常人外周血单个核细胞提取mRNA并从中扩增出人的全套抗体可变区基因，然后装配成单 链抗体基因片段，克隆到噬粒载体并转化大肠杆菌构建成一个3xl09的人源性单链抗体库。 然后用乙肝病毒表面抗原a决定簇的重组蛋白进行筛选得到其特异性的高亲和力中和性抗 体。该抗体可在大肠杆菌中可溶性表达，该抗体编码243个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 1所 述。本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体由729个核苷酸组成，其序列 如SEQ ID NO: 4所述。
本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的重链可变区基因编码120个 氨基酸，序列如SEQIDNO:2所述。该抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体重链 可变区由360个核苷酸组成，其序列如SEQIDNO:5所述。本发明的抗乙肝病毒表面抗原a 决定簇的人源性单链抗体重链可变区由IGHV4-4， IGHD6-19和IGHJ4基因重排后形成的具 有单一开放读框的功能性可变区基因。其中CDR3(互补决定区3)的核苷酸序列为GTTGGG CCC CAG TGG CTG GTA CCC AGG,氨基酸序列为VGPQWLVPR，由 IGHD6-19和本发明的乙肝表面抗原a决定簇的特异性人源性单链抗体特有的序列组成。
本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的轻链可变区基因编码108个 氨基酸，序列如SEQIDNO:3所述。该抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体轻链 可变区由324个核苷酸组成，其序列如SEQIDNO:6所述。该乙肝病毒表面抗原a决定簇特异性人源性单链抗体轻链可变区由IGKV4-69和IGKJ2基因片段重排后形成的具有单一开放 读框的功能性可变区基因。其中CDR3的核苷酸序列为CAC CAG TAT GGT AGC TCA CCT CGA,氨基酸序列为HQYGSSPR。
本发明的乙肝病毒表面抗原a决定簇特异性人源性单链抗体可在噬菌体表面呈现表达， 也可以在大肠杆菌中可溶性表达。经蛋白电泳和Western blot证实，IPTG诱导后表达的可溶 性单链抗体分子量约为30kD。该抗体与HEK293细胞表达的重组乙肝病毒表面抗原a决定簇 蛋白的亲和力为Kd=2nM，这为研究乙肝病毒中和性全抗体奠定了基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是本发明的乙肝病毒表面抗原a决定簇特异性人源性单链抗体与重组乙肝病毒表面 抗原a决定簇的亲和力测定效果图。
具体实施例方式
实施例1、
(一) 淋巴细胞的分离
收集3位接受乙肝疫苗接种的具有高滴度保护性抗体的正常人的外周血共100ml,加入 等体积的淋巴细胞分离液离心分层，2500g, 10min。小心吸取中层淋巴细胞，离心，2500g, 10min。弃上清，用lmlTrizol/5ml外周血裂解淋巴细胞，至溶液彻底透明为止；得淋巴细胞 裂解液。
(二) RNA的提取
将淋巴细胞裂解液于室温孵育5min，加入0.2ml氯仿/ml Trizol, votex振荡15s,室温静 置3min， 12000g, 5min。取上层清亮水相，加入0.5ml异丙醇/ml Trizol，颠倒混匀，于一20 。C沉淀30—60min， 12000g离心10min。保留沉淀，70%的乙醇洗涤一遍，空气中晾干，DEPC 水溶解沉淀RNA。
(三) mRNA的纯化(Qiagen试剂盒)
将上述DEPC水溶解的RNA按试剂盒说明书进行纯化，得mRNA 。
(四) 反转录将mRNA于7(TC保温10min,使其打开二级结构，然后迅速置于冰上，按说明书(Promega 公司的反转录试剂盒)依次加入各试剂，用随机六聚体引物进行反转录。室温静置10min使 引物延伸，然后42'C 60min进行反转录，最后95°C 5min灭活反转录酶，冰浴5min，将反 转录产物于一20'C保存。
(五)全套可变区基因扩增
将反转录产物分成3份作为模板进行第一轮PCR，将VH、 VL、 VK的3'端引物分别 混合后与5'端各引物分别进行PCR扩增。上述VH、VL、VK如Sblattero, D.， and A. Bradbury. 1998. A definitive set of oligonucleotide primers for amplifying human V regions, Immunotechnology. 3:271—278中所述。
反应条件为94。C 5min热启动，94。C lmin变性，55°C lmin退火，72。C lmin延伸，共35 个循环。最后进一步延伸7min。反应体系为100|al。将第一轮PCR的VH混合，VL和VK 以l: 2混合，分别作电泳纯化回收，100倍稀释后作为第二轮PCR反应的模板进行第二轮 PCR反应，以引入更长的保护序列及重叠延伸序列，条件为94°C 5min热启动，94°C lmin 变性，55°C lmin退火，72°C lmin延伸,共25循环。反应体系为IOOW。分别得加端的VH基 因片断、VL基因片断和VK基因片断。
第一轮引物的保护序列，linker的序列如下
轻链上游引物保护序列AGCAAGCGGCGCTTGGGCCCAGCCGGCC (第二轮PCR的退火 序列)；
轻链下游引物保护序歹lJ: ACCTCCAGACCCTCCGCCACC (第二轮PCR的退火序列)； 重链上游引物保护序列GGCTCTGGGGGAGGAGGTTCA (第二轮PCR的退火序列)； 重链下游引物保护序列GATTGGTTTGCCCTAGCGGCCGC (第二轮PCR的退火序列)； linker: GGTGGCGGAGGGTCTGGAGGTGGAGGCTCTGGGGGAGGAGGTTCA;
第二轮引物的序列如下 第二轮轻链上游引物
CC
第二轮轻链下游引物 延伸序列)第二轮重链上游引物
伸序列)
第二轮重链下游引物 CGC
(六) 单链抗体(scFv)片断的随机拼接及扩增
将上述加端的VH、 VL和VK基因片断分别用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离、回收， 然后按VH:VK:VL:Linker=3:2:l:3的比例混合进行重叠延伸以装配scFv片断，条件为94°C lmin变性，55°C lmin退火，72°C lmin延伸，共10个循环。将重叠延伸产物进行1:100稀 释，以此作模板，以单链抗体扩增的上游和下游引物扩增scFv片断，PCR反应条件是94'C 5min热启动，94°C lmin变性，55°C lmin退火，72°C lmin延伸，25个循环。PCR产物即为 单链抗体基因片断，用1.5%的琼脂糖凝胶回收。
单链抗体扩增上游引物TCAGGTATCCACTGCAGACTGATTACGGTC 单链抗体扩增下游引物CTAGACTCTGCTACAGCTCAGCTACGTGGA
(七) 单链抗体与噬粒载体的连接及单链抗体库的构建
1. 电转化感受态的制备
从M9平板上挑取TG1单克隆摇菌过夜，1:100转接于500mlLB,振摇2.5h， OD麵的值 在0.5—0.6之间，离心收菌，3000rpm, 10min。用等体积的冰冷lmM的HEPES洗涤两遍， 3000rpm， 10min，用1/10体积的冰冷10%甘油洗漆两遍，4000rpm， 10min，用与沉淀等体积 的冰冷10%甘油重悬沉淀，每管50ul于一8(TC保存，得到可冻存的感受态细菌。
2. 单链抗体库的制备
将上述(六)所得的纯化的单链抗体基因片段用Sfil/Notl酶切，并与经相同酶切开的 噬粒载体PCANTAB5E连接。将连接产物于70°C孵育10min灭活T4 DNA连接酶，然后电 转化大肠杆菌TG1。将转化后的细菌涂布于含1%葡萄糖和100mg/L氨苄的2YT平板上，30 'C培养过夜，抗体库库容量为3X109。用含15X甘油的2YT将细菌克隆刮下来后冻存到一 80°C;得单链抗体库。3.抗体库的噬菌体表面呈现
接种3X101Q的细菌抗体库于500ml 2YTGA(2YT+l。/。葡萄糖+ amp)中，37。C振摇至 OD600=0.5。取100ml用辅助性噬菌体M13K07以20: 1的比例于37。C静置水浴30min进行 感染。然后3300g， 10min室温离心，弃上清，将细菌沉淀再分别转接到30'C预热的1000ml 2YTGAK(2YT+P/。葡萄糖+amp+kan)中，30。C振摇过夜(应达到12小时)。次日，离心10min (4'C )，收上清。在上清中加入1/5体积的PEG/NaCl (20%的PEG6000, 2.5M的NaCl)，混匀， 4匸静置1小时以上沉淀噬菌体。然后10000rpm于4'C离心15min,收集噬菌体沉淀并重悬 于5mlPBS中。10000rpm再次离心15min，取上清(沉淀为残留的细菌碎片及PEG),放于 4'C备筛库用。同时取lpl倍比稀释进行滴度分析。
(八) 噬菌体抗体库滴度测定
从M9培养基上挑取TG1单克隆于5ml 2YT，振摇过夜。取0.5ml过夜菌接种于50ml 2YT (100ml三角烧瓶)中，37i:振摇至OD600=0.2。将噬菌体抗体库(步骤(七)、3所得)做 十倍倍比稀释，从各个稀释度各取10 y 1加入到200 u 1 OD600=0.2的TG1中，混匀，37"C水 浴30min。将这200P1细菌和噬菌体的混合液涂布到含氨苄的2TY琼脂平板上。倒置放于 37°C，第二天根据克隆数计算噬菌体库的滴度。
(九) 辅助性噬菌体M13K07的制备
从M9培养基上挑取TG1单克隆接种于5ml 2YT，振摇过夜。取0.5ml过夜菌接种于50ml 2YT (100ml三角烧瓶)中，37。C振摇至OD600=0.2。将M13K07十倍倍比稀释，从各个稀 释度各取10 u 1加入到200 u 1 OD600=0.2的TG1中，混匀，37。C水浴30min。将这200 u 1 细菌和噬菌体的混合液加入到3ml不烫手的上层琼脂胶中，稍微晃一下，立即倒入37'C预热 的用2TY配制的琼脂平板上。倒置放于37°C，第二天可出现噬斑。挑取单个噬斑接种于3 一4ml OD600=0.5的TG1中(制备方法同前，即前一晚从M9上挑克隆，摇菌过夜，第二天 1: 100转接于50ml 2YT中，振摇约2—2.5小时)，37。C振摇2小时。将这3—4ml感染了 M13K07的TG1接种于500ml2YT中，37'C振摇1小时。加入卡那(50—70u g/ml),继续于 37。C振摇8—16小时，10000rpm，离心15min，收上清。上清中加入1/5体积的PEG/NaCl (20% 的PEG6000, 2.5M的NaCl),混匀，4。C静置1小时以上，10000rpm,离心15min。用20ml含 15X甘油的PBS重悬噬菌体，10000rpm,离心15—20min,收集上清(沉淀为细菌碎片及PEG)。 噬菌体溶液经0.45um滤膜过滤消毒后分装，冻存于一8(TC，同时用噬斑的方法测其滴度。(十)乙肝表面抗原a决定簇的表达纯化
乙肝表面抗原a决定簇由53个氨基酸组成，我们将3个a决定簇的基因片段首尾相接， 经Nhel/Xbal克隆入哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1， N端由PDGF的信号肽引导进行分 泌表达，C端有6个His标签用于蛋白纯化。制备3个首尾相接的a决定簇蛋白的目的在于 分子量大一些的蛋白利于表达、纯化以及筛库和鉴定时的抗原包被。构建好的质粒载体转染 入可悬浮、无血清培养的HEK293F细胞(Invitrogen公司)进行蛋白表达，然后用镍柱进行 亲和纯化。
三个首尾相接的a决定簇蛋白的基因序列如下-
TTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTCTAGA
三个首尾相接的a决定簇蛋白的氨基酸序列如下:
GTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWASR。
(十一)特异性抗体的筛选
用5ml 50pg/ml的上述抗原(即a决定簇蛋白，第一轮)包被25cm2培养瓶，4'C过夜(包 被液为500mM的碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)，第二轮以后包被的抗原浓度降低到10(ag/ml (包 被方法同上)。PBST洗涤后加入5ml含1X10"噬菌体(步骤(七)、3所得)的5%MPBS, 脱色摇床上轻晃30min后室温水平放置90min以上进行抗原抗体的结合。然后用PBS和PBST 各洗20遍，最后将生长至对数生长期的10ml TG1加入培养瓶并于30'C水浴30min让结合于 抗原的噬菌体感染TG1。被感染的TG1经离心后涂布于10cm 2YTGA平板上，30。C过夜。 再用辅助性噬菌体超感染的方法从被感染并扩增了的TG1制备噬菌体，进行第二轮筛选。如此反复进行"吸附一洗脱一感染一繁殖"的筛选过程共4轮。 (十二)单克隆噬菌体抗体抗原结合活性的鉴定
1. 单克隆噬菌体抗体的制备
从最后一轮筛选的平板上挑取单克隆于装有30(^1 2YTGA的96孔深孔培养板中，37 'C振摇过夜，次日1: 100转接于新的300|il 2YTGA中，37°。振摇2.5小时，用M13K07 以20: 1的比例进行超感染，3500转，离心10min,用300W 2YTGAK重悬细菌沉淀，30 。C振摇过夜。次日11000转离心15min，取上清进行phage ELISA鉴定。
2. Phage ELISA鉴定抗原抗体结合活性
用乙肝表面抗原a决定簇重组蛋白于4。C过夜包被ELISA板，每孔50nl，浓度为l|ig/ml。 次日用含5%脱脂奶粉的PBS加满孔室温封闭2小时，PBST洗涤2遍，用10(^1含5%脱脂 奶粉的PBS (MPBS)与等体积的含噬菌体的单克隆上清于室温预孵育30分钟后加入ELISA 板与抗原进一步孵育1小时。用PBST洗板6次然后加入HRP标记的抗M13噬菌体的抗体 稀释度为1:5000。室温孵育1小时，PBST洗板6次后加TMB显色。
(十三)可溶性单链抗体的表达
阳性噬菌体需要感染HB2151才能进行可溶性表达。阳性克隆的噬菌体作10或100倍 倍比稀释后过0.45的滤膜，取稀释好的10M1阳性噬菌体去感染200 u 1对数生长期的HB2151 。 方法如下生长于M9培养基上的HB2151单克隆于5ml 2YTG中，次日1: 100转接于50ml 2YTG， 37。C振摇至OD600=0.5。加入10^1经滤过的、倍比稀释过的噬菌体，混匀，37。C水 浴30min。铺涂有奈定酮酸和氨苄的2YTG琼脂板，37'C过夜。挑单克隆于5ml 2YTGA (含 1%葡萄糖)中，37。C摇过夜。次日1: 100转接于50ml含0.1X葡萄糖的2YTGA中，37°C 振摇至OD600=0.9，加入IPTG至终浓度为lmM， 3(TC振摇过夜，取上清进行聚丙烯酰氨凝 胶电泳分析表达情况，用ELISA鉴定可溶性表达的单链抗体的抗原结合活性。
(十四)可溶性单链抗体的纯化
由于单链抗体是与6个组氨酸的标签融合表达的，所以可溶性表达上清可以用镍柱进行 亲和纯化，具体步骤为用PBS平衡亲和柱，样品上柱，50mM的咪唑洗脱非特异的结合蛋 白，500mM的咪唑洗脱下结合于镍柱上的单链抗体，用分子筛去除咪唑，缓冲液置换为PBS。
(十五)可溶性单链抗体的亲和力鉴定用0.1pg/ml和0.05pg/ml两种不同浓度的a决定簇重组蛋白包被ELISA板，然后加入从 lpM到lpM十倍倍比稀释的纯化过的单链抗体孵育1小时，然后加入抗V5-HRP抗体(单 链抗体与V5标签融合表达)孵育1小时，最后用TMB显示。根据ELISA读数绘制亲和力 曲线，然后求出OD50时0.1pg/ml和0.05ng/mla决定簇对应的抗体浓度，分别记为[Ab](对 应于0.1pg/ml的a决定簇)和[Ab]'(对应于0.05(ig/ml的a决定簇)，然后用公式Kd=2[Ab]， 一[Ab]计算单链抗体的亲和力。
选择上述亲和力最高的单链抗体作为本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单 链抗体，经测序，该抗体编码243个氨基酸，该单链抗体的氨基酸序列为SEQIDNO:l，该 抗体由729个核苷酸组成，其序列如SEQ ID NO: 4所述。本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决 定簇的人源性单链抗体的重链可变区基因编码120个氨基酸，序列如SEQIDN0:2所述。该 抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体重链可变区由360个核苷酸组成，其序列如 SEQ ID NO: 5所述。本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的轻链可变区 基因编码108个氨基酸，序列如SEQIDNO:3所述。该抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源 性单链抗体轻链可变区由324个核苷酸组成，其序列如SEQ ID NO: 6所述。
实施例2、
本发明的单链抗体按照上述方法进行亲和力鉴定，结果如图1。根据图1，我们得出以 下结论本发明中的单链抗体与乙肝表面抗原a决定簇的亲和力高达Kd-2nM，具有潜在的 中和乙肝病毒的功能。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表
SEQ ID NO: 1
Glu lie Val Leu Thr Gin Ger Pro Gly Thr Leu Ger Leu Ger Pro 1 5 10 15
Gly Glu Gly Gla Thr Leu Ger Cys Arg Gla Ger Gin Ger Val Arg 20 25 30
Arg Asn Leu lie Gla Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Gla Pro 35 40 45
Arg Leu Leu lie His Gly Gla Ger lie Arg Gla Thr Gly lie Pro 50 55 60
Asp Lys Phe Ger Gly Ger Gly Ger Gly Thr Arg Phe lie Leu Gla 65 70 75
lie Ger Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Gla Val Phe Tyr Cys His 80 85 90
Gin Tyr Gly Ger Ger Pro Arg Thr Phe Gly .Gln Gly Thr Lys Leu 95 100 105
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ger Gly Gly Gly Gly Ger Gly Gly 110 115 120
Gly Gly Ger Glu Val Gin Leu Val Glu Ger Gly Pro Gly Leu Val 125 130 135
Lys Pro Ger Glu Thr Leu Ger Leu Thr Cys Thr Val Ger Gly Gly 140 145 150
Ger lie Ger Ger Tyr Tyr Trp Ger Trp lie Arg Gin Pro Gla Gly 155 160 165Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Glu lie Asn His Ger Gly Ger Thr 170 175 180
Asn Tyr Asn Pro Ger Leu Lys Ger Arg Val Thr lie Ger Val Asp 185 190 195
Thr Ger Lys Asn Gin Phe Ger Leu Lys Leu Thr Ger Val Thr Gla 200 205 210
Gla Asp Thr Gla Leu Tyr Phe Cys Gla Arg Val Gly Pro Gin Trp 215 220 225
Leu Val Pro Arg lie Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 230 235 240 Val Ger Ger 243
SEQ ID NO: 2
Glu Val Gin Leu Val Glu Ger Gly ProGly Leu Val Lys Pro Ger 1 5 10 15
Glu Thr Leu Ger Leu Thr Cys Thr Val Ger Gly Gly Ger lie Ger 20 25 30
Ger Tyr Tyr Trp Ger Trp lie Arg Gin Pro Gla Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp lie Gly Glu lie Asn His Ger Gly Ger Thr Asn Tyr Asn 50 55 60
Phe Ger Leu Lys Ger Arg Val Thr lie Ger Val Asp Thr Ger Lys 65 70 75
Asn Gin Phe Ger Leu Lys Leu Thr Ger Val Thr Gla Gla Asp Thr80 85 90
Gla Leu Tyr Phe Cys Gla Arg Val Gly Pro Gin Trp Leu Val Pro 95 100 105
Arg lie Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ger Ger 110 115 120
SEQ ID NO: 3
Glu lie Val Leu Thr Gin Ger Pro Gly Thr Leu Ger Leu Ger Pro 1 5 10 15
Gly Glu Gly Gla Thr Leu Ger Cys Arg Gla Ger Gin Ger Val Arg 20 25 30
Arg Asn Leu lie GU Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Gla Pro 35 40 45
Arg Leu Leu lie His Gly Gla Ger lie Arg Gla Thr Gly lie Pro 50 55 60
Asp Lys Phe Ger Gly Ger Gly Ger Gly Thr Asp Phe lie Leu Gla 65 70 75
lie Ger Arg Leu Glu Phe Glu Asp Phe Gla Val Phe Tyr Cys His 80 85 90
Gin Tyr Gly Ger Ger Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Thr Val Leu 10861 121 181 241 301 361 421 481
说明书第13/14页
601 661
721 GTCTCCTCA SEQ ID NO: 5
121 181
301
SE(3 ID NO: 6301 CAGGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
权利要求
1、一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体，其特征在于该单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO1。
2、 根据权利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体，其特征在 于该抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。
3、 根据权利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体，其特征在 于该抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。
4、 如权利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体在制备预防性 被动免疫药物中的应用。
5、 如权利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体在制备治疗慢 性乙型病毒性肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO1。该抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO2，该抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO3。该抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体可用于制备预防性被动免疫药物或者制备治疗慢性乙型病毒性肝炎药物。
文档编号A61K39/395GK101658671SQ20091010062
公开日2010年3月3日 申请日期2009年7月13日 优先权日2009年7月13日
发明者刘向昕, 森 韩, 韩月恒 申请人:杭州屹源生物技术有限公司