专利名称：一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法
技术领域：
本发明属于绿原酸制备技术领域，尤其涉及一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法。
背景技术：
红腺忍冬花[1’2]是忍冬科植物红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.的干燥花蕾或带初开的花，列在2005年版中国药典“山银花”项下，红腺忍冬资源丰富，主产于河南、山东、云南及广西等地，是山银花药材商品的主要来源之一。红腺忍冬为临床常用中药，其味甘、性寒，用于痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症，属清热解毒之要药，山银花对多种致病菌均有抑制作用，是一种广谱抗菌中药，有“中药之中的青霉素”之美称。化学和药理研究证实[3A]其主要化学成分有挥发油类、有机酸类、黄酮类和苷类，绿原酸是其主要有效成分，药理作用主要有抗菌、抗病毒、解热和抗氧化，其抗菌作用的主要活性成分为绿原酸，但品种与产地不同而不同，因此金银花山及山银花中绿原酸含量的高低，是其质量优劣的重要标志。长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够，红腺忍冬各部位中都有一定的绿原酸，但含量高低不同，依次 为花> 叶>茎>根，且叶中的绿原酸含量较高，是花的40左右％，大大超过了根茎，而忍冬叶的药源远比红腺忍冬花丰富，采集容易，价格便宜，应该充分利用。因此研究红腺忍冬叶片绿原酸的提取，为充分利用红腺忍冬资源提供一定的理论和应用基础。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，旨在解决长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够的问题。本发明实施例是这样实现的，一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，该方法包括以下步骤:药材前处理、乙醇回流提取、浓缩、过滤、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制的绿原酸精品。具体步骤为:药材红腺忍冬叶片经60°C烘干，再粉碎过60目筛；称取IOg红腺忍冬叶干粉置于园底烧瓶中，再加100ml、pH3、70%乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次，完成后，趁热抽滤，合并两次提取液，并使用旋转蒸发仪在75°C下进行浓缩，浓缩至2ml/lg药材；再用I %的醋酸溶液配成I %的壳聚糖胶体作为澄清剂，对前述浓缩液进行沉淀初步除杂；初步除杂后澄清液再上DlOl大孔树脂进行纯化，就上柱溶液量、上柱溶液PH值及上柱溶液吸附流速对绿原酸吸附效果的影响进行考察，确定最佳上柱吸附条件，最佳上柱吸附条件为:固液比-树脂Ig: 6ml上柱溶液、乙醇pH为2、流速为40滴/min。经最佳上柱吸附条件吸附后，再就洗脱剂浓度、洗脱剂体积、洗脱剂pH值和洗脱流速对绿原酸洗脱效果的影响进行考察，确定最佳洗脱条件，最佳洗脱条件为:洗脱剂乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20%，流速为80滴/min，pH为7 ;上述洗脱液乙醇相使用旋转蒸发仪在75°C下进行浓缩，再在真空干燥箱中真空干燥，干燥物以pH3的60°C热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1: 2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品；绿原酸粗品再用PH值3的适量甲醇溶解，再放在4°C下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥；再进行薄层分析，以乙酸乙酯:甲酸:水=10: I: 2为展开剂展开，以1%三氯化铁乙醇溶液为显色剂，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。进一步，该方法进一步包括绿原酸含量测定方法，具体步骤为:步骤I，标准样溶液的制备精密称取绿原酸对照品lmg，置50mL量瓶中，加无水乙醇，使其完全溶解并稀释至刻度。摇匀，即得，每ImL中含绿原酸20ug;步骤2，最大吸收波长的确定将绿原酸标准样溶液在200 400nnl进行紫外扫描，最大吸收波长为328nm，故选328nm为检测波长； 步骤3，标准曲线的绘制精密量取对照品溶液l、2、4、6、8mL，分别用无水乙醇定容至IOmL容量瓶，摇匀。以无水乙醇作参比液，在328nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度C (ug/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。进一步，绿原酸的醇提方法为:将IOg药材与IOOml的pH3，70 %乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次；完成后，趁热抽滤，并使用旋转蒸发仪在75度下进行浓缩，浓缩至2ml/lg药材，比色定量分析检测提取液绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。进一步，绿原酸的初步除杂方法为:步骤I，壳聚糖的配制:用I %的醋酸溶液配成I %的壳聚糖胶体作为澄清剂；步骤2，对滤液澄清效果的考察:每IOOml浓缩液中加入1%壳聚糖溶液8ml，搅拌，在60°C静置60min，过滤，检测除杂效果，肉眼看各处理组过滤液澄清效果、薄层分析比较大极性杂质即绿原酸斑点下方杂质斑点大小及绿原酸斑点大小，同时比色定量分析检测各处理绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。进一步，该方法进一步包括上柱条件的优化试验方法:步骤I，树脂溶液处理量的确定方法5g经预处理的D101大孔树脂分别加入四根层析柱，每根加5g树脂，5、10、15、20ml上述壳聚糖脱色液分别上柱，60滴/分钟反复动态吸附4次，定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，确定树脂最大吸附量；步骤2，提取液pH值对吸附效果的影响上述活性炭脱色液分别调pH值2、3、4、5，按最佳上样量上样，分别上柱吸附，60滴/分钟吸附，操作按上述处理，最后定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，算出各个水平吸附率大小，分析PH值对树脂吸附绿原酸量的影响；步骤3，流速对吸附效果的影响按上述最佳上样量及pH值，以40、60、80、100滴/分钟流速吸附，从生产成本和生产效益等方面考虑，确定最佳上柱吸附流速。进一步，该方法进一步包括洗脱条件的选择方法:步骤I，洗脱剂浓度的确定分别用pH8、20ml的10、20、40、60%乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱
效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同浓度的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择最佳洗脱剂； 步骤2，洗脱液体积绿原酸洗脱率随洗脱体积增加而不断增大，分别用最佳pH值、15、20、30、40ml最佳浓度乙醇以最佳流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳洗脱体积，从解吸率来看解吸最佳洗脱体积。步骤3，洗脱剂pH值分别用PH6、7、8、9的20ml最佳浓度乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱
效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同PH值的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选 择洗脱剂最佳PH值，从洗脱率来看洗脱最佳pH值；步骤4,洗脱液流速分别用最佳pH值的20ml最佳浓度乙醇以40、60、80、100滴/分钟的流速进行洗
脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重；看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳流速，从洗脱率来看最佳洗脱流速。进一步，该方法进一步包括样品含量的测定及相关计算方法:绿原酸得率(%) = (CXV/WQ) X10_6X10_3绿原酸纯度(%) = (CXV/WJ X10_6X10_3式中，C为根据回归方程计算所得的绿原酸浓度(ug/ml) ;V为提取液体积(ml)；W0为红腺忍冬叶干重(g)Wi为提取物干重(g)。树脂洗脱率公式为:B(100%) = C1V1/[(C0-C2] X 100%B为洗脱率A为原液中绿原酸浓度(mg/ml) ；C2为吸附平衡后滤液中绿原酸浓度(mg/ml) ；V为吸附原液体积(ml) ；B为洗脱率K1为洗脱液中绿原酸浓度(mg/ml) 为洗脱液体积(ml)。进一步，该方法进一步包括绿原酸的纯化方法:步骤I，乙酸乙酯纯化上述乙醇相干燥物以PH3的60°C热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1: 2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次。步骤2，结晶纯化经乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品，用pH值3的甲醇溶解，再放在4°C下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥。进一步，该方法进一步包括绿原酸的薄层分析方法:
用毛细管分别取待测溶液和对照品溶液各5uL，点于距硅胶薄层板下边缘2cm的位置，点样斑点的直径为I 2mm。以乙酸乙酯:甲酸:水=10: I: 2为展开剂展开；待展开8cm时，自然晾干，喷以I %三氯化铁乙醇溶液，在120°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。进一步，红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为:乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20%，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43%，最佳上柱条件为:lg: 6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。本发明获的了从中药红腺忍冬叶中分离，纯化绿原酸的最佳工艺条件:用单因素和正交试验对红腺忍冬叶中绿原酸的分离，纯化工艺进行了最佳条件的筛选，采用正交表L9(34)，以乙醇体积、乙醇浓度、pH以及流速的浓度为因素，以绿原酸的紫外最大吸收波长320nm为指标进行试验。得到的红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为:乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20%，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43%，最佳上柱条件为:Ig: 6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
图1是本发明实施例提供的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法的流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。1.1红腺忍冬花[1’2]是忍冬科植物红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.的干燥花蕾或带初开的花，列在2005年版中国药典“山银花”项下，红腺忍冬资源丰富，主产于河南、山东、云南及广西等地，是山银 花药材商品的主要来源之一。红腺忍冬为临床常用中药，其味甘、性寒，用于痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症，属清热解毒之要药，山银花对多种致病菌均有抑制作用，是一种广谱抗菌中药，有“中药之中的青霉素”之美称。化学和药理研究证实[3’4]其主要化学成分有挥发油类、有机酸类、黄酮类和苷类，绿原酸是其主要有效成分，药理作用主要有抗菌、抗病毒、解热和抗氧化，其抗菌作用的主要活性成分为绿原酸，但品种与产地不同而不同，因此金银花山及山银花中绿原酸含量的高低，是其质量优劣的重要标志。长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够，红腺忍冬各部位中都有一定的绿原酸，但含量高低不同，依次为花> 叶>茎>根，且叶中的绿原酸含量较高，是花的40左右％，大大超过了根茎，而忍冬叶的药源远比红腺忍冬花丰富，采集容易，价格便宜，应该充分利用。因此研究红腺忍冬叶片绿原酸的提取，为充分利用红腺忍冬资源提供一定的理论和应用基础。红腺忍冬的成分中含有挥发油、黄酮类、有机酸类等。其中红腺忍冬的有机酸主要以绿原酸类化合物为主。绿原酸类包括绿原酸、异绿原酸、咖啡酸等[5]。绿原酸(chlorogenic acid, CGA)又名咖啡鞋酸,是由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(quinic acid)形成的缩酚酸，属多酚类化合物，是植物在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径(HMS)的中间产物合成的一种苯丙素类物质[6]。1.2绿原酸的化学结构及理化性质绿原酸的分子式为C16H18O9,相对分子量是354.30，熔点是208°C。其结构式如下:
权利要求
1.一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:药材前处理、乙醇回流提取、过滤、浓缩、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制得绿原酸精品，具体步骤为: 药材红腺忍冬叶片烘干，再粉碎过60目筛；称取红腺忍冬叶干粉置于园底烧瓶中，再加乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，完成后，趁热抽滤，合并两次提取液，并使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至2ml/lg药材；再用醋酸溶液配成壳聚糖胶体作为澄清剂，对浓缩液进行沉淀初步除杂；初步除杂后澄清液再上DlOl大孔树脂进行纯化，就上柱溶液量、上柱溶液PH值及上柱溶液吸附流速对绿原酸吸附效果的影响进行考察，确定最佳上柱吸附条件，最佳上柱吸附条件为:固液比-树脂Ig: 6ml上柱溶液、乙醇pH为2、流速为40滴/min;经最佳上柱吸附条件吸附后，再就洗脱剂浓度、洗脱剂体积、洗脱剂pH值和洗脱流速对绿原酸洗脱效果的影响进行考察，确定洗脱条件；上述洗脱液乙醇相使用旋转蒸发仪进行浓缩，再在真空干燥箱中真空干燥，干燥物以热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1: 2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品；绿原酸粗品再用甲醇溶解，再结晶，得到白色针状晶体，真空干燥；再进行薄层分析，以乙酸乙酯:甲酸:水=10: I: 2为展开剂展开，以三氯化铁乙醇溶液为显色剂，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
2.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括绿原酸含量测定方法，具体步骤为: 步骤I，标准样溶液的制备 精密称取绿原酸对照品lmg，置50mL量瓶中，加无水乙醇，使其完全溶解并稀释至刻度。摇匀，即得，每ImL中含绿原酸20ug; 步骤2，最大吸收波长的确定 将绿原酸标准样溶液在200 400n`nl进行紫外扫描，最大吸收波长为328nm，故选328m为检测波长； 步骤3，标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液l、2、4、6、8mL，分别用无水乙醇定容至IOmL容量瓶，摇匀。以无水乙醇作参比液，在328nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度C (ug/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线。
3.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，绿原酸的醇提方法为: 将IOg药材与IOOml的pH3，70%乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次； 完成后，趁热抽滤，并使用旋转蒸发仪在75度下进行浓缩，浓缩至2ml/lg药材，比色定量分析检测提取液绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
4.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，绿原酸的初步除杂方法为: 步骤I，壳聚糖的配制: 用I %的醋酸溶液配成I%的壳聚糖胶体作为澄清剂； 步骤2，对滤液澄清效果的考察:IOOml浓缩液中加入I %壳聚糖溶液8ml，搅拌，在60°C静置60min，过滤，检测除杂效果，肉眼看各处理组过滤液澄清效果、薄层分析比较大极性杂质即绿原酸斑点下方杂质斑点大小及绿原酸斑点大小，同时比色定量分析检测各处理绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
5.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括上柱条件的优化试验方法: 步骤I，树脂溶液处理量的确定方法 5g经预处理的DlOl大孔树脂分别加入四根层析柱，每根加5g树脂，5、10、15、20ml上述壳聚糖澄清液分别上柱，60滴/分钟反复动态吸附4次，定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，确定树脂最大吸附量； 步骤2，提取液pH值对吸附效果的影响 上述壳聚糖澄清液分别调pH值2、3、4、5，按最佳上样量上样，分别上柱吸附，60滴/分钟吸附，操作按上述处理，最后定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，算出各个水平吸附率大小，分析PH值对树脂吸附绿原酸量的影响； 步骤3，流速对吸附效果的影响 按上述最佳上样量及PH值，以40、60、80、100滴/分钟流速吸附，从生产成本和生产效益等方面考虑，确定最佳上柱吸附流速。
6.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括洗脱条件的选择方法: 步骤1，洗脱剂浓度的确定分别用pH8、20ml的10、20、40、60%乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同浓度的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择最佳洗脱剂； 步骤2，洗脱液体积 绿原酸洗脱率随洗脱体积增加而不断增大，分别用最佳PH值、15、20、30、40ml最佳浓度乙醇以最佳流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳洗脱体积，从解吸率来看解吸最佳洗脱体积。
步骤3，洗脱剂pH值 分别用PH6、7、8、9的20ml最佳浓度乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同PH值的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择洗脱剂最佳PH值，从洗脱率来看洗脱最佳pH值； 步骤4，洗脱液流速 分别用最佳PH值的20ml最佳浓度乙醇以40、60、80、100滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重；看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳流速，从洗脱率来看最佳洗脱流速。
7.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括样品含量的测定及相关计算方法: 绿原酸得率(% ) = (CXV/W0) X10_6X10_3绿原酸纯度(% ) = (CXV/D X 10_6X 10_3 式中，C为根据回归方程计算所得的绿原酸浓度(ug/ml) ;V为提取液体积(ml).χ为红腺忍冬叶干重(S)W1为提取物干重(g)。
树脂洗脱率公式为:B(100% ) = C1V1/[(C0-C2] X 100% B为洗脱率为原液中绿原酸浓度(mg/ml) ;C2为吸附平衡后滤液中绿原酸浓度(mg/ml) ；V为吸附原液体积(ml) ；B为洗脱率K1为洗脱液中绿原酸浓度(mg/ml) 为洗脱液体积(ml) ο
8.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括绿原酸的纯化方法: 步骤I，乙酸乙酯纯化 上述乙醇相干燥物以PH3的60°C热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比I: 2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次。
步骤2，结晶纯化 经乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品，用PH值3的甲醇溶解，再放在4°C下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥。
9.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括绿原酸的薄层分 析方法: 用毛细管分别取待测溶液和对照品溶液各5uL，点于距硅胶薄层板下边缘2cm的位置，点样斑点的直径为I 2mm。以乙酸乙酯:甲酸:水=10:1: 2为展开剂展开； 待展开8cm时，自然晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，在120°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
10.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为:乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20%，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43%，最佳上柱条件为:Ig: 6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
全文摘要
本发明公开了一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，该方法包括以下步骤药材前处理、乙醇回流提取、浓缩、过滤、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制得绿原酸精品，本发明获得了从中药红腺忍冬叶中分离，纯化绿原酸的最佳工艺条件用单因素和正交试验对红腺忍冬叶中绿原酸的分离，纯化工艺进行了最佳条件的筛选，采用正交表L9(34)，以乙醇体积、乙醇浓度、pH以及流速为因素，以绿原酸的紫外最大吸收波长320nm为指标进行试验。得到的红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43％，最佳上柱条件为1g∶6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
文档编号C07C67/48GK103183616SQ201210543580
公开日2013年7月3日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者舒孝顺, 卿婉华, 许凯扬 申请人:长沙理工大学