长因子5ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子10ng/mL、转 铁蛋白5 118/1]11、维生素0 25 118/1]11、人血清白蛋白111^/1]11和1，2,3,4,6-0-五没食子酰葡 萄糖10yM。
[0034] 制备方法：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因 子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、 维生素C、人血清白蛋白和1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。
[0035] 实施例四人脂肪间充质干细胞的无血清培养基 人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分 及其浓度：L-谷氨酰胺10mM、胰岛素样生长因子-1 5ng/mL、表皮生长因子2ng/mL、转化生 长因子-0 10 ng/mL、血小板源性生长因子Ing/mL、碱性成纤维细胞生长因子5ng/mL、转铁 蛋白11^/11^、维生素0 5 118/1]11、人血清白蛋白211^/1]11和1，2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄 糖 5yM〇
[0036] 制备方法与实施例三类似。
[0037] 实施例五人脂肪间充质干细胞的无血清培养基 人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括低糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分 及其浓度：L-谷氨酰胺ImM、胰岛素样生长因子-1 20ng/mL、表皮生长因子20ng/mL、转化 生长因子Ing/mL、血小板源性生长因子10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子20ng/mL、 转铁蛋白1〇1^/11^、维生素〇2〇118/1111、人血清白蛋白0.511^/1111和1，2,3,4,6-〇-五没食 子酰葡萄糖12. 5yM。
[0038] 制备方法与实施例三类似。
[0039] 实施例六人脂肪间充质干细胞的无血清培养基 人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分 及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子-1 10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化 生长因子5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子10ng/mL、转 铁蛋白5yg/mL、维生素C25yg/mL、人血清白蛋白111^/1111、1，2,3,4,6-0-五没食子酰葡 萄糖10yM和干细胞生长因子0. 3ng/mL。
[0040] 制备方法与实施例三类似。
[0041] 实施例七人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的增殖 将P1代人脂肪间充质干细胞以5000个/mL的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别用 培养基1和培养基2培养，置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养，每3天进行换液，在连续 10天的培养过程中在倒置相差显微镜下观察记录细胞形态，且每天分别将培养的细胞用 0. 25%胰酶消化，使用细胞计数板计数，计算其细胞密度，连续检测10 d，细胞密度对培养时 间绘制细胞密度随时间的变化曲线，结果如图3所示。从图3可知，本发明优选的无血清培 养基所培养的细胞增殖速率明显大于传统的含血清培养基。
[0042] 分别用培养基1和培养基2对P1代人脂肪间充质干细胞进行培养，培养至P10代 时的细胞形态图如图4所示。从图4可知，两种培养基培养得到的细胞形态并无显著性差 异，与原代细胞相比细胞形态也无显著性变化，保持了较好的干细胞幼稚形态，未出现老化 迹象。
[0043] 实施例八人脂肪间充质干细胞在不同培养基中培养后的干性基因表达 将P1代人脂肪间充质干细胞以3X105个/mL的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别 用培养基1和培养基2培养，置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养，培养48h之后提取RNA， 反转录，采用实时荧光定量q-PCR检测干性相关基因Sox-2、0ct4、Nanog的mRNA相对表达 量，结果如图5所示。从图5可知，培养基1所培养的人脂肪间充质干细胞的干性基因表达 明显优于培养基2培养的人脂肪间充质干细胞。
[0044] 实施例九人脂肪间充质干细胞在本发明提供的培养基中培养后的细胞表型检 测 将培养基1培养的人脂肪间充质干细胞继续培养到第10代，去掉培养液，PBS洗涤3 次，用0. 25%胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，调整细胞浓度，制成浓度为105个/mL 的单细胞悬液，使用藻红蛋白（PE)标记的⑶105,⑶73和⑶90单克隆抗体，和异硫氰酸荧 光素（FITC)标记的⑶45,⑶34,⑶14,⑶19和HLA-DR单克隆抗体，在4°C下孵育30min，用 PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，用500yL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测。 结果显示，采用本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基培养的脂肪间充质干细 胞经过10次传代培养，细胞表型中⑶105、⑶73和⑶90的阳性率大于95%，而⑶45、 ⑶34、⑶14、⑶19和HLA-DR的阳性率小于2%，结果如表1所示。从表1可知，本发明提供 的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基能够很好的保持人脂肪间充质干细胞的生物学特 性不变。
[0045]
实施例十人脂肪间充质干细胞在本发明提供的培养基中培养后的诱导分化 将培养基1培养的人脂肪间充质干细胞继续培养到第10代，消化收集后，以2X104个 /mL的密度接种于24孔板中，接种0. 5mL，在上述培养基中培养3d。当细胞长至80%汇合 度时，用成脂诱导剂（由培养基1添加1ymol/L地塞米松、200ymol/L吲哚美辛、0? 5mmol/ L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10ymol/L胰岛素得到）进行诱导分化。每3d更换一次诱导 培养基，诱导培养两周。两周后，将细胞进行油红〇染色，以观察细胞脂滴形成情况，成脂诱 导结果如图6所示，结果说明人脂肪间充质干细胞经成脂诱导剂诱导，能够分化形成脂肪 细胞，证明人脂肪间充质干细胞具有成脂分化能力。
[0046] 当细胞长至80%汇合度时，用成骨诱导剂（由培养基1添加0. 1ymol/L地塞米 松、50ymol/L维生素C、10mmol/L0 -甘油酸钠得到）进行诱导分化。每3d更换1次诱 导培养基，细胞经4周分化培养后，进行茜素红染色，以观察细胞成骨钙结节形成情况，成 骨诱导结果如图6所示，结果说明人脂肪间充质干细胞经成骨诱导剂诱导，可见大量黑色 矿化结节状沉积，证明人脂肪间充质干细胞具有成骨分化能力。
[0047] 当细胞长至80%汇合度时，用软骨诱导培养基（由培养基1添加110mg/L丙酮酸 钠、0. 15mmol/L维生素C、100nmol/L地塞米松、6. 25ng/L牛胰岛素、6. 25mg/L转铁蛋白 和10ng/mL转化生长因子得到）。每3d更换1次诱导培养基。诱导培养2周后，进行 Alcianblue染色，成软骨诱导结果如图6所示，结果说明蛋白聚糖基质产生，证明人脂肪 间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力。
[0048] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基， 还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺胰岛素样生长因子5~100ng/mL、表皮生 长因子l~50ng/mL、转化生长因子1~10 ng/mL、血小板源性生长因子l~10ng/mL、成纤维 细胞生长因子l~50ng/mL、转铁蛋白0. 5~10yg/mL、维生素C 5~50yg/mL、人血清白蛋白 0? 2~3mg/mL 和 1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖 I. 25~15 y M。2. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括 DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺l~10mM、胰岛素样生长因子 5~20ng/mL、表皮生长因子l~20ng/mL、转化生长因子1~10 ng/mL、血小板源性生长因子 l~10ng/mL、成纤维细胞生长因子l~20ng/mL、转铁蛋白0. 5~10yg/mL、维生素C 5~50yg/ mL、人血清白蛋白0. 2~3mg/mL和1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖5~12. 5 yM。3. 根据权利要求2所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括 DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子IOng/ mL、表皮生长因子10ng/mL、转化生长因子5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、成纤维 细胞生长因子10ng/mL、转铁蛋白5yg/mL、维生素C 25yg/mL、人血清白蛋白lmg/mL和 1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖10 y M。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征 在于：还包括0. l~lng/mL的干细胞生长因子。5. 根据权利要求4所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述干 细胞生长因子的浓度为〇. 2~0. 4ng/mL。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征 在于：所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。7. 根据权利要求1至5中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特 征在于：所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板源性生长因子 为TOGF，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因 子 -0。8. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在 于：包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因 子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、 维生素C、人血清白蛋白和1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基在人脂肪 间充质干细胞培养中的用途。
【专利摘要】本发明提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分：L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖。本发明属于干细胞技术领域，本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，能促进脂肪间充质干细胞的快速贴壁和快速增殖，保持良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105112364
【申请号】CN201510505096
【发明人】王一飞, 程江, 王巧利, 廖晓凤
【申请人】广州暨南生物医药研究开发基地有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月18日