用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方法

专利名称：用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方法
技术领域：
本发明一般涉及具有独特核糖体谱，即翻译活性的哺乳动物细胞亚群。本发明进一步涉及用于鉴定和分离这些细胞的方法、包含这些细胞的试剂盒，或利用这些哺乳动物细胞亚群的方法。
背景技术：
生物体中的正常生物活性结合了构成个体基因组的基因响应于外界的内源性表达。在高级真核生物中，基因表达开始于细胞核中，其中基因组DNA转录为pre-mRNA或“初级”RNA转录物。而仍在细胞核中，pre-mRNA被修饰为包括5'帽结构，形成异核核糖核蛋白 (hnRNP)复合体，获得3'多聚腺苷酸尾，并经历剪接以去除间插RNA序列(例如内含子)。 成熟mRNA接着输出到细胞质，在那里蛋白质复合体指导(1)经由5'帽结构与核糖体的缔合，称为帽依赖性翻译，或⑵与促进mRNA储存、加工或降解的胞浆RNA结合蛋白的相互作用。在核糖体驱使的翻译之后，3'-多聚腺苷酸尾的连续缩短导致mRNA体转运至核糖核酸酶(RNAse)的复合体(称为外来体)，其降解老化的mRNA并有效地终止蛋白质合成。如所预期的，基因表达是必定在特定时间、以特定速率和数量产生所需基因产物 (通常是多肽)的高度调节过程。除转录调节之外，转录后过程诸如mRNA衰变和翻译也是基因表达中的关键检查点。不足为奇的是，由基因突变或对外部刺激的异常反应所产生的细胞表达谱的改变会引起严重异常，该严重异常常常导致急性细胞死亡或慢性疾病表型的表现。由环境因素(诸如营养水平改变、细胞因子、激素和温度变动)以及环境应激(如低氧、低钙血、病毒感染和组织损伤)所引起的广泛或长时间的细胞刺激导致帽依赖性翻译的快速衰减。此过程是自适应性的，因为它缩减了立即应激反应和恢复所不需要的全蛋白质合成。然而，此翻译减弱并不完全消除核糖体活性，因为应激反应和恢复基因的许多产物继续由称为非帽依赖性翻译的替代过程来合成(评述于Guhaniyogi & Brewer，2001， Gene 265(1-2) :11-23)。非帽依赖性翻译通过将核糖体直接募集到称为内部核糖体进入位点(IRES)的特异性RNA结构而发生。IRES元件已经在许多真核生物mRNA中得到鉴定(Bormal S等， (2003)Nucleic Acids Res. 31 :427-4 )，并确保在“帽依赖性”翻译起始受到抑制时(即， 凋亡、饥饿、Y辐射、低氧、有丝分裂或终末分化)在细胞核失活或急性细胞应激期间蛋白质或其片段的高效表达。忽视对5' mRNA帽结构的需要最初被描述为不考虑感染细胞中细胞帽依赖性翻译的几乎完全抑制而翻译病毒RNA的机制(Jang等，1988，J. Virol. ,62 =2636-43)。一般来说，IRES序列无法由序列同源性鉴定，并且使用功能性试验验证了充分表征的IRES元件 (Mountford 禾口 Smith, 1995, TIG, 11(5) 179-184 ;Baird 等，2006，NAR, 12(10) :1755-85)。 当前证据显示，IRES RNA的构象和辅助蛋白与特异性mRNA序列的结合使核糖体能够结合。 在真核细胞中，IRES指导的翻译常常与含有特别长的热力学稳定的RNA二级结构的mRNA的5'非翻译区(5' UTR)相关联，所述二级结构具有多个短开放阅读框(ORF)，其显著抑制核糖体依赖性翻译的起始。然而，对于许多这些5 ‘ UTR IRES元件的IRES活性的功能验证因存在克隆自重叠5'基因启动子的转录效应子序列而复杂化。在IRES报告载体中采用这些5' UTR元件的尝试因这一剩余本底转录活性而复杂化，所述剩余本底转录活性掩盖了由这些序列产生的任何翻译调节。因此，非帽依赖性翻译和它的调节仍然是未研究的领域， 大体上利用翻译作为读出工具的系统也如此。发明概述本发明的一个目的在于提供用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法。所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，哺乳动物细胞用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA 分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群并重复所述测定、分离和生长步骤，直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群。本发明的另一个目的在于提供用于鉴定哺乳动物细胞翻译是否对一种物质有抗性或用于测定一种物质对哺乳动物细胞是否有毒性的方法。所述方法包括用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化哺乳动物细胞以形成稳定转化的细胞(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列， 该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；用至少一种毒素处理稳定转化的哺乳动物细胞的亚组以形成毒素处理细胞；测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定稳定转化的哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从稳定转化的哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；任选地用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群并重复所述测定、分离和生长步骤，直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群；使所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触；和所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触后，检测所述报告蛋白的存在或测定报告蛋白的水平，其中与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，所述物质的毒性和哺乳动物细胞翻译对物质的抗性和报告蛋白的存在或报告蛋白的水平增加相关， 并且与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，物质毒性的缺乏和哺乳动物细胞翻译对物质抗性的缺乏和不存在报告蛋白或报告蛋白水平降低相关。本发明的又一目的在于提供利用本发明的方法获得的具有独特核糖体谱的哺乳动物细胞亚群。与此相关，本发明进一步提供如本文中所定义的I类、II类和III类哺乳动物细胞。本发明的再一目的是提供试剂盒，其包含用于与I类细胞或其裂解物、II类细胞或其裂解物或者替代地III类细胞或其裂解物一起使用试剂盒的说明书。本发明的另一目的在于提供用于重组表达目标多肽的方法。所述方法包括向III 类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，该表达盒包含以下任一项(1)编码在受胁迫和/ 或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；使表达第二核酸表达盒的哺乳动物细胞在允许表达目标多肽的条件下生长；和纯化目标多肽。本发明还涉及用来产生目标多肽的哺乳动物细胞，目标多肽是通过包括以下步骤的方法获得向III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，该表达盒包含以下任一项 (1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；和使表达第二核酸表达盒的哺乳动物细胞在允许表达目标多肽的条件下生长。本发明的又一目的是提供用于鉴定参与非帽依赖性翻译的调节的蛋白质的方法。 所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞以形成毒素处理细胞，哺乳动物细胞用包含以下项的核酸表达盒稳定转化编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；由毒素处理细胞制备细胞裂解物；分离编码TR元件的mRNA和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列；使mRNA和来自细胞裂解物的蛋白质接触以形成与mRNA结合的蛋白质；和鉴定所述与mRNA结合的蛋白质。本发明还提供用于验证I类、II类或III类哺乳动物细胞保留它们的翻译表型的方法。所述方法包括用(多种)毒素处理I类、II类或III类哺乳动物细胞的亚组；测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的哺乳动物细胞亚组中由报告基因编码的报告蛋白的水平；验证哺乳动物细胞保留它们的表型，其中I类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白的表达高达500%，II类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的500%以上到 1400%，并且III类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的1400%以上到约75000%。本发明的再一目的在于提供用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法。所述方法包括使I类、II类或III类哺乳动物细胞与所述物质接触；和测定相比于未曾用物质处理的细胞所产生的报告蛋白的表达的与所述物质接触后由哺乳动物细胞所产生的报告蛋白的表达，其中由物质处理细胞所产生的报告蛋白的表达相比于未曾用物质处理的细胞所产生的报告蛋白表达的减少表明物质抑制蛋白质翻译。本发明的另一目的在于提供用于恢复所需哺乳动物细胞亚群的表型的方法。所述方法包括培养至少一个哺乳动物细胞亚组以形成培养细胞，其中用核酸表达盒稳定转化哺乳动物细胞，该表达盒包含用于选择标记的核苷酸序列和以下任一项(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；用选择标记对其提供抗性的物质处理培养的细胞，使得不再含有核酸表达盒的培养细胞死亡；使处理细胞生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地重复所述培养、处理和生长步骤，直到复原所需哺乳动物细胞亚群的表型。其它目的与特点将在下文部分显而易见并部分指出。附图简述

图1示出人HCT116细胞系对5_试验和15-试验程序的TR特异性反应。图IA显示用五个单毒素试验测试细胞的5-试验柱状图。表3中示出这些研究中所用毒素的组成和浓度。在此柱状图中，将TR特异性反应显示为对HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#30细胞系重复三次(每柱三个样本)进行的三个独立试验(三个柱)。使用标准微量酶标仪试验测定荧火虫荧光素酶(fLUC)蛋白活性并表达为处理培养物与未处理培养物的比率(即，诱导倍数)。每个柱代表超过1. 0的比率并指示表现TR依赖性翻译的细胞。TPA单毒素试验产生TR调节翻译的最显著增加。图IB示出由HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#38细胞系的三个重复样本产生的TR特异性反应的5-试验柱状图。这些结果强调了细胞反应的幅度差异。图IC示出HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#30细胞反应的15-试验柱状图。如上所述，重复三次进行所有试验。图IC示出在组合TPA+泰素的二毒素试验中TR调节翻译的极显著增加，这在单毒素5-试验中未观察到。图ID显示HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#38细胞系的15-试验柱状图。如前所述，在TPA+泰素处理的样本中观察到TR介导的翻译的较大增加。这证实在所测试的毒素之中，使用单毒素试验程序，TPA或泰素产生最佳的TR特异性反应。然而，在组合TPA+泰素处理中观察到的TR反应的较大增加证实TPA+ 泰素试验是所测试的二毒素组合中用于产生最大TR特异性翻译增加的最佳毒素试验。图2示出应用毒素试验程序鉴定翻译反应HEK293细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图2A左图示出由用mTRdm-fLUC表达载体稳定转化的人胚肾HEK293细胞池所产生的TR反应的15-试验柱状图。此图中毒素的组成和浓度如表3中所描述。使用微量酶标仪分析测定fLUC蛋白活性，将其表达为处理样本与未处理样本的比率(即，诱导倍数)。 右图示出表达人hTRdm-fLUC表达载体的HEK293细胞池的TR反应的15-试验柱状图。图2B示出由用小鼠mTRdm-fLUC (浅色柱)和人hTRdm-fLUC (深色柱)表达盒稳定转化的HEK293细胞池产生的TR反应的5-试验柱状图。这一直接比较显示在对TR序列的幅度或毒素反应上没有物种特异性差异。图2C示出对于来自HEK293 hTRdm-fLUC池的9个亚克隆的酶标仪结果的例子。不用毒素(UNT)或用TPA单毒素试验(TPA)处理重复三次的样本。对酶标仪值求平均并表示为未处理样本与处理样本的比率(诱导倍数)。对于具有统计上超出剩余两个重复值的范围的任何原始值的样本，指派可疑反应并在随后试验中对这些样本进行再筛选(用问号标注)。表现一致低值的样本(处于或接近给定增益设定下的酶标仪背景值)被视为无反应性的并从任何继续评估中去除(用XX标注)。本实施例中，9个随机样本返回为6个反应克隆(4. 1到17. 4的诱导倍数范围)、2个可疑克隆和1个表现背景值的克隆。图2D左表示出对于用TPA毒素试验处理的43个HEK293mTRdm-fLUC细胞亚克隆所观察到的诱导倍数和它们的类别指派。右上图示出43个HEK293 mTRdm-fLUC细胞亚克隆的呈等级顺序(χ轴上从最低到最高)与诱导倍数(y轴)的函数形式的曲线图，称之为等级图。右中图示出去除了最大的异常值物种来突出具有较小翻译反应的反应亚克隆的同一等级图。右表示出使用所有等级图结果的汇编来定义类别命名的类别指派。对于HEK293 mTRdm-fLUC细胞池，43个反应者中有25个(58. 1% )显示诱导倍数值在5. 0以下的低TR 特异性毒素反应(称之为I类细胞)，43个亚克隆中有13个(30.2%)表现II类表型(超过5.0到14.0的范围)，而43个亚克隆中有5个(11.6%)表现III类表型(超过14.0 的诱导倍数)。图2E左表示出对于82个HEK293 hTRdm-fLUC细胞亚克隆所观察到的诱导倍数和类别指派。右上图示出82个HEK293 hTRdm-fLUC细胞亚克隆的等级图。右表示出对于 HEK293 hTRdm-fLUC细胞池的类别指派。82个反应者中有50个(61. 0% )显示I类反应， 82个亚克隆中有27个(32.9%)表现II类表型，并且82个亚克隆中有5个(6. 1%)表现 III类表型。图2F上图是示出65个HEK293 mTRplp-fLUC亚克隆的等级图。下表示出对于 HEK293 mTRplp-fLUC细胞池的类别指派。65个亚克隆中有51个(78.5%)是I类细胞，65 个中有13个0% )表现II类表型，并且65个中有1个(1. 5% )显示III类反应。图2G上图是示出39个HEK293 CMV-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于 HEK293 CMV-fLUC池的类别指派；39个亚克隆中有34个(87. 2% )显示I类反应，39个中有4个(10. 3% )表现II类表型，并且39个中有1个O. 6% )产生III类反应。图3示出应用毒素试验程序鉴定翻译反应HEK293细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图3A上图是由用小鼠mTRdm-gLUCfeaussia荧光素酶)表达载体稳定转化的 HEK293细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的81个TR反应的等级图。下表示出对于HEK293 mTRdm-gLUC池的类别命名；81个亚克隆中有56个(69. 1% )显示I类反应， 81个亚克隆中有23个4% )表现II类表型，并且81个反应者中有2个O. 5% )显示 III类表型。图;3B上图是示出89个HEK293 hTRdm-gLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于 HEK293 hTRdm-gLUC池的类别指派；89个中有56个(62. 9% )显示I类表型，89个中有30 个(33. 7% )显示II类反应，并且89个中有3个(3. 4% )表现III类反应。图3C上图是示出来自HEK293 mTRplp-gLUC亚克隆的69个反应的等级图。下表示出对于HEK293 mTRplp-gLUC池的类别命名；69个中有58个(84. 1% )标记为I类细胞， 69个中有9个(13. 0% )表现II类反应，并且69个中有2个O. 9% )显示III类表型。图4示出应用毒素试验程序鉴定翻译反应U20S细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图4A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC (荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人骨骼骨肉瘤U20S细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的106个TR反应的等级图。下表示出对于U20S mTRdm-fLUC池的类别命名；106个亚克隆中有95个(89.6%)显示I类反应，106个亚克隆中有11个(10.4%)表现II类表型，并且106个反应者中有0个(0%) 显示III类表型。图4B上图是示出82个U20S mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于 U20S mTRplp-fLUC池的类别标记；82个中有81个(98.8%)显示I类表型，82个中有1个(1.2% )显示II类反应，并且82个中有0个(0% )表现III类反应。图4C上图是示出来自U20S CMV-fLUC亚克隆的79个反应的等级图。下表示出对于U20S CMV-fLUC池的类别命名；79个中有78个(98. 7% )标记为I类细胞，79个中有0 个(0%)展表现II类反应，并且79个中有1个(1.2%)显示III类表型。图5显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应MCF7细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图5A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC (荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人乳腺癌MCF7细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的11个TR反应的等级图。下表示出对于MCF7 mTRdm-fLUC池的类别命名；11个亚克隆中有6个(54.5%)显示I类反应，11 个亚克隆中有4个(36.4%)表现II类表型，并且11个反应者中有1个(9. 1%)显示III
类表型。图5B上图是示出36个MCF7 mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于 MCF7 mTRplp-fLUC池的类别命名；36个中有31个(86. 1 % )显示I类表型，36个中有3个 (8.3% )显示II类反应，并且36个中有2个(5. 6% )表现III类反应。图5C上图是示出来自MCF7 CMV-fLUC亚克隆的50个反应的等级图。下表示出对于MCF7 CMV-fLUC池的类别命名；50个中有45个(90.0% )标记为I类细胞，50个中有5 个(10. 0% )表现II类反应，并且79个中有0个(0% )显示III类表型。图5D上图是示出由MCF7 hTRdm-fLUC亚克隆产生的89个反应的等级图。下表示出对于MCF7 hTRdm-fLUC池的类别命名；89个中有68个(76. 4% )标记为I类细胞，89个中有17个(19.1%)表现II类表型，并且89个中有4个显示III类反应。图5E上图是示出由在MCF7转染池的二次筛选中分离的MCF7mTRdm_fLUC亚克隆所产生的92个反应的等级图。下表示出对于二次MCF7 mTRdm-fLUC池的类别命名；92个中有27个09.3%)标记为I类细胞，92个中有19个7%)表现II类表型，并且92 个中有46个(50. 0% )显示III类反应。图6显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应DU145细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图6A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC (荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人前列腺癌DU145细胞池的初级筛选在用TPA毒素试验处理之后所产生的22个TR反应的等级图。下表示出对于DU145 mTRdm-fLUC池的类别命名；22个亚克隆中有5个7% )显示I类反应，22个亚克隆中有13个(59. 1 % )表现II类反应，并且22个反应者中有4个 (18. 2% )显示III类表型。图6B上图是示出由在DU145转染池的二次筛选中分离的DU145mTRdm_fLUC亚克隆所产生的65个反应的等级图。下表示出对于二次DU145mTRdm-fLUC池的类别命名；65个中有10个(15.4%)标记为I类细胞，65个中有33个(50.8%)表现II类表型，并且65 个中有22个(33. 8% )显示III类反应。图6C上图是示出来自DU145 CMV-fLUC亚克隆的初级筛选的16个反应的等级图。 下表示出对于DU145 CMV-fLUC池的类别命名；16个中有14个(87. 5% )标记为I类细胞， 16个中有2个(12. 5% )表现II类反应，并且16个中有0个(0% )显示III类表型。图6D上图是示出由在DU145转染池的二次筛选中分离的DU145CMV_fLUC亚克隆所产生的55个反应的等级图。下表示出对于二次DU145CMV-fLUC池的类别命名；55个中有30个(54.5%)标记为I类细胞，55个中有22个00.0%)表现II类表型，并且55个中有3个(5. 5% )显示III类反应。图7显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应HCTl 16细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图7A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC (荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人结肠直肠癌HCTl 16细胞池的初级筛选在用dbcAMP(图7A-C)和TPA (图7D-E)单毒素试验处理之后所产生的21个TR反应的等级图。下表示出对于HCT116 mTRdm-fLUC池的类别命名； 21个亚克隆中有20个(95.2%)显示I类反应，21个亚克隆中有1个表现II类表型，并且21个反应者中有0个(0%)显示III类表型。图7B上图是示出12个HCT116 mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于HCT116 mTRplp-fLUC池的类别命名；12个中有11个(91.7%)显示I类表型，12个中有0个(0% )显示II类反应，并且12个中有1个(8. 3% )表现III类反应。图7C上图是示出来自HCT116 CMV-fLUC亚克隆的6个反应的等级图。下表示出对于HCTl 16 CMV-fLUC池的类别命名；6个中有6个(100.0%)标记为I类细胞，6个中有 0个(0% )表现II类反应，并且6个中有0个(0% )显示III类表型。图7D上图是示出由在HCT116转染池的二次筛选中分离的HCT116mTRdm_fLUC亚克隆所产生的39个反应的等级图。下表示出对于二次HCT116 mTRdm-fLUC池的类别命名； 39个中有四个(74.4%)标记为I类细胞，39个中有8个5% )表现II类表型，并且 39个中有2个(5. )显示III类反应。图7E上图是示出来自HCT116 hTRdm-fLUC亚克隆的21个反应的等级图。下表示出对于HCTl 16 hTRdm-fLUC池的类别命名；21个中有10个07.6%)归为I类，21个中有 7个(33. 4% )表现II类反应，并且21个中有4个(19. 0% )显示III类表型。图8显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应MDA231细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图8A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC (荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人乳腺癌MDA231细胞池在用dbcAMP单毒素试验处理之后所产生的9个TR反应的等级图。下表示出对于MDA231 mTRdm-fLUC池的类别命名；9个亚克隆中有9个(100.0% )显示I类反应，9个亚克隆中有0个(0% )表现II类反应，并且9个反应者中有0个(0% )显示III
类表型。图8B上图是示出33个MDA231 mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于MDA231 mTRplp-fLUC池的类别命名；33个中有33个(100.0%)显示I类表型，33个中有0个(0% )显示II类反应，并且33个中有0个(0% )表现III类反应。图8C上图是示出来自MDA231 CMV-fLUC亚克隆的17个反应的等级图。下表示出对于MDA231 CMV-fLUC池的类别命名；17个中有17个(100. 0% )标记为I类细胞，17个中有0个(0%)表现II类反应，并且17个中有0个(0%)显示III类表型。图9显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应H印G2细胞并把这些细胞指派到确定的类别。图9A示出由用CMV-fLUC、mTRplp-fLUC和mTRdm-fLUC表达载体(从左到右)稳定转化的人肝脏肝细胞癌HepG2细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的fLUC活性的柱状图。图9B上图是由用mTRdm-fLUC (荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人肝脏肝细胞癌ifepG2细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的5个TR反应的等级图。下表示出对于H印G2 mTRdm-fLUC池的类别命名；5个亚克隆中有0个(0%)显示I类反应，5个亚克隆中有3个(60. 0% )表现II类表型，并且5个反应者中有2个0% )显示III
类表型。图9C示出由H印G2 mTRdm-fLUC#16亚克隆所产生的TR反应的15-试验柱状图。 此图中毒素的组成和浓度如表3中所描述。使用微量酶标仪分析测定fLUC蛋白活性，将其表达为处理样本与未处理样本的比率(即，诱导倍数)。在TPA+泰素的二毒素试验中观察到fLUC活性的较大增加，这证实TPA+泰素处理是用于产生最大幅度TR特异性翻译反应的
最佳毒素试验。图10示出对确定类别的细胞系应用15-试验程序。图IOA示出经历15-试验程序的U20S mTRdm-fLUC #40 (浅色柱)和#109 (深色柱)亚克隆的柱状图。使用单毒素试验在图4中对两个亚克隆指派II类命名，但使用如实施例中所描述的细胞计数接种程序进行再分析。此图中毒素的组成和浓度如表3中所描述。两个亚克隆继续表现II类反应。应注意，图10中的Y轴显示为未处理对照的诱导百分比，而非先前图中的诱导倍数。可通过用百分比除以100来把诱导百分比变换为诱导倍数(例如，对照的1000%是10倍诱导)。图IOB示出使用细胞计数接种程序对四个HCT116 mTRdm-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前已在图7中对这些亚克隆指派I类命名。此柱状图说明由用TPA+泰素的二毒素试验处理的HCT116 mTRdm-fLUC 12-15、12_3、7_5和12-16 亚克隆(从左到右)在15-试验程序中所产生的增强TR反应。HCT116 mTRdm-fLUC 12-15 和12-3亚克隆继续表达I类表型，而HCT116 mTRdm-fLUC 7_5和12-16亚克隆显示III类表型。图IOC示出使用细胞计数接种程序对三个HCT116 mTRplp-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，在图7B中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验程序中由HCTl 16 mTRplp-fLUCll-20、3-ll和3-9亚克隆(从左到右)所产生的增强TR反应。HCT116mTRplp-fLUC 11-20亚克隆在TPA+泰素的二毒素试验中表达II类表型，而HCT116 mTRplp-fLUC 3_11和3_9亚克隆在TPA+泰素的二毒素试验中表现III类反应。图IOD示出使用细胞计数接种程序对两个HCT116 CMV-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图，使用亚最佳单毒素试验已在图7C中对所述两个亚克隆指派I类命名。此柱状图说明在15-试验程序中由HCT116CMV-fLUC 4-1和4_20亚克隆所产生的fLUC活性(从左到右)。在TPA+泰素的二毒素试验中HCTl 16 CMV-fLUC 4_1亚克隆继续表达I类表型，而 HCTl 16 CMV-fLUC 4_20亚克隆表现II类反应。图IOE示出使用细胞计数接种程序对四个MDA231 mTRdm-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前在图8A中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验方案中由MDA231mTRdm-fLUC 4-23、4_8、4_7和3_1亚克隆(从左到右)所产生的TR反应。在TPA+泰素的二毒素试验中，MDA231 mTRdm-fLUC 4-23,4-8和4_7亚克隆继续显示I类表型，而MDA231 mTRdm-fLUC 3-1亚克隆表现II类反应。图IOF示出使用细胞计数接种程序对四个MDA231 mTRplp-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前在图8B中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验程序中由MDA23ImTRplp-fLUC 3_12、5_2、5_13和2_17亚克隆(从左到右) 所产生的TR反应。在TPA+泰素的二毒素试验中，MDA231 mTRplp-fLUC 3_12、5_2和5-13 亚克隆仅表达I类表型，而MDA231 mTRplp-fLUC 2-17亚克隆表现II类反应。图IOG示出使用细胞计数接种程序对三个MDA231 CMV-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前在图8C中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验方案中由MDA231 CMV-fLUC 1-2U2-5和1_20亚克隆(从左到右)所产生的 fLUC活性。虽然MDA231CMV-fLUC 1-21,2-5和1-20亚克隆表现增加的fLUC水平，但每个亚克隆仍表达I类表型。图11示出用于通过集落形成和亚克隆来恢复确定类别的表型的方案。图IlA左图是由从II类MDA231 mTRplp-fLUC 2-17细胞系(用TPA单毒素试验处理)分离的113个二次亚克隆所产生的等级图。如实施例中所描述分离亚克隆。等级图示出TR反应为等级顺序(χ轴上从最低到最高)与诱导倍数(y轴)的函数。虚线是如图 IOF中所示的TPA特异性TR反应。显著比例的亚克隆显示相对于亲代细胞系的TR反应的增加。虽然大多数亚克隆表现II类TR活性，但仍有一小比例表现III类反应。右图是使用泰素单毒素试验对113个MDA231 mTRplp-fLUC 2_17亚克隆的分析。虚线示出来自图IOF 的泰素特异性TR活性。如上所述，显著比例的亚克隆显示II类表型，但一个亚组产生III 类反应。两个箭头指示在每个试验中的最大反应亚克隆是相同细胞系。图IlB左图是由从III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞系(用TPA单毒素试验处理)分离的70个二次亚克隆所产生的等级图。虚线是如图IOB中所示的TPA特异性TR 反应。大部分亚克隆显示III类TR活性，其中一小群表现与亲代细胞相比显著较大的TR 反应。右图是使用泰素单毒素试验对相同的70个HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆的分析。虚线示出来自图IOB的泰素特异性TR活性。所有亚克隆都显示III类反应，其中一个显著比例表现与亲代细胞系相比增强的TR活性。图IlC示出从MCF7 mTRplp-fLUC#43细胞系(用泰素单毒素试验处理)分离的95 个二次亚克隆的等级图。在图5B中对MCF7 11^1^1 -江肌#43细胞系指派111类命名。虚线是在15-试验程序中(未显示)由亲代细胞系所产生的TPA特异性TR反应。一定比例的二次亚克隆清楚地表现大于亲代细胞系的III类表型。图IlD示出从MCF7 mTRdm-fLUC#64细胞系(用泰素单毒素试验处理)分离的22 个二次亚克隆的等级图。在图5A中对MCF7 11^1 (1111-江肌#64细胞系给定111类命名。虚线是在15-试验方案中(未显示)由亲代细胞系所产生的泰素特异性TR反应。大多数二次亚克隆保留III类表型，并且显著比例显示与亲代细胞系相比增强的TR活性。图12示出通过对表达盒中的抗生素抗性标记物进行再选择来恢复确定类别的表型的结果。图12A示出先前均被指派III类表型的4个HCT116亚克隆的柱状图。HCT116 mTRdm-fLUC 7-2 和 12-16 是初级 HCT116 分离株。HCT116mTRdm-fLUC 亚克隆 #30 和亚克隆#38是从12-16原代细胞系分离的高反应二次亚克隆(图11B)。浅色柱示出用TPA+泰素的二毒素试验处理的高传代细胞系(P10-P20)。深色柱是用G418进行再选择以去除分离TR 表达质粒的细胞的相同培养物，其也已经用TPA+泰素的二毒素试验处理过。为进行比较， 利用最右侧的柱来示出由70个二次12-16亚克隆(图11B)产生的平均反应。下表示出在再选择之后所观察到的TR特异性活性的高度显著性增加。图12B示出由用TPA单毒素试验处理过的所述细胞系所产生的TR活性的柱状图。 下表示出在再选择过程之后的TR特异性反应的高度显著性增加。图13示出通过机械操纵对基础的非帽依赖性翻译的调节。图13A示出由使用汇合(浅色柱)和细胞计数(深色柱)程序接种的未处理 MDA231细胞系所产生的基础翻译活性的柱状图。把三个MDA231CMV-fLUC细胞系(1_21、
2-5、1-20)与四个mTRplp-fLUC(2-17、3-12、5-2、5-13)和四个 mTRdm-fLUC 细胞系(4-23,
3-1、4-8、4-7)进行比较。将细胞裂解，不用毒素处理进行分析，并把酶标仪值作为相对光单位绘图。大体上，每种细胞系都显示，相比于细胞计数方案(其产生分汇合的有丝分裂细胞培养物)，汇合接种程序(其使每平方厘米培养面积的细胞数最大化并导致产生汇合的有丝分裂后细胞培养物)导致显著更高的基础fLUC水平。图1 示出相同未处理细胞的柱状图，其中去除了 CMV结果来通过图解强化TR表达细胞系中的较低值。如前所述，大体趋势是汇合接种方法把更多细胞引入试验中并增加了基础水平的fLUC活性；然而，两个细胞系(mTRplp-fLUC 5_2和mTRdm-fLUC 4-8)在通过细胞计数程序接种的未处理细胞中表现增强的fLUC活性。图14示出在标准毒素试验中所产生的TR特异性报告蛋白活性与TR来源的翻译蛋白的相关性。图14A上图示出由从III类HCT116 mTRdm-fLUC 7-5亚克隆制备的细胞提取物所产生的fLUC活性的15-试验柱状图。下图示出用来指派III类命名的HCT116 mTRdm-fLUC 7-5细胞系的15-试验柱状图。在每个试验中检验相等数量的细胞。图14B示出使用抗荧火虫荧光素酶抗体显现的上述15-试验细胞提取物的 Western免疫印迹。在每个凝胶泳道中分析等量的总蛋白质。图14C示出对Western免疫印迹上的谱带强度的光密度测定分析的柱状图。高谱带强度处在X光片反应的线性范围之外并产生与直接细胞测定值相比的较低值。图15示出TR特异性报告蛋白活性与TR来源的翻译产物的相关性。图15A示出重组fLUC蛋白浓度(Sigma)作为相对光单位的函数的剂量反应曲线图。对于此曲线图，制备fLUC蛋白的连续稀释液并使用标准酶标仪程序进行测定。图15B示出使用15-试验程序，从III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆制备的细胞提取物的表。从每个提取物中取固定细胞数(总细胞数的1/10)并在酶标仪试验中测定。由每个样本提取物产生的相对光单位可通过图解与图15A中的已知蛋白质浓度进行比较。对于用确定的毒素试验处理6小时的III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞，使用总细胞数的1/10来确定fLUC蛋白浓度，并变换成定义为光单位/ μ g fLUC蛋白的比活性。图15C是由用15-试验程序处理的HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16细胞所产生的蛋白质提取物的Western免疫印迹。谱带强度(fLUC蛋白水平)与上面计算的蛋白质浓度良好相关。在每个凝胶泳道中分析等量的总蛋白质。
图 16-25 分别是质粒 pCMV-gLuc、pCMV-fLuc、phTRdm-fLuc、phTRdm-gLuc、 phTRplp-fLuc、phTRplp-gLuc、pmTdm-fLuc、pmTRdm-gLuc、pmTRplp-fLuc 禾口 pmTRplp-gLuc 的示意图。功能性质粒元件(限制性酶位点、复制起点、开放阅读框等)按需要用竖线、框和箭头表示。mDM =鼠 DM20 cDNA ；mP =鼠 PLP cDNA ；mTRd =鼠 TRdm ；mTRp =鼠 TRplp ；hDM =人 DM20 ；hP =APLP ；hTRd =人 TRdm，hTRp =人 TRpIp，fLuc =荧火虫荧光素酶；gLuc = Gaussia焚光素酶。图沈是鼠与人PLP/DM20编码序列和其TR元件的序列比对图。关键词mDM =鼠 DM20 cDNA;mP =鼠 PLP cDNA ;mTRd =鼠 TRdm[SEQ ID NO 1] ；mTRp =鼠 TRplp [SEQ ID NO: 2] ；hDM=人 DM20 ；hP=人 PLP ；hTRd =人 TRdm [SEQ ID NO 3]和 hTRp =人 TRplp [SEQ ID NO 4]。因为DM20序列省略了全长PLP编码序列中存在的一部分序列，所以图沈中DM20 序列的编号是不连续的，并且在省略的区段之后，DM20编号在比对序列的下面显示为连续的。在参照图26描述本文的序列时，在一些情况下利用对PLP/DM20核苷酸位置的双重编码，例如残基560/455 ；此用法指在替代者中的PLP和DM20编码，其中PLP编码如比对序列上面所示，并且DM20编码如比对序列下面所示。图27示出应用毒素试验程序来在MCF7乳腺癌细胞中区分蛋白激酶C(H(C)激活剂组(属特异性分子靶)内的毒素特异性影响(种特异性毒素作用)。图27A示出剂量反应试验，其中用不同剂量的TPA(剂量范围InM到500nM)处理 MCF7 CMV-fLuc亚克隆#44和#48的三个重复样本。在暴露于单毒素TPA试验6小时之后， 将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对原始值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。两个细胞系都显示fLuc蛋白合成随着TPA浓度增加的线性增加，在IOOnM TPA剂量下达到最大报告蛋白水平。随后使用此TPA浓度作为图27B中所示的苔藓抑制素1和苔藓抑制素2试验的对照。图27B示出剂量反应曲线，其中在单毒素试验中用IOOnM TPA，或用不同剂量的苔藓抑制素1 (500pM到500nM的剂量范围)(上图)或苔藓抑制素2 (InM到2. 5uM的剂量范围)(下图)处理MCF7 CMV-fLuc亚克隆#44和#48的三个重复样本。虚线代表由IOOnM TPA单毒素试验所产生的翻译反应水平。苔藓抑制素1的浓度(上图)涵盖图27A中所用的TPA浓度。虽然在IOOnM苔藓抑制素1试验中观察到最大翻译反应，但报告蛋白活性的幅度从未达到由IOOnM TPA试验所产生的fLuc活性水平。苔藓抑制素2剂量反应曲线(下图)采用更高的药物浓度(最大测试剂量是TPA和苔藓抑制素1最大量的5倍)。在最高测试剂量下(2. 5uM)，苔藓抑制素2产生与用IOOnM TPA所观察到的水平相一致的fLuc活性。图27C示出剂量反应曲线，其中用不同剂量的TPA (InM到500nM)处理MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#8、#27和#45的三个重复样本以定义TR翻译反应。在用TPA单毒素试验培养6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。所有细胞系都显示fLuc 蛋白活性随着TPA浓度增加的线性增加，在IOOnM TPA剂量下达到峰值。使用此TPA浓度作为图27D中所示的苔藓抑制素1和苔藓抑制素2试验的标准。图27D示出剂量反应曲线，其中在单毒素试验中用IOOnM TPA或用不同剂量的苔藓抑制素1 (500pM到500nM的剂量范围)(上图)或苔藓抑制素2 (InM到2. 5uM的剂量范
20围)(下图)处理MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#8、#27和#45的三个重复样本。和图27B — 样，虚线代表在每个细胞系中由IOOnM TPA试验所达到的翻译反应水平。苔藓抑制素1的浓度(上图)涵盖图27C中所示的TPA剂量反应曲线，并且在IOOnM苔藓抑制素1试验中表现最大活性。虽然苔藓抑制素2试验(下图)覆盖甚至更大的浓度范围，但在相似剂量下，TR特异性表达水平与苔藓抑制素1没有显著差异。苔藓抑制素1和苔藓抑制素2试验中的翻译反应的幅度从未达到在IOOnMTPA测试中所产生的fLuc活性。在此研究和其它类似工作中，IOOnM TPA、苔藓抑制素1和苔藓抑制素2单毒素试验之间的翻译差异在非帽依赖性试验中比图27B中的帽依赖性试验中大得多。帽依赖性试验与非帽依赖性试验之间的进一步差异是观察到增加的苔藓抑制素2浓度(最大TPA剂量的5倍)从未产生与IOOnM TPA试验相当的fLUC活性。因此，毒素试验程序可检测到激活PKC活性的化合物在帽依赖性翻译与非帽依赖性翻译之间的统计学显著差异。图观示出使用单毒素与组合毒素试验来在MCF7乳腺癌细胞中区分拓扑异构酶I 抑制剂属(喜树碱药物种类)内的毒素特异性翻译反应。这些结果还提供不具有对蛋白质翻译有先前已知作用的物质的例子，其选择性地降低翻译。图28A示出用不同剂量(IOnM到IOuM的范围)的下列拓扑异构酶1抑制剂处理的MCF7 CMV-fLuc亚克隆#65的剂量反应试验。喜树碱、拓扑替康、伊立替康和鲁比替康。 在单毒素试验中孵育6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理细胞样本中翻译反应的水平。喜树碱和鲁比替康显示类似的剂量反应，其中fLuc蛋白质表达在 IuM时达到峰值，而在更高剂量下下降到基础水平。相比之下，拓扑替康和伊立替康在单毒素试验中都没有显著改变帽依赖性翻译。图28B示出使用组合试验来检验拓扑异构酶1抑制剂对帽依赖性翻译的影响。在利用恒定的IOOnM TPA剂量的二毒素试验中使用不同剂量的拓扑异构酶1抑制剂(IOnM到 IOuM的范围)对MCF7 CMV-fLuc亚克隆#65进行一系列剂量反应试验。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。按照类似方式，喜树碱和鲁比替康与TPA协同作用来增加fLUC蛋白活性直到IuM剂量，但在更高浓度下仅表现fLUC活性的最低增加，而伊立替康未产生TPA特异性翻译反应的任何显著变化，拓扑替康仅在高剂量(即，5uM和IOuM)显示TPA抑制作用。图28C示出使用单毒素试验来在MCF7细胞中测定拓扑异构酶1抑制剂对非帽依赖性翻译的影响。用不同浓度(IOnM到IOuM的范围)的拓扑异构酶1抑制剂(喜树碱、鲁比替康、伊立替康和拓扑替康)处理MCF7mTRdm-fLuc亚克隆#27的三个重复样本。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理对照中翻译反应的水平。四种化合物均在低剂量下(IOnM和IOOnM)刺激非帽依赖性翻译，但只有喜树碱、鲁比替康和拓扑替康在较高剂量下(5uM和IOuM)表现降低的fLUC活性。具体来说，在高浓度喜树碱和鲁比替康试验中的fLUC活性导致蛋白质水平低于未处理的对照细胞(< 100% )。这些结果与伊立替康在所有测试浓度下都表现恒定量的fLUC活性形成对比。图28D示出对用IOOnM TPA加不同剂量(IOnM到IOuM的范围)的拓扑异构酶1 抑制剂处理的MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#27使用二毒素组合试验。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。 四种抑制剂在IOnM 二毒素试验中均与TPA协同作用来增加蛋白质活性。然而在较高的抑制剂浓度下，喜树碱、鲁比替康和拓扑替康拮抗TPA活性并表现降低的fLUC表达。对于喜树碱和鲁比替康，在IOuM 二毒素试验中的这一拮抗作用导致fLUC蛋白水平低于未处理对照细胞(<100% )。在最高剂量下，拓扑替康表现基础水平的表达。相比之下，伊立替康二毒素试验显示与TPA的协同作用以及在所有测试剂量下增强的fLUC活性。这些结果显示，除了它们对拓扑异构酶1的已知作用之外，高剂量的这些药物会抑制蛋白质合成，其中最大幅度的变化发生于毒素刺激的TR表达细胞系中。图四示出应用单毒素试验来在HEK293胚肾细胞中区分微管破坏剂药物种类内的药物特异性表型。动态细胞骨架结构对于正常细胞功能具有重要性。在微管的情况下，干扰微管蛋白亚单位蛋白的重塑会通过阻断细胞周期进程而产生显著的抗增殖活性。然而， 破坏微管的药物在微管蛋白结合之后表现显著的生物学差异。例如，诺考达唑和秋水仙碱结合不全相同的重叠蛋白序列下的微管，但两种化合物都阻断防止聚合和促进解聚的微管组装位点。长春花生物碱(诸如长春新碱与长春花碱)结合微管蛋白并诱导微管蛋白聚集形成防止微管组装的不溶性晶体。最后，泰素结合微管并使完整微管稳定，这干扰了它们在细胞分裂期间的解组装。图29A示出使用单毒素试验来测定微管破坏剂对用不同剂量(5nM到5uM的范围) 的下列试剂处理的HEK293 CMV-fLuc亚克隆#3的影响诺考达唑、秋水仙碱、长春新碱和泰素。在暴露6小时后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。诺考达唑、秋水仙碱和长春新碱在IOOnM与5uM的浓度之间表现报告蛋白活性增加。相比之下，仅在最高泰素剂量下(2. 5uM和5uM)观察到fLUC表达的显著变化。图29B示出用不同浓度(5nM到5uM的范围)的图29A中所列微管破坏剂处理的 HEK293 hTRdm-fLuc #53 (上图)和HEI^93 mTRdm_fLuc#12 (下图)亚克隆的剂量反应曲线。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。由人OiTRdm， 上图)和小鼠(mTRdm，下图)TR盒产生高度类似的TR表达谱。如同图29A中的帽依赖性试验，秋水仙碱和长春新碱在大于IOOnM的所有剂量表现增加的报告蛋白活性。相比之下，仅在高于250nM的诺考达唑浓度下才观察到报告蛋白活性的显著增加。如同帽依赖性试验， 仅在2. 5uM和5uM剂量下观察到泰素特异性报告蛋白增加。尽管秋水仙碱和长春新碱在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中展示了类似的翻译反应，但诺考达唑产生了独特的非帽依赖性反应。即使在两个试验中都在高泰素剂量下观察到了显著的翻译增加，但这种药物仍产生所有测试的微管破坏剂药物中最小的反应谱，这与它的独特活性相一致。图30示出人HEK293细胞系对更新的15-试验方案的TR特异性反应。图30A示出由HEK293 CMV-fLuc亚克隆#3产生的帽依赖性翻译反应的15-试验柱状图。这些研究中所用的毒素的组成和浓度如表3中所示。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。除了 TPA+拓扑替康(高剂量或HD) 二毒素试验之外，在所有其它TPA组合试验中观察到显著的帽依赖性fLuc产生。图30B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亚克隆#13产生的TR翻译反应的15-试验柱状图。使用标准微量酶标仪试验测定fLUC蛋白活性并表示为处理培养物与未处理培养物的比率(即，诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。除了 TPA+拓扑替康(HD) 的二毒素试验，在其它所有组合TPA试验中观察到TR调节翻译的高度显著性增加。图30C示出由HEK293 hTRdm-gLuc亚克隆#79产生的TR翻译反应的15-试验柱状图。如前所述，在药物施用6小时后在条件培养基中测定分泌性Gaussia荧光素酶(gLUC) 活性并将蛋白质活性表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理细胞中的翻译反应。虽然fLuc蛋白是一种经受胞内蛋白降解系统的胞浆蛋白并且gLuc是一种逃脱胞内降解并在细胞外累积的分泌性蛋白，但在图30B与图30C中的非帽依赖性表达谱强烈相关并表现与图30A中帽依赖性试验类似的差异。在TPA+卡西霉素二毒素试验中的非帽依赖性反应显示15-试验组中的最大翻译增加，这与在图30A的帽依赖性试验中观察到的最小诱导形成对比。此外，拓扑替康(HD)的抑制作用在所有单毒素与二毒素试验中是明显的，其中在TPA+拓扑替康(HD)试验中观察到最大变化。图31显示使用21-毒素试验程序来表征未知或先前未确定的物质对人HEK293胚肾细胞的影响。和在标准15-毒素试验中一样，21-试验配置采用5种毒素的单个和配对组合应用，并加入第六种物质。包括进第六种化合物需要把试验组扩增到21个单毒素与二毒素试验的总数。各种毒素的组成和浓度如表3中所描述。在本实施例中，先前未确定的物质是泰素。在此试验之前，未曾在HEK293细胞中于更新的15-毒素试验方案中测定组合泰素反应。图31A示出由HEK293 CMV-fLuc亚克隆#3产生的帽依赖性翻译反应的21-毒素柱状图。在暴露于化合物6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对三个重复的酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。虽然泰素在单毒素试验中(未知的)对帽依赖性flue蛋白产生具有最小影响，但TPA+泰素的二毒素试验(TPA+未知的)表现协同相互作用以及此组中最大的翻译反应。在二毒素试验中未观察到其它显著变化。图31B示出由表达fLUC报告蛋白的HEK293 hTRdm-fLuc亚克隆#13所产生的TR 特异性翻译反应的21-毒素柱状图。虚线代表由未处理细胞样本所产生的翻译反应。在此组中，泰素(未知)在单毒素以及秋水仙碱+泰素、卡西霉素+泰素、硼替佐米+泰素的二毒素试验中表现fLUC活性的较小协同增加，但在TPA+泰素或拓扑替康+泰素试验中没有。图31C示出由表达gLUC报告蛋白的HEK293 hTRdm-gLuc亚克隆#79所产生的 21-试验柱状图。在培养6小时之后，使用标准微量酶标仪试验在条件培养基中测定分泌性 gLuc活性并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。已知gLuc蛋白被分泌到培养基中，它逃脱了作用于fLUC蛋白的胞浆蛋白周转过程。因此，表观TR反应的任何差异可能是报告蛋白合成、分泌或降低的蛋白质周转方面的差异的结果。然而，尽管在fLuc与gLuc蛋白加工中存在差异，但由HEK293 hTRdm-fLuc 亚克隆#13和HEK293 hTRdm-gLuc亚克隆#79产生的反应谱显示强相关性。在秋水仙碱+ 泰素的二毒素试验中观察到最显著的变化，这可能是因两种微管蛋白结合药物对微管的组合作用而引起的蛋白质分泌改变的结果。图32示出使用21-试验程序来检测与!fepG2肝细胞癌和HEK293胚肾细胞的抗生素治疗相关的任何慢性影响。支原体去除试剂(MRA)或4-氧喹啉-3-羧酸衍生物是普遍应用于培养的哺乳动物细胞以治疗支原体污染的抗生素。MRA表现最低的毒性并且可应用较长的培养时期。本实施例中，在21-试验程序之前将MRA处理细胞(+MRA)与 150nM MRA 一起孵育7天。虽然把+MRA细胞维持在补充抗生素的培养基中，但将另一 MRA剂量用作未知化合物。未处理的-MRA培养物从未暴露于抗生素。标准毒素的名称和浓度在表3中给出。图32Α示出!fepG2细胞中持续MRA暴露的影响，而图32Β示出HEK 293细胞中MRA的影响。图32A上图示出由H印G2 mTRdm-fLuc亚克隆#16产生的TR反应的21-试验柱状图，所述亚克隆#16用 150nM MRA处理7天(浅色柱)或未用 150nM MRA处理(深色柱)。在用标准毒素处理6小时后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。下图示出相同数据组，其中去除了 TPA试验以突出在其它试验中观察到的反应。与单毒素和二毒素 TPA试验相比而言，抗生素处理的IfepG2细胞表现fLUC活性的最小差异。对于TPA试验，在每个测试中观察到显著的拮抗作用，并在TPA+秋水仙碱的二毒素试验中观察到fLUC表达的极大减少，其中与-MRA细胞相比，+MRA培养物表现fLUC活性约减少到1/2. 5。图32B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亚克隆#45产生的非帽依赖性翻译反应的 21-试验柱状图，所述亚克隆#45用 150nM MRA处理7天(浅色柱)或未用 150nM MRA 处理(深色柱)。与图32A中的H印G2细胞相比而言，HEK293细胞的慢性MRA暴露在21-试验方案中导致fLUC表达的近似均勻降低。然而，如图32A中一样，在TPA单毒素与二毒素试验中观察到最大幅度降低。这些结果支持以下理论对抗生素氟喹诺酮的长时暴露会以可测定的程度影响TR试验，具体地说，检测到了强的拮抗毒素特异性表型，涉及TPA毒素。图33示出应用毒素试验程序来鉴定HEK293细胞中与翻译抑制剂相关的毒素特异性和细胞特异性影响。图33A示出剂量反应柱状图，其中用各种浓度(剂量范围IOnM到25uM)的下列翻译抑制剂处理HEK293 CMV-fLUC亚克隆#3 (上图)、hTRdm-fLUC亚克隆#13 (中图)和 mTRdm-fLUC亚克隆#45 (下图)放线菌酮、茴香霉素、嘌呤霉素和吐根碱。在足够大的剂量下，这些抑制剂立即停止蛋白质翻译，并且所得蛋白质周转使报告蛋白水平降低到未处理细胞水平以下(< 100%对照)。翻译抑制剂对帽依赖性翻译(HEK293 CMV-fLUC亚克隆#3数据，上图)和非帽依赖性翻译(HEK293 hTRdm-fLUC #13和mTRdm-fLUC #45亚克隆，中图和下图)表现一些类似影响。例如，250nM浓度的每种抑制剂足以把蛋白质合成降低到对照细胞水平以下。此外，抑制剂剂量的额外增加(高至25uM，或100X)仅产生报告蛋白活性的最小额外降低。另外，嘌呤霉素需要2. 5uM的浓度来把报告蛋白水平降低到与其它三种抑制剂可比较的水平。与这些相似性形成对比，茴香霉素和吐根碱在HEK293CMV-fLUC#3 (上图)与mTRdm_fLUC#45 (下图)亚克隆中表现明显不同的活性。在这些细胞中，低剂量的茴香霉素( 25nM)和吐根碱(IOOnM)足以把报告蛋白水平降低到未处理对照细胞的水平以下。最后，在单毒素25uM 试验中fLUC蛋白活性下降30-40%表明，fLUC蛋白在HEK293细胞中表现超过6小时的半衰期。图3!3B示出用IOOnM TPA与各种浓度(剂量范围IOnM到25uM)的图33A所列翻译抑制剂相组合的二毒素试验处理的HEK293 CMV-fLUC#3 (上图)、hTRdm_fLUC#13 (中图) 和mTRdm-fLUC#45 (下图)亚克隆的剂量反应柱状图。对于HEK293 CMV-fLUC #3 (上图)和mTRdm-fLUC#45(下图)亚克隆，茴香霉素和吐根碱在最低测试剂量下(IOnM)拮抗TPA 反应并且与TPA单毒素试验相比降低报告蛋白水平50-300 %。这与嘌呤霉素形成对比，在三个细胞系中嘌呤霉素都需要250nM的浓度Q5X)来起初把蛋白质合成降低到TPA单毒素试验水平以下。单毒素结果暗示，嘌呤霉素需要相当高的剂量来把报告蛋白水平降低到与其它三种抑制剂可比较的水平。例如，CMV-fLUC #3亚克隆需要2. 5uM的嘌呤霉素剂量来与其它抑制剂相关联，这与hTRdm-fLUC #13和mTRdm-fLUC #45亚克隆需要25uM嘌呤霉素浓度(10X增加)形成对比。如图33A中一样，在二毒素试验中于25uM抑制剂浓度下报告蛋白水平下降40%支持fLUC半衰期估计值为约6小时。图 3!3B 中在HEI^93 hTRdm-fLUC #13 与HEI^93 mTRdm_fLUC#45 亚克隆之间观察到明显的细胞特异性差异，而在最高测试剂量下05uM)观察到另一显著差异。为突出这一差异，图33C示出仅在25uM抑制剂剂量下对于HEI^93 hTRdm-fLUC #13和冊以93 mTRdm-fLUC #45亚克隆的单毒素与二毒素试验的反应柱状图。与在两个试验中显示相当的报告蛋白水平的HEK293 hTRdm-fLUC #13亚克隆形成对比，HEK293mTRdm_fLUC #45亚克隆对于在此剂量下的放线菌酮、嘌呤霉素和吐根碱，所表现的降低很少或没有低于未处理对照细胞水平。 统计分析(下表)确认在二毒素试验中两个亚克隆之间的这一差异的显著性。因为对于 HEK293 mTRdm-fLUC #45亚克隆的单毒素试验显示此细胞系对此剂量下的这三种抑制剂敏感，所以这一结果与暴露于TPA之后在这些细胞中的蛋白质代谢改变相一致。整个附图中对应的参考字符表示对应的部分。定义术语“基因”指包含对于产生多肽或前体或RNA(例如，tRNA、siRNA、rRNA等)所必需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)即可。本术语还涵盖结构基因的编码区和在5'与3'端两者上与编码区相邻的序列， 使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'端并存在于mRNA上的序列称为 5'非翻译序列。位于编码区的3'端或编码区下游并存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA与基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有编码区，其可穿插有称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列。内含子从细胞核或初级转录物去除或“剪接掉”，并因此在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。mRNA在翻译期间起作用来指定新生多肽中氨基酸的次序或顺序。术语“表达载体”指包含核酸表达盒的病毒和非病毒载体。术语“表达盒”用来定义含有可操作地连接到编码序列的调节元件的核苷酸序列， 所述调节元件导致编码序列在细胞中的转录与翻译。“哺乳动物启动子”指在哺乳动物细胞中起作用或来源于哺乳动物细胞的转录启动子，或二者兼而有之。“哺乳动物最小启动子”指经由RNA聚合酶结合来正确起始转录所必需的‘核心’DNA序列，但其在不存在任何可操作地连接的转录效应子序列时仅表现象征性的转录活性。用语“开放阅读框”或“编码序列”指编码多肽或蛋白质的核苷酸序列。在真核生物中编码区在5'侧邻接编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”，而在3'侧邻接指定终止密码子的三个三联体(即，TAA、TAG和TGA)之一。“可操作地连接”定义为意指使核酸与另一核酸序列处于功能关系。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录则将其可操作地连接到该编码序列；或者如果核糖体结合位点的定位以便于翻译则将其可操作地连接到编码序列。一般来说，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的。不过，增强子并不必需是邻接的。连接是通过在便利的限制性位点处的接合来完成。如果这类位点不存在，那么根据常规实践使用合成性的寡核苷酸衔接子或接头。“重组的”指方法、试剂和实验室操纵的结果，其中将核酸或其它生物分子用酶学方法、化学方法或生物学方法裂解、合成、组合或以其它方式离体操纵以在细胞或其它生物系统中产生所需产物。术语“重组DNA”指由借助于分子生物学技术接连在一起的DNA片段构成的DNA分子。“转染”是用来描述向真核细胞中引入外源物质(诸如外源DNA)的术语。它与“转化”和“转导”可交换地使用，但后一术语在它的更狭窄范围内指通过病毒(充当载体)向细胞中引入DNA的过程。因此，经历转染的细胞称为“转染的”、“转化的”或“转导的”细胞。本文中使用的术语“质粒”指DNA的独立复制小片。它通常是圆形的和双链的。“报告基因”指可使用本领域技术人员已知的常规技术检测或测定其表达的任何基因。术语“调节元件”或“效应子元件”指转录启动子、增强子、沉默子或终止子，以及指任何翻译调节元件、聚腺苷酸化位点等等。可排列调节元件和效应子元件使得它们允许、 增强或便于选择性产生经它们调节的成熟编码序列。术语“载体”指外源DNA片段可插入其中的DNA分子。一般来说，它们含有目标调节序列和编码序列。术语载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒载体和穿梭载体。“穿梭”载体是能够进行原核复制但不含有真核复制序列的质粒载体。在此复制缺陷型穿梭载体内含有的病毒DNA序列指导在真核宿主细胞内的重组以产生感染性病毒颗粒。本文中使用的术语“物质”指具有明确的化学组成的物质。它在本文中与术语“化合物”可交换地使用。 术语“病毒载体”指含有外源遗传物质以供递送到它感染的细胞中的病毒。“复制缺陷型”病毒载体不能够在“野生型”或以其它方式未操纵的哺乳动物细胞中复制。大量此类病毒的产生要求生产细胞系用辅助病毒共转染或以其它方式修饰来提供或补充缺失的功能。“复制竞争型”病毒载体是能够感染细胞并经历DNA复制、病毒包装和从被感染细胞释放的载体。本文中使用的“条件复制型，，病毒载体是设计成在特定细胞类型中选择性表达使得避免非所需广谱感染的复制竞争型载体。条件复制可通过在载体中包括可操作地连接到早期病毒基因的组织特异性、肿瘤特异性或细胞类型特异性或其它选择性诱导的调节性控制序列来实现。术语“应激”和“毒性”用来指代对细胞天然的生物化学和生物物理稳态的干扰。 然而应激一般导致细胞稳态的恢复，而毒性反应最终导致细胞死亡。
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优选实施方案的描述本发明涉及表现独特核糖体谱的哺乳动物细胞亚群，这通过不同的翻译活性来证明。一旦哺乳动物细胞或细胞系用本文中描述的表达盒稳定转化，就可鉴定出所需的细胞亚群。重要的是，可操纵这些细胞亚群来表现帽依赖性翻译或非帽依赖性翻译。因此，在一个实施方案中，本发明是针对用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法。方法包括以下步骤。用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，哺乳动物细胞用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型。如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物。使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群。任选地，用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群，并重复测定、分离和生长步骤直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群。本发明中所采用的翻译调节(TR)序列(又称为“TR元件”)是IRES元件，其可通过(a)它的核酸序列文本和(b)调节翻译的细胞活性(第2006/0173168号美国公布的专利申请，其以引用的方式并入本文)与5' UTR IRES相区别。这两个特点相结合形成用于可操作地连接到此IRES序列的下游编码序列在受胁迫和/或垂死哺乳动物细胞中选择性翻译的基础。因此，本发明涵盖任何哺乳动物IRES作为TR元件的用途，所述TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中选择性表达。在一些实施方案中，本发明的IRES元件具有非帽依赖性翻译活性，其位于哺乳动物蛋白脂质蛋白(PlP)基因的ORF内。在其天然环境中，pip IRES活性存在于含有数个上游0RF(〃 uORF")的多顺反子RNA内，所述数个上游ORF有效阻断正常细胞中对内部AUG 密码子的核糖体扫描。然而，将细胞暴露给毒剂导致核糖体结合和从特异性内部RNA序列的翻译使得内部氨基酸序列从pip ORF的3'端翻译(例如，PIRP-M和PIRP-L肽)。在另一实施方案中，TR元件来源于DM20变体。 在一些实施方案中，本发明的TR元件来源于pip基因的外显子1-7。尽管不受具体理论的束缚，但仍认为外显子1到4足以基于突变分析数据来编码功能IRES活性。此外， 认为TR调节系统(其参与应激/死亡特异性翻译)位于外显子6和/或7内。在一些实施方案中，TR元件来源于小鼠。与US 2006/0173168中公开的在垂死细胞中表达的IRES元件相比，本发明的来源于PLP/DM20的小鼠来源TR元件在所有以下特点方面有所不同1)核苷酸1(在SEQ ID Nos. 1和2中)由A突变为T以去除髓鞘蛋白脂质蛋白 PLP和DM20 cDNA中指导全长PLP和DM20的合成的野生型AUG起始密码子以阻止这种合成发生；2)核苷酸4由G突变为A以便在PLP和DM20 cDNA的第二可能阅读框中产生终止密码子来阻止其全长合成；3)核苷酸6、7和8分别由C突变为T、由T突变为G和由T突变为A以在PLP和
27DM20 cDNA的第三可能阅读框中产生终止密码子来阻止全长PLP和DM20的合成；4)核苷酸17和18分别由G突变为A和由T突变为G以在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)开放阅读框中产生第一终止密码子来阻止它们的全长合成；5)核苷酸21由T突变为A以便在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)开放阅读框中产生第二终止密码子来阻止其全长合成；6)核苷酸27由A突变为T以便从PLP和DM20 cDNA的第三可能阅读框中去除AUG 密码子从而在不存在野生型AUG密码子时阻止框外(out-of frame)翻译起始；和7)从PLP和DM20 cDNA中缺失终止密码子以减少对下游开放阅读框的翻译的干扰。如下面所讨论，本发明的来源于鼠PLP/DM20的TR元件不=指导PIRP-M或PIRP-L 肽的翻译。除以上变化之外，也将下列突变引入来自cDNA的DM 20变体的TR元件中1)核苷酸511由A突变为T以便去除DM20变体中指导PIRP-M蛋白合成的第一框内(in-frame)内部AUG起始密码子来阻止这种合成发生；和2)核苷酸598由A突变为T以去除DM20变体中指导PIRP-L蛋白质合成的第二框内内部AUG起始密码子以便阻止这种合成发生。类似地，将下列突变弓I入来自cDNA的鼠PLP变体的TR元件中1)核苷酸616由A突变为T以便去除PLP变体中指导PIRP-M蛋白质合成的第一框内内部AUG起始密码子来阻止这种合成发生；和2)核苷酸703由A突变为T以去除PLP变体中指导PIRP-L蛋白质合成的第二框内内部AUG起始密码子以便阻止这种合成发生。在优选的实施方案中，TR元件选自人或小鼠TR元件。更优选地，TR元件选自鼠序列 TRdm(SEQ ID NO 1)和 TRplp(SEQ ID NO 2).TRdm核酸序列(SEQ ID NO 1)来源于小鼠蛋白脂质蛋白基因1的DM20剪接变体 cDNA，但在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、511和598处进行了修饰。此外，编码终止密码子的最后3个核苷酸被去除。TRplp核酸序列(SEQ ID NO 2)来源于小鼠蛋白脂质蛋白基因1的PLP剪接变体 cDNA，并且它在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、616和703处含有修饰。TRplp与TRdm 的不同之处在于存在核苷酸349-453。编码终止密码子的最后3个核苷酸被去除。在一些实施方案中，TR元件来源于人。举例来说(但不限于)，IRES元件来源于人PLP/DM20序列。更优选地，来自人PLP序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID N0:3，而来自人DM20序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID NO :4。在一些实施方案中，TR元件包含与参照序列的突变变体相同的核苷酸序列，其中参照序列包含A)对应于图沈PLP序列的至少核苷酸1-831并且与其具有至少62%序列同一性的PLP核苷酸序列，或B)对应于图沈DM20序列的至少核苷酸1_726并且与其具有至少62%序列同一性的DM20核苷酸序列；并且参照序列包含C)在图 26 PLP 核苷酸位置 41_48、50-56、75_81、150-156、200-205、227_244、 251-257和563-570，或在与其对应位置上的多聚嘧啶束(polypyrimidine tract),
D)在图26 PLP核苷酸位置1-3、616-618、703_705和811-813，或在与其对应位置上的ATG序列，E)在图 26 PLP 核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223 和 305-308，或在与其对应位置上的GNRA序列，和F)在图沈PLP核苷酸位置503-512，或在与其对应位置上的18S rRNA结合位点； 其中(G)突变变体(1)包含参照序列的突变，所述突变(a)消除 ATG1、ATG616 和 ATG703，和(b)在图洸PLP核苷酸位置2-4、6-8、16_18和19-21，或在与其对应位置上引入终止密码子序列；和(2)保留多聚嘧啶束(C)、GNRA序列(E)和18S rRNA结合位点(F)。在一个优选的实施方案中，(A)或(B)的序列同一性为至少或约70%，并且更优选地为至少或约80%。 在另一实施方案中，突变(Gl)通过将每一 ATG转变为TTG来消除ATG1、ATG616和ATG703。 在一个实施方案中，参照序列是脊椎动物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID NO 5)或脊椎动物 DM20共有序列，后者包含从其中缺失核苷酸349-453的所述脊椎动物PLP共有序列。在另一实施方案中，参照序列是哺乳动物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID N0:10)或哺乳动物DM20 共有序列，后者包含从其中缺失核苷酸349-453的所述哺乳动物PLP共有序列。在哺乳动物序列中，对核苷酸使用下列标准缩写m是a或(、！~是3或8、《是3或18是(或g、y
η是a或c或g或t。在某些实例中，可操作地连接到TR序列的序列元件可能干扰由TR表达盒所展示的选择性翻译活性或表现次佳的翻译活性。为减轻所连接ORF对TR活性的任何影响，本发明提供所公开核苷酸序列的密码子使用变体(codon-usage variant)，其采用不改变所表达多肽的多肽序列(因而不影响其生物活性)的替代密码子。这些变体是基于遗传密码的简并性，借此几种氨基酸由不止一个密码子三联体来编码。一个例子是密码子CGT、CGG、CGC 和CGA，其均编码氨基酸精氨酸(R)。因此，一种蛋白质可由精确序列不同但仍编码具有相同氨基酸序列的多肽的变体核酸序列来编码。基于密码子利用/偏好，可对密码子进行选择来优化ORF的翻译效率，而不影响由TR表达盒进行的调节翻译。定点诱变是一种用于通过改变一个或多个所需位置上的核苷酸序列来产生序列变体的特别有用的方法。定点(或位点特异性)诱变使用包含具有所需突变以及足够数目的相邻核苷酸的DNA序列的寡核苷酸序列来提供具有足够尺寸和复杂度的序列以在所提议突变的两侧上形成稳定双链体。通常，优选的是长约20到25个核苷酸的合成引物，其中在序列中所提议突变的两侧上的约5到10个残基被改变。适用于定点诱变的典型载体包括所公开的载体，以及任何商业上或学术上可利用的质粒载体。一般来说，通过使适当的 DNA寡核苷酸序列与靶DNA退火并通过本领域中已知的PCR程序扩增靶序列来引入核苷酸取代。本发明涵盖在编码序列中使用每个可能的密码子以用于产生根据本发明使用的所需 ORF序列。可使用定向进化技术来制备具有改进TR功能的序列变体。在定向进化技术中，可从含TR的多核苷酸开始，进行至少一轮核酸突变或核酸剪接或同源重组。突变、剪接和同源重组可按定向或随机方式进行。例如，可设计一个或多个寡核苷酸用于如上所述的TR元件的定点诱变，或者可使一个或多个随机产生的寡核苷酸与起始的含TR多核苷酸模板接触。替代地或此外，可在允许误差的条件和/或易错的聚合酶下进行起始模板的PCR扩增以允许引入突变，这种技术称为“错误倾向”PCR(" sloppy" PCR)。类似地，可按定向或随机方式对一组同源的含TR元件的多核苷酸进行剪接或重组。例如，可使用一种或多种限制性核酸内切酶来随机地或按预定方式消化同源多核苷酸模板，并接着将所得片段接合在一起。替代地或此外，可在体外或体内，将这组含TR元件的多核苷酸在有助于它们之间的同源重组的条件下合并并处理。特别是，可在数目上组合或扩增对于TR特异性翻译效率较为重要的调节序列，使得产生含有多个拷贝的序列。对此工作，可采用突变和剪接或重组技术的任何组合。这些技术中的任一项可进行一轮或不止一轮。在一轮或多轮突变、剪接和/或重组之后，接着测试所得的多核苷酸以针对TR活性进行筛选。通常，这可通过将报告分子编码序列置于已经产生的一个或多个TR变体的可操作控制之下来进行。接着使所得构建体在置于可发生TR翻译的条件(诸如应激条件) 之下的细胞中表达。所述测试可用来检测在TR元件功能方面的所需改进。例如，在TR元件翻译对应激条件的特异性、TR元件激活对细胞应激反应的敏感性(例如，在细胞应激和 /或死亡之前的生物化学变化)或在TR元件激活之后翻译起始的效率(即，幅度)的方面中任一方面的改进可以是所述试验的焦点。基于试验结果，可选择一个或多个改进的TR元件来使用或进一步开发；在一些实施方案中，选定的改进TR元件核酸可用作另一轮或另外数轮定向进化的一个起始多核苷酸或一组起始多核苷酸。在本文的各个实施方案中，TR元件可包含或可通过PLP/DM20多核苷酸的突变制得，所述突变包含以下碱基或对应于以下碱基的碱基图沈鼠或人PLP/DM20 DNA序列的约27到约615/510 ；并且这可进一步包含以下碱基或对应于以下碱基的碱基约616/511 到约702/597的碱基、约703/598到约772/666的碱基和/或约773/667到约810/705的碱基。例如，TR元件可包含或可通过PLP/DM20多核苷酸的突变制得，所述突变包含约27 到约810/705的碱基或对应于碱基约27到约810/705的碱基，其中省略或不省略碱基约 616/511到约702/597，参照图26编号。在PLP/DM20编码序列和其TR元件或由其构建的TR元件中，可在对应于参照图 26陈述的下列PLP/DM20位置的一个或多个位置上进行突变，但对TR元件功能无不利影响，即位置:01、02、03、04到21(包括此片段全部或一部分缺失)、25、26、314、332、560/455、 614/509,622/518到696/591 (包括此片段全部或一部分缺失，其去除外显子5)、616/511、 703/598、806/701、811/706、817/712、818/713 和 827/722。在各个实施方案中，除前述以外的其它核碱基在PLP/DM20编码序列中可为保守的。例如，在各个实施方案中，PLP/DM20 编码序列的核碱基序列由此可在对应于PLP核苷酸位置41-48、50-56、75-81、150-156、 200-205,227-244,251-257和563-570的核苷酸位置上包含多聚嘧啶基序。在一些实施方案中，这种序列可进一步在PLP位置270-274、299-303、490-494、578-582、597-601中的一个或多个上包含多聚嘧啶基序；而在一些实施方案中，还在PLP位置626-632、642-648、 669-674、707-712、755-761、767-771和800-804中的一个或多个位置上包含多聚嘧啶基
3序。类似地，在各个实施方案中，PLP/DM20编码序列的核碱基序列由此可在对应于 PLP 核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223、305-308 的核苷酸位置上包含 GNRA基序；并且在一些实施方案中进一步在635-638上包含GNRA基序；以及在其它实施方案中， 进一步在位置3四-332、343-346和572-575中的一个或多个位置上包含GNRA基序；而又在一些实施方案中，进一步在位置650-653和683-686中的一个或多个位置上包含GNRA基序。然而，如上文所述，可在下列位置进行突变而无不利影响并且在一些情况下具有增强作用:01、04、06、07、08、17、18、21、27。在一些实施方案中，这些突变可为以下中的一个或多个:01t、04a、06t、07g、08a、17a、18g、21a* 27t。可进行突变但对功能无不利影响的其它位置包括在以下PLP位置中的一个或多个位置25、26、314、332、560/455、616/511、 703/598、806/701、811/706、817/712、818/713 和 827/722。在一些实施方案中，这些可为以下中的一个或多个:25g、26c、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、 811/706t、817/712a、818/713a 和 827/722g。此外，可在 PLP 位置 614/509 上插入例如多达或约5个核苷酸，而对功能无不利影响。此外，与位置831/726的融合，例如报告基因或其它靶基因编码序列与其的框内融合，未表现对TR元件功能的任何不利影响。在另一实施方案中，本发明的TR元件来源于脊椎动物PLP或DM20序列而非人或小鼠。在一些实施方案中，这可以是灵长类、马、牛、羊、猪、犬、猫、兔、有袋类、鸟类、鱼类、两栖类或爬虫类动物序列。在各个实施方案中，脊椎动物序列可为天然序列，野生型的或是变异的；在一些实施方案中，脊椎动物序列可为野生型序列。本文中关于PLP/DM20序列所使用的“脊椎动物共有序列”指DNA序列SEQ ID NO :5。“脊椎动物特异性序列”指属种智人(Homo sapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus)、黑 MM (Pan troglodytes) > $^ (Macaca mulatta) >(Macaca fascicularis) > 猪(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、负鼠(Monodelphis domestica)、兔(Oryctolagus cuniculus)、牛(Bos taurus)、狗(Canis familiaris) (GalIus gallus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、壁虎(Gekko japonicus)、非洲爪蟾 (Xenopus laevis)和腔棘鱼(Latimeria chalumnae)的PLP或DM20序列。在一些实施方案中，脊椎动物特异性序列可包含或编码具有以下基因库编号的氨基酸序列中的任一序列 P60201 (人)、Q5R6E6 (猩猩)、XP_001140782 (黑猩猩)、XP_001088537 (猕猴)、Q8HXW7 (食蟹猕猴)、NP_999139 (猪)、NP_035253 (小鼠)、NP_112252 (大鼠)、ΧΡ_001374483 (负鼠)、P47789 (兔)、CAA08909 (牛)、39025 (狗)、CAA43839 (鸡)、P47790 (斑胸草雀)、 AAW79015 (壁虎)、CAA79582 (蛙)或 BAA^2O7 (腔棘鱼)。本领域的技术人员通过在http万维网ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez网站上的核苷酸菜单中检索NCBI基因库，可容易获得编码这些的DNA序列。例如，有用的DNA 序列包括列在以下基因库登录号之下的那些序列AJ006976(人)、CR860432(猩猩)、 XM_001140782(黑猩猩)、ΧΜ_001088537 (猕猴)、AB083324 (食蟹猕猴)、NM_213974 (猪)、 NM_011123(小鼠)、NlLO3O99O (大鼠)、XM_001374446(负鼠)、NM_001082328 (兔)、 AJOO99I3 (牛)、X553I7 (狗)、X6166U 鸡)、NM_001076703(残基 113-946，斑胸草雀)、 AY880400 (壁虎)、Z19522 (蛙)和 ABO25938 (腔棘鱼)。
本发明的TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中表现选择性翻译。术语在受胁迫和 /或垂死细胞中“选择性地翻译”或“选择性翻译”意指在翻译活性的峰值处，例如在用诱导细胞应激和/或死亡的急性毒剂处理之后的约6到约18小时内，在用本发明的TR表达盒转化的任何细胞系的95%以上的细胞中观察到mRNA翻译活性，以及意指本发明表达盒的第一 ORF的翻译水平上升到在用所述急性毒剂处理之后由缺乏可操作地连接的TR元件的相同表达盒转录和翻译时同一 ORF表达水平的至少50%。例如，在用浓度为5 μ M的钙离子载体Α23187处理之后的约9小时内，本发明表达盒内的TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中表现选择性翻译，其中在用表达盒转化的ΗΕΚ293细胞系的95%以上的细胞中观察到 mRNA翻译，并且表达盒的第一 ORF的翻译水平是在处理之后由缺乏可操作地连接的TR元件的相同表达盒转录和翻译时同一 ORF的翻译水平的至少50%。在一些实例中，在用浓度为 5μΜ的钙离子载体Α23187处理之后的约6到约9小时内，本发明表达盒内的TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中表现选择性翻译，其中在用表达盒转化的ΗΕΚ293细胞系的约96%、 97 %、98 %、99 %、99. 5 %或99. 9 %的细胞中观察到mRNA翻译，并且表达盒的第一 ORF的翻译水平是在处理之后由缺乏可操作地连接的TR元件的相同表达盒转录和翻译时同一 ORF 的翻译水平的约 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%。在本发明的一些实施方案中，TR元件是pip IRES元件，其不指导PIRP-M或PIRP-L 的翻译。在其它实施方案中，TR元件不是来源于pip IRES。在一些实施方案中，哺乳动物细胞用核酸表达盒稳定转化，所述核酸表达盒包含组成型启动子和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。用这种表达盒转化允许鉴定出表现不同翻译谱的所需的哺乳动物细胞亚群。在一个优选的实施方案中，这种细胞亚群表现不同的帽依赖性翻译谱。可使用在哺乳动物细胞中可操作的任何组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子选自由劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复 (LTR)启动子、巨细胞病毒即刻早期基因(CMV)启动子、猿猴病毒40早期(SV40E)启动子、 细胞质β-肌动蛋白启动子、腺病毒主要晚期启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子组成的群组。在一些优选的实施方案中，组成型启动子选自由SV40E启动子、CMV启动子和细胞质 β-肌动蛋白启动子组成的群组。在更优选的实施方案中，组成型启动子是细胞质β-肌动蛋白启动子。在又一优选实施方案中，组成型启动子是CMV启动子。本发明的核酸表达盒在5'到3'方向上具有以下元件编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或( 组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。另外，表达盒还可包括以下元件TR元件5'端的至少一个转录效应子序列；含有本领域中常见的限制性酶位点的侧接TR元件的3'序列；和/或聚腺苷酸化序列。在一些所述实施方案中，本发明的表达盒包含调节基因表达的上游转录效应子序列。在一个实施方案中，转录效应子序列是哺乳动物启动子。此外，转录效应子还可包括额外启动子序列和/或转录调节子，诸如增强子和沉默子或其组合。这些转录效应子序列可包括已知与细胞组分结合的部分，该细胞组分调节任何可操作地连接的编码序列的转录。 例如，增强子或沉默子序列可包括与已知细胞组分(诸如转录调节蛋白)结合的序列。转录效应子序列可选自任何适合的核酸，诸如基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、mRNA或cDNA，或任何适合的生物体(例如，病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)。基于所利用的转录和/或翻译系统来选择适当的转录效应子序列在本领域的技能范围之内。任何个别调节序列都可按野生型排列(如按天然基因组的顺序存在)或按人工排列来排列在转录效应子元件内。例如，经过修饰的增强子或启动子序列可包括调节序列的重复单元使得来自载体的转录活性通过这些变化而修饰。在一个实施方案中，含TR的表达盒中所使用的启动子选自组成型、组织特异性和肿瘤特异性启动子。组成型启动子可选自例如劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、巨细胞病毒即刻早期基因(CMV)启动子、猿猴病毒40早期(SV40E)启动子、细胞质 β-肌动蛋白启动子、腺病毒主要晚期启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在一个优选实施方案中，组成型启动子是CMV启动子。在另一优选实施方案中，组成型启动子是SV40E启动子。组织特异性启动子可选自例如转铁蛋白(TF)、酪氨酸酶(TYR)、白蛋白(ALB)、肌肌酸激酶(CKM)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和突触蛋白I(SYNl)启动子。在一优选实施方案中，组织特异性启动子是突触蛋白I(SYm)启动子。在另一优选实施方案中，组织特异性启动子是ALB启动子。肿瘤特异性启动子包括但不限于用于血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(即， KDR、E-选择素或endoglin)、α -甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、erbB2 (v-erb_b2成红细胞白血病病毒同源癌基因幻、骨钙素(骨Y-羧基谷氨酸蛋白；BGLAP)、SLP1 (分泌性白细胞蛋白酶抑制剂或抗白细胞蛋白酶1)、低氧反应元件(HRE)、L-plastin(淋巴细胞胞浆蛋白1)和己糖激酶II(HK2)的启动子。在一个优选实施方案中，肿瘤特异性启动子是α -甲胎蛋白(AFP)启动子。在另一优选实施方案中，肿瘤特异性启动子是SLPl启动子。在一些实施方案中，分离特异性转录效应子元件并且然后可操作地连接到最小启动子以产生转录活性依赖于单一类型或有限类型细胞反应(例如，热休克反应或金属调节元件)的表达盒。在附加的实施方案中，表达盒可包含物种特异性转录调节序列。这种DNA调节序列可基于表达盒将会插入其中的细胞类型来选择，并且可从原核或真核细胞(包括但不限于细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物细胞)分离或从病毒分离。在此类例子中，将选择哺乳动物启动子以在哺乳动物细胞中表达所选的核酸。用于报告蛋白的开放阅读框序列置于表达盒中TR元件或组成型启动子的3'端。 用于报告蛋白的核酸序列可为全基因组序列(例如，包括内含子)、合成核酸或编码报告蛋白的基因的cDNA拷贝。在一个优选实施方案中，报告蛋白的cDNA序列由于通过去除mRNA 剪接位点使基因组复杂度降低而用于本发明的目的。如本文所述，报告基因编码赋予细胞可检测的生物化学或可视觉观察的(例如， 荧光)表型的产物。报告蛋白还可包括融合或杂合多肽，其中另一多肽在所述多肽或其片段的N末端或C末端融合。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其一部分)与编码另一多肽的核酸序列(或其一部分)一起在框内克隆来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括接合编码多肽的编码序列使得它们是框内的，并且融合多肽的翻译处在TR盒的控制之下或它的转录处在组成型启动子的控制之下。例如，将pip ORF与增强型绿色荧光蛋白(EGFP) ORF 一起在框内克隆产生融合蛋白，其被用于监测所述融合蛋白在培养细胞中的表达、亚细胞定位和生物效应((Candour S等Gli乂200 40 (3) 300-11 ；Boucher S 等 J Neurosci(2002)22(5) :1772-83)。一种常用类型的报告基因编码酶或其它生物化学标志物，其在哺乳动物细胞中表达时引起细胞或细胞环境中的可视变化。这种变化可被直接观察，可涉及添加被转化成可检测产物的适当底物，或者涉及代谢示踪剂的添加和结合。这些报告基因的例子有编码 β-半乳糖苷酶(β-gal)的细菌IacZ基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧火虫荧光素酶(鞘翅目甲虫)、海肾荧光素酶(海肾)、GaUSSia荧光素酶、单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSVl-TK) 和突变的单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSVl-sr39tk)基因。在β-gal的情况下，用卤素衍生化半乳糖孵育表达细胞产生可用组织化学方法或荧光法检测和定量的着色或荧光产物。 在CAT的情况下，用放射性标记的氯霉素或另一乙酰基供体分子诸如乙酰辅酶A孵育细胞裂解物，并用色谱分析法测定乙酰化的氯霉素产物。其它有用的报告基因编码天然发荧光的蛋白质，包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或单体红色荧光蛋白 (mRFPl)。如以上可见，示例性报告基因可选自荧光素酶、GFP、EYFP, mRFPl、β -Gal和CAT， 但也可使用本领域中已知的任何其它的报告基因。在一个优选的实施方案中，报告基因是荧火虫荧光素酶。在另一优选的实施方案中，报告基因是海肾荧光素酶。在又一优选的实施方案中，报告基因是Gaussia荧光素酶。可用于本发明中的另一报告蛋白是G蛋白偶联受体(GPCR)，它是一种将激素或配体结合转变为细胞内信号的整合膜蛋白。在所有动物、昆虫和植物中都发现有GPCR。GPCR 信号转导在调节多种生理功能(包括光转导、嗅觉、神经传递、血管张力、心输出量、消化、 疼痛和体液与电解质平衡)中起作用。尽管GPCR参与多种生理功能，但它们共享许多共同的结构特点。它们含有七个膜域，其通过交替的胞内环与胞外环和可变长度的胞内羧基末端尾来桥接。GPCR的羧基末端尾开始于跨膜7之后，并且在许多GPCR中，它在紧接标志第七个跨膜域的末端的保守NPXXY基序之后开始。羧基末端尾可较长(大约数几十到几百个氨基酸)、较短(大约几十个氨基酸)或几乎不存在(少于大约十个氨基酸)。它还可含有 (多个)棕榈酰化的半胱氨酸残基。任何G蛋白偶联受体(GPCR)都可用于本发明的方法中，诸如已知的GPCR、未知的或孤儿GPCR，和嵌合的或修饰的GPCR，但优选是对其存在已知配体或针对受体的抗体的 GPCR0可与本发明一起使用的已知GPCR的非限制性列表示出在表1。表1
类型配体数目组织生理机能
权利要求
1.一种用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法，其中所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的 mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；或( 组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；测定相比于参照标准所表达的所述报告蛋白水平的所述毒素处理细胞中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定所述哺乳动物细胞亚组是否表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果所述哺乳动物细胞的所述毒素处理细胞表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型， 那么从所述哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使所述细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地，用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞亚群，并重复所述测定、分离和生长步骤直到鉴定出所述所需的哺乳动物细胞亚群。
2.一种用于鉴定哺乳动物细胞翻译是否对一种物质有抗性或用于测定一种物质是否对哺乳动物细胞有毒性的方法，所述方法包括用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞以形成稳定转化的细胞 (1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；或( 组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；用至少一种毒素处理稳定转化的哺乳动物细胞的亚组以形成毒素处理细胞；测定相比于参照标准所表达的所述报告蛋白水平的所述毒素处理细胞中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定所述稳定转化的哺乳动物细胞亚组是否表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果所述哺乳动物细胞的所述毒素处理细胞表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型， 那么从所述稳定转化的哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使所述细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；任选地，用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞亚群，并重复所述测定、分离和生长步骤直到鉴定出所述所需的哺乳动物细胞亚群；使所述所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触；和所述所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触后，检测所述报告蛋白的存在或测定所述报告蛋白的水平，其中与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，所述物质的毒性和哺乳动物细胞翻译对所述物质的抗性和所述报告蛋白的存在或所述报告蛋白的水平增加相关，并且与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，所述物质毒性的缺乏和哺乳动物细胞翻译对所述物质抗性的缺乏和不存在所述报告蛋白或所述报告蛋白的水平降低相关。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述组成型启动子选自由CMV、PGK和 β-肌动蛋白组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述组成型启动子是CMV启动子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在mRNA翻译活性处于它的峰值时测定所述哺乳动物细胞亚群中所述报告蛋白的水平。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞后至少6小时时测定所述哺乳动物细胞亚群中所述报告蛋白的水平。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞后 6小时到约30小时的时间点测定所述哺乳动物细胞亚群中所述报告蛋白的水平。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是I类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平高达500%，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是II类细胞， 其特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的500%以上且不超过1，400%，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是III类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的1，400%以上且不超过75，000%，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中用至少两种毒素的组合来处理所述哺乳动物细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少两种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中用至少三种毒素的组合来处理所述哺乳动物细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少三种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中用至少五种毒素的组合来处理所述哺乳动物细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少五种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌细胞或癌干细胞。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人原代细胞或鼠原代细胞。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由HEK293、 HT1080、NTERA-2D、HeLa, Caco2、H印G2、HCT116、MDA231、U2 OS、DU145、LNCaP, LoVo, MiaPaCa2、AsPCl、MCF-7、PC3、Capan-2、C0L0201、C0L0205、H4、HuTu80 和 SK-N-MC 组成的组。
20.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞mES或人胚胎干细胞hES。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述报告基因选自由EGFP、GFP、 EYFP、荧火虫荧光素酶、Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、LacZ, CAT、TK和TKsr39组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述报告基因是荧火虫荧光素酶。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
25.根据权利要求对所述的方法，其中所述TR元件选自由SEQID N0:1(小鼠pip TR)、SEQ ID NO 2(小鼠 dm TR)、SEQ ID NO :3 (人 pip TR)和 SEQ ID NO :4 (人 dm TR)组成的组。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述毒素选自由cAMP、TPA、紫杉醇、 MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
27.根据权利要求116中任一项所述的方法，其中所述筛选包括微量酶标仪分析、荧光显微镜技术、免疫组织化学、ELISA、光度计、FACS或分光光度计。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群的分离包括通过亚克隆的单集落分离。
29.一种哺乳动物细胞亚群，其通过根据权利要求1或346中任一项所述的方法所获得。
30.一种I类哺乳动物细胞，其通过根据权利要求8或11- 中任一项所述的方法所获得。
31.一种II类哺乳动物细胞，其通过根据权利要求9或11- 中任一项所述的方法所获得。
32.—种III类哺乳动物细胞，其通过根据权利要求10-28中任一项所述的方法所获得。
33.一种适用于毒性试验的试剂盒，其包含通过根据权利要求9或11- 中任一项所述的方法所获得的II类哺乳动物细胞或其细胞裂解物；和所述试剂盒的使用说明书。
34.一种适用于毒性试验的试剂盒，其包含通过根据权利要求10-28中任一项所述的方法所获得的III类哺乳动物细胞或其细胞裂解物；和所述试剂盒的使用说明书。
35.一种用于重组表达目标多肽的方法，所述方法包括向根据权利要求32所述的III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，所述表达盒包含以下任一项(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；或 (2)组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；使表达所述第二核酸表达盒的所述哺乳动物细胞在允许表达所述目标多肽的条件下生长；和纯化所述目标多肽。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述组成型启动子选自由CMV、PGK和β-肌动蛋白组成的组。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述组成型启动子是CMV启动子。
38.根据权利要求35所述的方法，其中两个表达盒中的所述TR元件是相同的。
39.根据权利要求35所述的方法，其中两个表达盒中的所述TR元件是不同的。
40.根据权利要求35所述的方法，其中用哺乳动物病毒载体瞬时转化或感染所述第二表达盒。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述第二表达盒被稳定转化。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的方法，其中所述TR元件选自由SEQID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 组成的组。
43.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中使所述哺乳动物细胞生长的所述步骤包括将所述III类哺乳动物细胞暴露于至少一种毒素。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述毒素选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
45.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中使所述哺乳动物细胞生长的所述步骤包括将所述III类哺乳动物细胞暴露于至少两种毒素的组合。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述至少两种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
47.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中使所述哺乳动物细胞生长的所述步骤包括在至少五种毒素的组合的存在下培养所述III类哺乳动物细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少五种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23167、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
49.一种用于鉴定在非帽依赖性翻译的调节中所涉及的蛋白质的方法，所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞以形成毒素处理细胞，用包含以下项的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的 TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；从所述毒素处理细胞制备细胞裂解物；分离编码所述TR元件和可操作地连接到所述TR元件的所述核苷酸序列的mRNA ； 使所述mRNA和来自所述细胞裂解物的蛋白质接触以形成与所述mRNA结合的蛋白质；和鉴定与所述mRNA结合的所述蛋白质。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是通过根据权利要求8所述的方法鉴定的细胞。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是通过根据权利要求9所述的方法鉴定的细胞。
52.根据权利要求49所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是通过根据权利要求10所述的方法鉴定的细胞。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述鉴定蛋白质的方法包括 Southernffestern免疫印迹、Western免疫印迹、蛋白质提取、抗体超迁移试验或微质谱测序。
54.一种用来产生目标多肽的哺乳动物细胞，所述目标多肽通过包括以下步骤的方法获得向根据权利要求32所述的III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，所述表达盒包含以下任一项(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；或 (2)组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；和使表达所述第二核酸表达盒的所述哺乳动物细胞在允许表达所述目标多肽的条件下生长。
55.根据权利要求M所述的哺乳动物细胞，其中所述组成型启动子选自由CMV、PGK和 β-肌动蛋白组成的组。
56.根据权利要求55所述的哺乳动物细胞，其中所述组成型启动子是CMV启动子。
57.根据权利要求Μ-56中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述报告基因是荧火虫荧光素酶。
58.根据权利要求Μ-57中任一项所述的哺乳动物细胞，其中两个表达盒中的所述TR 元件是相同的。
59.根据权利要求Μ-57中任一项所述的哺乳动物细胞，其中两个表达盒中的所述TR 元件是不同的。
60.根据权利要求Μ-59中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述第二表达盒被瞬时转化。
61.根据权利要求Μ-59中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述第二表达盒被瞬时转化。
62.根据权利要求Μ-61中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
63.根据权利要求62所述的哺乳动物细胞，其中所述TR元件选自由SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 组成的组。
64.一种用于验证I类、II类或III类哺乳动物细胞保留它们的表型的方法，所述方法包括用至少一种毒素处理根据权利要求四-32中任一项所述的哺乳动物细胞的亚组； 测定相比于参照标准所表达的所述报告蛋白水平的所述哺乳动物细胞亚组中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平；验证所述哺乳动物细胞保留它们的表型，其中所述I类细胞的特征在于所述报告蛋白的表达大于未曾用所述毒素处理的所述哺乳动物细胞中所述报告蛋白表达高达500%，所述II类细胞的特征在于所述报告蛋白的表达大于未曾用所述毒素处理的所述哺乳动物细胞中所述报告蛋白表达的500%以上到1400%，并且所述III类细胞的特征在于所述报告蛋白的表达大于未曾用所述毒素处理的所述哺乳动物细胞中所述报告蛋白表达的1400% 以上到约75000% ο
65.一种用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法，其中所述方法包括使根据权利要求30-32中任一项所述的哺乳动物细胞与所述物质接触；和测定相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白表达的与所述物质接触后由所述哺乳动物细胞所产生的所述报告蛋白的表达，其中由所述物质处理细胞所产生的所述报告蛋白的表达相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白表达的减少表明所述物质抑制蛋白质翻译。
66.一种用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法，其中所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的 mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；或( 组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；测定相比于参照标准所表达的所述报告蛋白水平的所述毒素处理细胞中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定所述哺乳动物细胞亚组是否表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果所述哺乳动物细胞的所述毒素处理细胞表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型， 那么从所述哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使所述细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地，用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞的亚群，并重复所述测定、分离和生长步骤直到鉴定出所述所需的哺乳动物细胞亚群；使所述所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触；和测定相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白表达的与所述物质接触后由所述所需的哺乳动物细胞亚群所产生的所述报告蛋白的表达，其中由所述物质处理细胞所产生的所述报告蛋白的表达相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白表达的减少表明所述物质抑制蛋白质翻译。
67.根据权利要求65-66中任一项所述的方法，其中用包含以下项的核酸表达盒稳定转化的所述哺乳动物细胞被用来测定所述物质抑制非帽依赖性翻译的能力编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译。
68.根据权利要求65-66中任一项所述的方法，其中用包含以下项的核酸表达盒稳定转化的所述哺乳动物细胞被用来测定所述物质抑制帽依赖性翻译的能力组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。
69.根据权利要求65、66或68中任一项所述的方法，其中所述组成型启动子选自由 CMV、PGK和β -肌动蛋白组成的组。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述组成型启动子是CMV启动子。
71.一种用于恢复所需哺乳动物细胞亚群的表型的方法，其中所述方法包括培养所述哺乳动物细胞的至少一个亚组以形成培养细胞，其中用核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞，该表达盒包含选择标记的核苷酸序列和以下任一项(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；或( 组成型启动子和可操作地连接到所述启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；用所述选择标记对其提供抗性的物质处理所述培养细胞，使得不再含有所述核酸表达盒的所述培养细胞死亡；使所述处理细胞生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地重复所述培养、处理和生长步骤，直到恢复所述所需哺乳动物细胞亚群的所述表型。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述选择标记选自由新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、潮霉素B、灭瘟素和G418组成的组。
73.根据权利要求71-72中任一项所述的方法，其中所述组成型启动子选自由CMV、PGK 和β-肌动蛋白组成的组。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述组成型启动子是CMV启动子。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是I类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于参照标准中所述报告蛋白水平高达500%，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
76.根据权利要求71-74中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是II类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于参照标准中所述报告蛋白水平的500%以上且不超过1，400%，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
77.根据权利要求71-74中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是III类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于参照标准中所述报告蛋白水平的1，400%且不超过75000%，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
78.根据权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌细胞或癌干细胞。
79.根据权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人原代细胞或鼠原代细胞。
80.根据权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由ΗΕΚ293、 ΗΤ1080、NTERA-2D、HeLa, Caco2、H印G2、HCT116、MDA231、U2 OS、DU145、LNCaP, LoVo, MiaPaCa2、AsPCl、MCF-7、PC3、Capan-2、C0L0201、C0L0205、H4、HuTu80 和 SK-N-MC 组成的组。
81.根据权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞mES或人胚胎干细胞hES。
83.根据权利要求71-82中任一项所述的方法，其中所述报告基因选自由EGFP、GFP、 EYFP、荧火虫荧光素酶、Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、LacZ, CAT、TK和TKsr39组成的组。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述报告基因是荧火虫荧光素酶。
85.根据权利要求71-73和75-84中任一项所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述TR元件选自由SEQID N0:1(小鼠pip TR)、SEQ ID NO 2(小鼠 dm TR)、SEQ ID NO :3 (人 pip TR)和 SEQ ID NO :4 (人 dm TR)组成的组。
全文摘要
本发明大体上涉及具有独特核糖体翻译谱，即翻译活性的哺乳动物细胞亚群。本发明进一步涉及用于鉴定和分离这些细胞的方法、包含这些细胞的试剂盒，或利用这些哺乳动物细胞亚群的不同翻译活性的方法。
文档编号C12N15/63GK102395685SQ201080016414
公开日2012年3月28日 申请日期2010年2月18日 优先权日2009年2月18日
发明者L·卡洛克, M·齐普赫尔 申请人:韦恩州立大学