专利名称：治疗新生血管形成的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本申请涉及发生在例如黄斑变性及其治疗时的眼部新生血管形成领域。
背景技术：
脉络膜新生血管形成(CNV)是指在眼的脉络膜层中新生血管异常或过量形成，其是年龄相关的黄斑变性(AMD)的常见症状。AMD是世界范围内导致不可逆性失明的主要原因，其中CNV表现为脉络膜血管异常生长穿透Bruch膜进入视网膜间隙，导致炎症(一般情况下逐渐减轻)、血管生成、最终引起黄斑纤维化。目前对AMD和其他类型脉络膜新生血管形成的治疗通常是给予抗血管生成药物。 但是，此类治疗几乎无法缓解CNV引起的炎症和纤维化。这样一来，尽管此类药物能够逆转新生血管形成；但是其临床疗效却不尽如人意，因为其无法改变CNV导致的纤维化损伤。因此，对眼部新生血管形成(如，AMD)单独进行抗纤维化治疗或同时施加抗血管生成治疗将对减缓因CNV所致的视力丧失产生更好的临床疗效。鍵本申请公开了脉络膜新生血管形成(CNV)会伴随某些赖氨酰氧化酶型酶表达水平的升高，之后导致纤维化损伤。抑制一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性有助于减轻和/ 或逆转CNV引起的纤维化损伤。此外，将抗血管生成治疗与抗纤维化治疗联用被确定可用于治疗以CNV为特征的紊乱，如年龄相关的黄斑变性(AMD)。抗纤维化治疗包括抑制一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性。抗血管生成治疗包括抑制一种或多种血管生成因子的活性，如血管内皮生长因子(VEGF)。抑制一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性和/或抑制血管生成的组合物可以包括蛋白(如，抗体或短肽)、核酸(如，寡核苷酸三聚体、siRNA, shRNA、micr0RNA、核酶)或能够通过合成制备的小分子有机物(如，分子量低于IkD)，例如组合化学。因此，本发明公开的内容包括，但不仅限于以下实施例 1. 一种治疗生物体眼部新生血管形成的方法，所述方法包括抑制生物体一种或多种细胞中赖氨酰氧化酶型酶的活性。2.根据实施例1所述的方法，其中抑制包括将抗体与赖氨酰氧化酶型蛋白结合。3.根据实施例2所述的方法，其中赖氨酰氧化酶型蛋白为赖氨酰氧化酶(LOX)。4.根据实施例2所述的方法，其中赖氨酰氧化酶型蛋白为赖氨酰氧化酶相关蛋白 2(L0XL2)。5.根据实施例1所述的方法，其中方法进一步包括抑制生物体一种或多种细胞中血管生成因子的活性。
6.根据实施例5所述的方法，其中血管生成因子的活性通过将抗体与血管生成因子结合抑制。7.根据实施例5所述的方法，其中血管生成因子为血管内皮细胞生长因子 (VEGF)。8.根据实施例7所述的方法，其中VEGF为血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)。9.根据实施例1所述的方法，其中所述眼部新生血管形成所在疾病选自下组年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病(DR)和早产儿视网膜病。10.根据实施例2所述的方法，其中抗体被引入生物体的眼部。11.根据实施例6所述的方法，其中多种抗体被引入生物体的眼部。12.根据实施例2所述的方法，其中编码抗体的多核苷酸被引入生物体的眼部。13.根据实施例6所述的方法，其中编码抗体的一种或多种多核苷酸被引入生物体的眼部。14.根据实施例10所述的方法，其中抗体被引入一个或多个视网膜上皮细胞。15.根据实施例11所述的方法，其中多种抗体被引入一个或多个视网膜上皮细胞。16.根据实施例12所述方法，其中多核苷酸被引入一个或多个视网膜上皮细胞。17.根据实施例13所述方法，其中一种或多种多核苷酸被引入一个或多个视网膜上皮细胞。18.根据实施例12所述方法，其中多核苷酸被包裹在病毒载体中，病毒载体选自下组腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。19.根据实施例13所述方法，其中一种或多种多核苷酸被包裹在病毒载体中，病毒载体选自下组腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。20.根据实施例18所述方法，其中病毒载体为腺相关病毒(AAV)。21.根据实施例19所述方法，其中所述病毒载体为腺相关病毒(AAV)。22.根据实施例20所述方法，其中所述病毒载体为AAV 2型或AAV 4型。23.根据实施例21所述方法，其中所述病毒载体为AAV 2型或AAV 4型。24.根据实施例1所述方法，其中所述生物体为哺乳动物。25.根据实施例M所述方法，其中所述哺乳动物为人。
图1为激光照射组(左列和中列)和未经照射的对照组(右列)小鼠脉络膜和视网膜的苏木精-曙红(H&E)染色切片。上面三幅照片为激光凝固术后第4天两只损伤眼和一只对照眼的切片；下面的照片为激光凝固术后第7天两只损伤眼和一只对照眼的切片。 圈选的部位为损伤部位。图2为激光照射组(左列和中列)和未经照射的对照组(右列)小鼠脉络膜和视网膜青色素3免疫荧光切片，用于指示CD45的免疫活性。上面三幅照片为激光凝固术后第 4天两只损伤眼和一只对照眼的切片；下面照片为激光凝固术后第7天两只损伤眼和一只对照眼的切片。圈选的部位为损伤部位。图3为激光凝固术后第14天和第28天对照组和激光损伤组小鼠切片中⑶45反应区域水平的定量分析结果。用CD45阳性区域占总损伤区域的百分率表示炎症程度。图4为激光照射组(左列和中列)和未经照射的对照组(右列)小鼠脉络膜和视网膜三色染色切片。上面三幅照片为激光凝固术后第4天两只损伤眼和一只对照眼的切片；下面照片为激光凝固术后第7天两只损伤眼和一只对照眼的切片。圈选的部位为损伤部位。图5为激光照射组(左列和中列)和未经照射的对照组(右列)小鼠脉络膜和视网膜天狼星红染色切片。上面三幅照片为激光凝固术后第4天两只损伤眼和一只对照眼的切片；下面照片为激光凝固术后第7天两只损伤眼和一只对照眼的切片。圈选的部位为损伤部位。图6为激光凝固术后第4天和第7天对照组和激光损伤组动物切片的胶原沉积定量分析结果。通过确定胶原纤维(使用三色染为蓝色，使用天狼星红染红色)的面积占总损伤面积的百分率对胶原沉积情况进行定量。在偏振光下对天狼星红染色结果进行分析。 三色和天狼星红的P值分别为0. 00003和0. 00005。图7为激光凝固术后第14天和第观天对照组和激光损伤组小鼠切片的胶原沉积定量分析结果。胶原沉积的定量分析方法参见图6说明。图8为激光凝固术后第4、7、14和28天激光损伤眼中编码赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样(LOXL)蛋白mRNA的水平。各组第4、7、14和28天的结果均用5个柱状图表示，从左到右依次为经归一化处理的LOX、LOXL 1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的mRNA水平。各时间点柱状图从左到右依次为经归一化处理的mL0X、mL0XLl、mL0XL2、mL0XL3和mL0XL4的 mRNA水平。图9为激光凝固术后第2、4、观和35天激光损伤眼中编码赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样(LOXL)蛋白mRNA的水平。获得结果实验不同于产生图8所示结果的实验。 各组第2、4、观和35天的结果均用5个柱状图表示，从左到右依次为经归一化处理的L0X、 LOXLU L0XL2、L0XL3和L0XL4的mRNA水平。各时间点柱状图从左到右依次为经归一化处理的 mLOX、mLOXLl、mL0XL2、mL0XL3 和 mL0XL4 的 mRNA 水平。图10为激光凝固术后第35天激光损伤小鼠眼切片中CD45反应区域水平的定量分析结果。采用抗L0XL2抗体(最左边)；抗LOX抗体(中间)或载体(最右边)处理小鼠组织。用CD45阳性区域占总损伤区域的百分率表示炎症程度。图11为激光凝固术后第35天激光损伤小鼠眼切片中CD31反应区域水平的定量分析结果。采用抗L0XL2抗体(最左边)；抗LOX抗体(中间)或载体(最右边)处理小鼠组织。用CD45阳性区域占总损伤区域的百分率表示新生血管形成程度。图12为激光凝固术后第35天激光损伤小鼠眼切片中胶原沉积情况的，采用天狼星红染色定量分析结果。通过确定胶原纤维(染红色)的面积占总损伤面积的百分率对胶原沉积情况进行定量。在偏振光下对天狼星红染色结果进行分析。详细说明除另有说明外，本发明中使用的方法均为细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域及相关领域所公知的标准方法和常规技术手段。这些技术手段可见于文献中，进而使本领域普通技术人员可以获得。参见，例如， Alberts，B. et al.，“Molecular Biology of the Cell，” 第 5 片反，Garland Science，NewYorkiNY,2008 ；Voet,D.et al. "Fundamentals of Biochemistry :Life at the Molecular Level，，，第 3 片反，John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008 ；Sambrook, J. et al.，“Molecular Cloning :A Laboratory Manual，”第 3 版，冷泉港实验室出版社，2001 年；Ausubel，F. et al. ,"Current Protocols in Molecular Biology，，，John Wiley&Sons,New York，1987，定期更新；Freshney，R. I.，“Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，” 第 4 版，John Wiley & Sons，Somerset, NJ, 2000 ；以及 “Methods in Enzymology，” 丛书， Academic Press，San Diego, CA.赖氨酰氧化酶型酶在脉络膜新生血管形成中的作用赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶(LOXL)样蛋白与胶原蛋白和胞外区域弹性蛋白的交联有关。因为该活性，这些蛋白在纤维化过程中起重要作用。本申请显示，在年龄相关的黄斑变性(AMD)模型中，激光诱导CNV后，某些赖氨酰氧化酶型酶的表达水平升高， 且在赖氨酰氧化酶的表达量增加的同时，也观察到了纤维化损伤(参见下文的实施例4和 5)。此外，本申请显示，在相同检测系统中，给予实验动物赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样蛋白2(L0XU)活性抑制剂(如，抗LOX和抗L0XL2抗体)后，其能够阻止激光诱导 CNV后的新生血管形成和纤维化。由此可知，抑制赖氨酰氧化酶型酶(如，L0X，L0XL2)的活性能够用于逆转、减轻和/或阻止CNV所致的眼部纤维化损伤。因此，在一方面，能够调节本申请所述一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的组合物可用于治疗以新生血管形成为特征的状况。一个非限制性的以新生血管形成为特征的疾病实例为年龄相关的黄斑变性(AMD)。其它疾病包括糖尿病视网膜病和早产儿视网膜病。在某些实施例中，赖氨酰氧化酶型酶抑制剂可以是能够抑制编码赖氨酰氧化酶型蛋白基因表达的抗体、小RNA分子、核酶、核酸三聚体或转录因子。参见，例如US 2006/0127402、US2007/0225242和被共同持有的US 2009/0053224 ；为了公开多种类型的赖氨酰氧化酶抑制剂将其参考并入。还可参见，U. S.专利号6，534，沈1，为了公开制备抑制编码赖氨酰氧化酶型酶基因表达的转录因子的方法将其参考并入。在某些实施例中，赖氨酰氧化酶型酶抑制剂是某种能够与赖氨酰氧化酶型酶结合并抑制其活性的抗体。在另外一些实施例中，抑制是非竞争性的。能够与一种或多种赖氨酰氧化酶型酶结合并抑制其活性的示例性抗体参见被共同持有的US 2009/0053224中公开的内容；为了公开了能够与赖氨酰氧化酶型酶结合的抗体的制备方法、组合物和用途将其内容参考并入。在某些实施例中，将核酸编码抗体或功能性抗体片段编码的核苷酸作为赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂。这些核酸能够通过本领域公知的方法给药。例如，将无修饰核酸可选择地加入缓冲液或药学上可以接受载体溶液中后，再加入眼中，或制成用于滴眼或全系统给药的溶液。可选地，核酸可以用病毒载体进行包裹(例如，腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体)。赖氨酰型酶本申请所述的术语“赖氨酰氧化酶型酶”指催化赖氨酸的ε -氨基和羟赖氨酸残基发生氧化脱氨基化反应，从而使肽基赖氨酸转化成肽酰-α -氨基脂肪基-δ -半醛(醛赖氨酸)，并且释放化学计量的氨和过氧化氢的蛋白家族成员
此反应常在细胞外胶原蛋白和弹性蛋白的赖氨酸残基上发生。醛赖氨酸的醛基具有反应性，其能够自发性的与其它醛赖氨酸和赖氨酸残基发生缩合反应，导致胶原蛋白分子发生交联，进而产生胶原纤维化。已从鸡、大鼠、小鼠、牛和人中纯化得到赖氨酰氧化酶型酶。所有赖氨酰氧化酶型酶均含有一个常见的催化结构域，其长度约为205个氨基酸，位于该蛋白的羧基末端，含有酶活性位点。酶活性位点中包括铜结合位点，其中包括能够与Cu(II)原子配位的4个组氨酸残基的保守氨基酸序列。活性位点还包括酪氨酰醌(LTQ)辅因子，其由赖氨酸和酪氨酸残基通过分子内共价连接形成(对应大鼠赖氨酰氧化酶中lys314和tyr349，对应人赖氨酰氧化酶中lys320和tyr355)。在赖氨酰氧化酶型酶中形成LTQ辅因子的酪氨酸残基周围的序列也是保守的。催化结构域中也含有十个保守的半胱氨酸残基，其参与形成五个二硫键。 催化结构域中还包括纤连蛋白结合结构域。最后，在催化结构域中还存在与生长因子和细胞因子受体结构域类似的氨基酸序列，该氨基酸序列包含四个半胱氨酸残基。在该酶家族中首个被分离和鉴定出的成员为赖氨酰氧化酶(EC 1. 4. 3. 13)；又名蛋白-赖氨酸6-氧化酶、蛋白-L-赖氨酸氧6-氧化还原酶(脱氨基)或L0X。参见，例如，Harris et al. ,Biochim. Biophys. Acta 341:332—344(1974) ；Rayton et al. ,J. Biol. Chem. 254 :621-626(1979) ；Stassen，Biophys. Acta 438:49—60(1976)。随后又相继发现了其它的赖氨酰氧化酶型酶。这些蛋白被称为“L0X样”或 “L0XL”。其全部含有上文所述的常见催化结构域，且具有类似的酶活性。目前已知，在人和小鼠中均存在五中不同的赖氨酰氧化酶型酶L0X和四种LOX相关，或LOX样蛋白LOXl (又称为“赖氨酰氧化酶样”、“ LOXL，，或 “ LOL，，)、L0XL2 (又称为“ LOR-1 ”)、L0XL3 和 L0XL4。 编码各赖氨酰氧化酶型酶的五个基因分别位于不同的染色体上。参见，例如，Molnar et al. ， Biochim Biophys Acta. 1647 :220-24(2003) ；Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32(2001) ；W001/83702，
公开日2001年11月8日和U. S.专利，专利号6，300，092，所有内容均参考并入。有一种名为LOXC的LOX样蛋白，其与L0XL4存在某些相似之处，但表达类型不同，此蛋白分离自鼠源性 EC 细胞系。Ito et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 =24023-24029 两种赖氨酰氧化酶型酶DmLOXL-I和DmL0XL_2分离自果蝇。尽管所有的赖氨酰氧化酶型酶均具有相同的催化结构域，但是这些酶之间仍存在差异，其差异主要表现在氨基末端区域。与LOX相比，四个LOXL蛋白存在氨基末端延伸。这样，人前原LOX (即，信号序列裂解前的主要翻译产物，见如下)中含有417个氨基酸残基； L0XL1中含有574个氨基酸残基、L0XL2中含有638个氨基酸残基、L0XL3中含有753个氨基酸残基和L0XL4中含有756个氨基酸残基。在其氨基末端，L0XL2、L0XL3和L0XL4中含有四个重复的清道夫受体-富含半胱氨酸(SRCR)结构域。在LOX或LOXLl中不存在这些结构域。SRCR结构域存在于分泌性、跨膜或细胞外基质蛋白中，已知其能够在许多分泌性和受体蛋白中介导配体结合。Hoheneste et al. (1999) Nat.Struct. Biol. 6 :228-232 ；Sasaki et al (1998)EMBO J. 17 :1606_1613。 除SRCR结构域以外，L0XL3在其氨基末端区域含有核定位信号。仅在LOXLl中存在一个富含脯氨酸的结构域。Molnar et al. (2003) Biochim. Biophys. Acta 1647:220-224。各种赖氨酰氧化酶的糖基化类型也不同。赖氨酰氧化酶型酶在组织中的分布情况也不同。人LOXmRNA在心脏、胎盘、睾丸、 肺、肾和子宫中的表达量较高，但是在脑和肝脏中的表达量较低。人LOXLl mRNA在胎盘、 肾脏、肌肉、心脏、肺和胰脏中均有表达，与LOX类似，其在脑和肝脏中的表达量要低很多。 Kim et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 :7176_7182。L0XL2 mRNA 在子宫、胎盘和其它器官中的表达量较高，但与LOX和LOXL类似，其在脑和肝脏中的表达量较低。Jourdan Le-Saux et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 :12939 12944。L0XL3 mRNA 在睾丸、脾脏和前列腺中的表达量较高，其在胎盘中呈中度表达，在肝脏中不表达，而L0XL4在肝脏中表达量较高。Huang et al. (2001)Matrix Biol. 20 :153-157 ；Maki and Kivirikko(2001)Biochem. J. 355 381-387 Jourdan Le-Saux et al. (2001)Genomics 74 :211-218 ；Asuncion et al. (2001) Matrix Biol. 20 :487-491。不同赖氨酰氧化酶型酶在疾病中的表达情况和/或与疾病之间的关系也是多种多样。参见，例如，Kagen(1994)Pathol. Res. Pract. 190 :910-919 ；Murawaki et al. (1991)Hepatologyl4 :1167-1173 ；Siegel et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2945-2949 Jourdan Le-Saux et al. (1994)Biochem. Biophys. Res. Comm. 199 :587-592 ； and Kim et al. (1999) J. Cell Biochem. 72 :181_188。赖氨酰氧化酶型酶还与多种癌症有关，包括头部和颈部癌症、膀胱癌、结肠癌、食道癌和乳腺癌。参见，例如，mi et al. (2007) Cancer Res. 67 :4123-4129 ；Gorough et al. (2007)J. Pathol. 212 :74-82 ；Csiszar(2001) Prog. Nuc1. Acid Res. 70 :1—32 禾口 Kirschmann et al. (2002)Cancer Res. 62 :4478_4483。尽管赖氨酰氧化酶型酶在结构和功能上存在某些重叠，但是其各自还具有独特的结构和功能。例如，定向删除LOX是小鼠在出生即已死亡的原因，而L0XL1缺陷不会严重影响发育表型。Hornstra et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 :14387-14393 ；Bronson et al. (2005)Neurosci. Lett. 390 :118_122。尽管绝大部分文献中均认为赖氨酰氧化酶型酶的作用为在细胞外的胶原蛋白和弹性蛋白中催化特定的赖氨酸残基发生氧化反应，但是也有证据显示赖氨酰氧化酶型酶还参与了多个胞内过程。例如，有文献报道某些赖氨酰氧化酶型酶能够调节基因表达。Li et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :12817-12822 ；Giampuzzi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 :36341_36349。此外，有报道表明LOX能够氧化组蛋白Hl中的赖氨酸残基。LOX 的其它胞外活性包括诱导单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的趋化作用。Lazarus et al. (1995)Matrix Biol. 14:727-731 ；Nelson et al. (1988) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 188 346-352。多种生长因子和激素，如TGF-β、TNF-α和干扰素，均能够诱导LOX自身的表达。 Csiszar(2001)Prog. Nucl. Acid Res. 70 :1_32。最新的研究结果显示，LOX与其它多种生物学功能有关，如发育调节、肿瘤抑制、细胞运动和细胞衰老。多种来源的赖氨酰氧化酶蛋白实例包括具有与下述序列之一多肽表达或翻译后形式基本相同的氨基酸序列的酶EMBL/GenBank :M94054 ；AAA59525. 1—mRNA ；S45875 ； AAB23549. Ι-mRNA ；S78694 ；AAB21243. Ι-mRNA ；AF039291 ；AAD02130. Ι-mRNA ；BC074820 ； AAH74820. 1-mRNA ；BC074872 ；AAH74872. 1-mRNA ；M84150 ；AAA59541. 1_ 基因组 DNA。LOX 的一个实施例为人赖氨酰氧化酶(hLOX)前原蛋白。本申请公开的编码赖氨酰氧化酶型酶序列的实例如下L0XL1的编码mRNA为 GenBank/EMBL BC015090 ；AAH15090. 1 ；L0XL2 的编码 mRNA 为 GenBank/EMBL U89942 ；L0XL3 的编码 mRNA 为 GenBank/EMBL AF282619 ；AAK51671. 1 ；以及 L0XL4 的编码 mRNA 为 GenBank/ EMBL AF338441 ；AAK71934. 1。LOX蛋白的初级翻译产物为前原多肽，其中含有延伸自氨基酸1-21的信号序列。 在小鼠和人LOX中，该信号序列通过Cys21和Ala22之间的裂解在胞内释放，生成46_48kDa 的LOX前肽，在本申请中也称为全长形式。该前肽在通过高尔基体时发生N-糖基化反应， 生成50kDa的蛋白，随后其分泌至胞外环境中。在这个阶段，蛋白被催化灭活。随后这个蛋白进一步裂解，小鼠LOX在Glyl68和Aspl69之间裂解，人LOX在Glyl74和Aspl75之间裂解，进而产生成熟的、具有催化活性的30-32kDa的酶，同时释放一个ISkDa的前肽。最终的裂解事件由金属内切蛋白酶前胶原C-蛋白水解酶催化完成，该酶也称为骨形态发生蛋白-l(BMP-l)。有趣的是，这种酶还具有加工LOX的底物胶原的功能。随后，N-糖基单元被除去。预计潜在信号多肽裂解位点在L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的氨基末端。L0XL1、 L0XL2、L0XL3和L0XL4的潜在信号裂解位点预计分别在Gly25和Gln26、Ala25和Gln26、 Gly25 和 Serf6 和 Arg23 和 ProM 之间。已鉴定出LOXL(LOXLl)蛋白的BMP-1裂解位点在和Asp355之间。Borel et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :48944-48949。依据前胶原和前-LOX(pro-LOX)中共有的 BMP-I裂解序列，其它赖氨酰氧化酶型酶的潜在BMP-I裂解位点预测为Ala/Gly-Asp序列， 经常位于酸性或荷电的残基之后。预计L0XL3的BMP-I裂解位点在Gly447和Asp448之间，在该位点进行加工后可以得到与成熟LOX大小相当的成熟多肽。L0XL4的BMP-I潜在裂解位点也已被鉴定出，其在 Ala569 和 Asp570 之间。Kim et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 52071-52074。L0XL2也能够按照与LOXL家族其它成员类似的方法被蛋白水解酶裂解和分泌。Akiri et al. (2003)Cancer Res. 63 1657—1666。为了本申请公开目的，术语“赖氨酰氧化酶型酶”包括上文所述全部五种赖氨酰氧化酶，还包括实际上具有酶活性的L0X、L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的功能性片段和/或衍生物，例如，催化赖氨酸残基脱氨基的能力。典型地，功能性片段或衍生物至少保持其赖氨酸氧化活性的50%。在某些实施例中，功能性片段或衍生物至少保持其赖氨酸氧化活性的 60%、70%、80%、90%、95%、99% 或 100%。本发明所述的赖氨酰氧化酶型酶功能性片段还包括催化活性未出现实质性改变的保守氨基酸取代物(相对于天然多肽序列而言)。术语“保守氨基酸取代物”指基于某种一般结构和/或性质的氨基酸组(grouping)。按照一般结构，可以将氨基酸分为带有非极性侧链的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)、带有不带电荷极性侧链的(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸) 以及带有带电荷极性侧链的(赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸)。含有芳香侧链氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。杂环侧链存在于脯氨酸、色氨酸和组氨酸中。在带有非极性侧链的氨基酸中，还可分为带有短烃侧链的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)和不带有烃基侧链的(甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。在带有带电荷极性侧链的氨基酸中，还可以分为带有酸性侧链的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和带有碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。确定各氨基酸一般性质的功能性方法为，分析同源生物相应蛋白间的氨基酸变化的归一化的步页率(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1979)。根据这种分析，氨基酸组可以定义为在同源蛋白中被优选地由一个取代为另一个的一组氨基酸，且其对整个蛋白的结构具有类似影响(Schulz紹chirmer， supra)。根据此类分析，可以列出以下几个可以彼此间保守互换的氨基酸组⑴包含带电荷基团的氨基酸，由Glu、Asp、Lys、Arg和His组成，(ii)包含带正电基团的氨基酸，由Lys、Arg和His组成，(iii)包含带负电基团的氨基酸，由Glu和Asp组成，(iv)包含芳香基团的氨基酸，由Wie、Tyr和Trp组成，(ν)包含氮环基团的氨基酸，由His和Trp组成，(vi)包含较大脂肪族非极性基团的氨基酸，由Val、Leu和Ile组成，(vii)包含略带极性基团的氨基酸，由Met和Cys组成，(viii)包含较小残基的氨基酸，由 Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln*Pro，(ix)包含脂肪族基团的氨基酸，由Val、Leu、lie. Met和Cys组成，以及(χ)包含羟基的氨基酸，由Ser和Thr组成。因此，如上述示例所示，氨基酸的保守取代对于本领域普通技术人员是公知的，通常可作出这种取代而不改变所得分子的生物活性。本领域技术人员还知道，一般情况下在多肽的非必需区域进行单氨基酸取代基本不会改变生物活性。参见，例如，WatSOn，et al.， "Molecular Biology of the Gene, ”第4版，1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co. ,Menlo Park, CA，第 2 页。有关赖氨酰氧化酶型酶的其它信息，参见，例如Rucker et al. , Am. J. Clin. Nutr. 67 :996S-1002S(1998)和 Kagan et al.，J. Cell. Biochem 88 :660-672(2003) 还可参见被共同持有的US 2009/00532^(2009年2月洸日)和US 2009/0104201 (2009年4 月23日)；其公开的内容在此参考并入。赖氨酰氧化酶型酶调节剂赖氨酰氧化酶型酶调节剂包括活化剂(激动剂)和抑制剂(拮抗剂)，可以通过多种筛选方法对其进行选择。在一个实施例中，调节剂可以通过确定待测化合物是否与赖氨酰氧化酶型酶结合对其进行鉴别；其中，如果发生了结合，则将该化合物认定为候选调节剂。可选地，可以对该候选调节剂进行其它检测。可选地，将候选化合物与赖氨酰氧化酶型酶接触，再检测赖氨酰氧化酶型酶的生物活性，能够改变赖氨酰氧化酶型酶生物活性的化合物就是赖氨酰氧化酶型酶调节剂。一般情况下，能够降低赖氨酰氧化酶型酶生物活性的化合物是该酶的抑制剂。在某些实施例中，生物活性为脱氨基；在另外一些实施例中，其为生成过氧化物。用于鉴别赖氨酰氧化酶型酶的其它方法包括将候选化合物在含有一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的细胞培养物中培养，再对细胞的一种或多种生物活性或特性进行检测。 能够改变培养细胞生物活性或特性的化合物即为赖氨酰氧化酶型酶的潜在调节剂。能够被检测的生物学活性包括，例如，赖氨酰氧化酶活性(例如，脱氨基，生成过氧化物)、赖氨酰氧化酶型酶水平、编码一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的mRNA水平和/或赖氨酰氧化酶型酶的一种或多种特异性功能。在上述检测的另外实施例中，当未与候选化合物接触时，一种或多种生物活性或细胞特性与赖氨酰氧化酶型酶的水平或活性相关。例如，生物活性可以是细胞功能，如迁移、趋化、上皮间质转化或间质上皮转化，通过与一个或多个对照或参比样品进行比较确定变化情况。例如，阴性对照样品包括候选化合物加入后赖氨酰氧化酶型酶的水平或活性降低的培养物；或培养物中赖氨酰氧化酶型酶的量与待测培养物相同，但是未加入候选化合物。在某些实施例中，赖氨酰氧化酶型酶水平不同的分离的培养物分别与候选化合物接触。如果观察到培养物的生物活性变化，且该变化高于含有更高水平或活性赖氨酰氧化酶型酶的培养物时，则可鉴定该化合物属于赖氨酰氧化酶型酶调节剂。可以通过化合物诱导后的表型确定化合物是赖氨酰氧化酶型酶的活化剂还是抑制剂，或者还可以进行进一步检测，如检测化合物对赖氨酰氧化酶活性的影响。获得赖氨酰氧化酶型酶的方法(生物化学法或重组法)，以及上文所述的通过细胞培养和酶学检测鉴别赖氨酰氧化酶型酶调节剂的方法均为本领域的公知常识。能够通过多种不同的方法测定赖氨酰氧化酶型酶的酶活性。例如，可以通过以下方法测定酶活性对过氧化氢、铵离子和/或醛产物进行检测和/或定量，对赖氨酸氧化反应和/或胶原交联情况进行检测，或测定细胞侵袭能力、细胞粘附、细胞生长或转移生长情况。参见，例如，Trackman et al. (1981) Anal. Biochem. 113 :336-342 ；Kagan et al. (1982) Meth. Enzymo 1. 82A :637-649 ；Palamakumbura et al. (2002) Anal. Biochem. 300 :245-251 ； Albini et al. (1987)Cancer Res. 47 :3239-3245 ；Kamath et al. (2001)Cancer Res. 61 5933-5940 ；U. S.专利，专利号 4，997，854 和 U. S.专利申请，
发明者D·马歇尔, I·斯托曼斯, T·范·博根, V·史密斯 申请人:吉联亚生物科技有限公司