专利名称：预防和治疗视网膜和角膜血管新生的药物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域。
目前临床上尚没有治疗眼内血管新生的有效药物和方法。临床上采用的激光光凝疗法可造成视网膜严重的不可逆损伤。曾有人考虑采用地塞米松治疗，但效果并不明显，且毒副作用很大，限制了其应用。因此寻找能够防治眼内血管新生且毒副作用小的药物具有重大的社会和经济意义。
新生血管的形成，包括血管内皮细胞基膜的降解、内皮细胞迁移、内皮细胞增生、新生血管的成熟等几个步骤，这些步骤受多种生长因子的调节，如血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子1(HIF1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子α(TGF-α)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、表皮生长因子(EGF)等。但在这些因子中，唯有VEGF特异性地对血管内皮细胞有强有力的促分裂、迁移作用。眼内血管新生与VEGF表达在时间、空间上有着极高的相关性，已有越来越多的证据表明，VEGF在眼内血管新生中起着关键性作用。人类VEGF基因由8个外显子和7个内含子组成，长约14kb。由于RNA剪切方式不同，VEGF家族至少有4个成员，分别为VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206。其中VEGF165为最主要的异构体。内皮细胞上VEGF受体包括fms样酪氨酸蛋白激酶(FLT)和激酶插入功能域受体(KDR)，VEGF通过诱导自身受体磷酸化从而启动细胞内系统。
4’，5，7-三羟基异黄酮(Genistein，简写Gen)是主要从豆类等植物中提取的一种异黄酮类化合物，近来研究发现Gen可以抑制多种肿瘤的生长和转移，但其作用的生化位点和作用机制还不清楚，目前提出的几种可能机制包括抑制酪氨酸激酶活性，抑制拓扑异构酶II的活性，抗氧化作用等。Gen可在肠道通过被动机制被迅速吸收，在肝脏转化为金雀异黄素-7-氧-β葡糖苷酶(genistein-7-O-βglucuronide)结合物，经胆汁排入十二指肠，再由肠道重吸收，形成肠肝循环。Gen已有保健食品上市，尚未有作为药物使用的报道。Gen属于低毒物质，其对人体生理代谢有益的调节及丰富的大豆资源，为其开发利用展示了广阔的前景。
经整体动物试验和培养细胞试验证实，该药物可以明显抑制疾病模型C57BL/6小鼠的视网膜血管新生，也可抑制多种因素所致兔和大鼠的角膜血管新生。该药物还可以抑制物理缺氧和化学缺氧所致的兔视网膜色素上皮细胞VEGF和HIF1蛋白表达，表明该药物通过抑制血管新生的诱导因子表达而发挥预防和治疗视网膜和角膜血管新生。内容包括(一)Gen和大豆异黄酮提取物对小鼠视网膜血管新生的作用C57BL/6小鼠相对缺氧造成视网膜血管新生模型。观察正常对照组小鼠眼切片，仅见极少量有突破内界膜的血管内皮细胞，模型处理组突破内界膜的血管内皮细胞数明显多于正常组，Gen给药组和给大豆异黄酮提取物组突破内界膜的血管内皮细胞数较模型处理组明显减少，且呈剂量依赖性。模型处理组视网膜血管内皮细胞中VEGF和HIF1的表达明显较正常组强。Gen给药组和给大豆异黄酮提取物组与模型处理组比较，VEGF和HIF1的表达明显减弱。表明Gen和大豆异黄酮提取物可以抑制小鼠视网膜血管新生。(二)Gen和大豆异黄酮提取物对角膜血管新生的抑制作用观察缝线所致兔角膜血管新生进展，发现角膜缝线后第三天，角膜充血，并有新生血管伸入角膜缘内，每根缝线上端出现新生血管，长度0.6mm左右。观察至缝线后第20天，可见给药组新生血管的支数和总长度较对照组明显减少，血管新生的进程也减慢。表明Gen和大豆异黄酮提取物可抑制缝线所致兔角膜血管新生。
观察碱烧伤所致大鼠角膜血管新生进展，1周时周边有新生血管浸入，给药组新生血管支数较对照组明显减少，2周后血管闭塞呈线状，直至消失。对照组2周后出现血管闭塞，约5周后血管消失。表明Gen和大豆异黄酮提取物可明显抑制碱烧伤所致的角膜血管新生。(三)Gen对化学缺氧和物理缺氧所致兔RPE细胞VEGF表达的影响采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜，以荧光比值来表示VEGF的表达，半定量分析氯化钴和物理缺氧处理不同时间对体外培养的视网膜色素上皮(RPE)细胞VEGF蛋白表达的诱导作用，以及Gen对氯化钴和物理缺氧诱导的VEGF表达的影响。发现对照组有低水平VEGF蛋白的表达，随着氯化钴和物理缺氧处理时间的延长，荧光比值的变化表现为时间依赖性，在6h点达到高峰。Gen(50、100、200μmol/L组)与DMSO对照组相比，均可明显抑制氯化钴和物理缺氧诱导的VEGF的表达，且此种抑制作用呈浓度依赖性。以上结果显示Gen可抑制氯化钴和物理缺氧诱导的RPE细胞VEGF表达，表明该药物通过抑制血管新生的诱导因子VEGF表达而发挥预防和治疗视网膜和角膜血管新生。
四、具体实施方案(一)Gen和大豆异黄酮提取物对小鼠视网膜血管新生的作用1.材料和方法1.1 材料和主要仪器Gen，98％，购自Sigma公司，溶于1％羧甲基纤维素钠(CMCC)；大豆异黄酮提取物(Gen含量70％)，本室提取，溶于1％CMCC；VEGF蛋白单克隆抗体购自NEOMARK公司；HIF-1蛋白单克隆抗体购自NOVUS公司；山羊抗小鼠IgG-FITC、羊抗小鼠IgG-CY3购自Sigma公司；测氧仪购自上海嘉定学联仪表厂；LSM510型激光共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司。1.2 动物模型的制作选未生育过的成年C57BL/6母鼠(上海中科院动物中心提供)，2只一组分别与1只公鼠同笼饲养，随机分为给氧组，三个给氧给Gen组(Gen 50、100、200mg/kg)，三个给氧给大豆异黄酮提取物组(70mg/kg、140mg/Kg、280mg/Kg)和对照组。每组平均出生10只新生C57BL/6小鼠。将给氧组、给氧给Gen组和给氧给大豆异黄酮提取物组各10只小鼠于生后7d与同笼母鼠一起放入密闭的干燥瓶中。干燥瓶中接入100％湿润的氧气，维持氧箱内氧的体积分数为75±5％，每3-6小时调节一次，用测氧仪监测。每日一次打开氧箱加食，换水。对照组10只小鼠生活在正常氧环境中。1.3 视网膜切片计数视网膜血管的增生每组小鼠均于生后21d处死，眼球摘除并标记方向。摘除的眼球浸泡在4％中性甲醛溶液中24小时，常规脱水，石蜡包埋。矢状面平行视神经连续6μm切片，每只眼随机抽取5个切面(有视神经断面的切面不记入在内)，雪夫高碘酸—苏木素(PAS)染色，显微镜下计数突破内界膜的血管内皮细胞核数目。1.4 免疫荧光法检测视网膜中VEGF、HIF1的表达从给氧组、给氧给药组、给大豆异黄酮提取物组及对照组中随机抽取10张未经染色的视网膜切片，常规脱蜡后，枸橼酸缓冲液中100℃抗原修复15分钟，分别予VEGF，HIF1单抗4℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5分钟。而后予以FITC或CY3标记的二抗孵育1小时，PBS洗3次，每次5分钟。在激光共聚焦显微镜下观察，成像。1.5 统计学分析采用非配对t检验法分别比较给氧组与对照组，给氧组与给氧给药组突破视网膜内界膜的细胞核数目。P＜0.05，表示有显著性差异。2.结果2.1计数视网膜血管的新生观察正常对照组小鼠眼切片，仅见极少量有突破内界膜的血管内皮细胞，模型处理组突破内界膜的血管内皮细胞数明显多于正常组，Gen给药组和给大豆异黄酮提取物组突破内界膜的血管内皮细胞数较模型处理组明显减少，且呈剂量依赖性。2.2视网膜中VEGF、HIF1的表达缺氧处理组视网膜血管内皮细胞中VEGF、HIF1的表达明显较正常组强。Gen给药组和给大豆异黄酮提取物组与缺氧处理组比较，荧光强度弱，且呈剂量依赖性。(二)Gen和大豆异黄酮提取物对角膜血管新生的抑制作用1.材料与方法1.1 材料和主要仪器Gen，98％，溶于1％CMCC或0.05％DMSO，大豆异黄酮提取物(Gen含量70％)，本室提取，溶于1％CMCC或0.05％DMSO。1.2 大耳白兔，重2.0～2.2kg。两眼进行角膜缝线，在丁卡因表面麻醉下，以1-0号丝线在角膜上方缝3针。将兔随机分为7组，每组5只。对照组灌胃0.5％CMCC，给药组分别灌胃Gen 15、30、60mg/kg和灌胃大豆异黄酮提取物25、50、100mg/kg。1.3Wistar大鼠，重300～350g，全麻后对角膜中央区实施碱性烧伤，用直径为5mm的圆形滤纸，浸于1.0M氢氧化钠溶液10μl，置于大鼠角膜中央，10秒后取下，立即用无菌生理盐水冲洗1分钟。对照组滴眼0.05％DMSO，每日3次，每次0.1ml，给药组分别滴眼Gen 0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml，大豆异黄酮提取物0.03、0.06、0.12mg/ml，每日3次，每次0.1ml。2.结果2.1 Gen和大豆异黄酮提取物对缝线所致兔角膜血管新生的影响用手术放大镜观察兔角膜血管新生，测量新生血管的支数和总长度。发现角膜缝线后第三天，角膜充血，并有新生血管伸入角膜缘内，每根缝线上端出现3～7支新生血管，长度0.6mm左右。观察至缝线后第20天，可见给药组新生血管的支数和总长度较对照组明显减少，血管新生的进程也减慢。表明Gen和大豆异黄酮提取物可抑制缝线所致兔角膜血管新生。2.2 Gen和大豆异黄酮提取物对碱烧伤所致大鼠角膜血管新生的影响以裂隙灯观察角膜新生血管进展，1周时周边有新生血管浸入，给药组新生血管支数较对照组明显减少，2周后血管闭塞呈线状，直至消失。对照组2周后出现血管闭塞，约5周后血管消失。表明Gen可明显抑制碱烧伤所致的角膜血管新生。(三)Gen对化学缺氧和物理缺氧所致兔RPE细胞VEGF表达的影响1.材料和方法1.1材料和仪器；Dulbecco`s modified eagle medium(DMEM)培养基，胰蛋白酶购自GIBCO公司；胎生牛血清购自上海浦东高桥兽医站；Dimethyl sulfoxide(DMSO)购自AMRESCO公司；VEGF蛋白单克隆抗体购自NEOMARK公司；山羊抗小鼠IgG-FITC购自Sigma公司；多聚赖氨酸购自上海生物工程技术有限公司；Gen购自Sigma公司，以DMSO助溶(DMSO终浓度＜0.05％)；TY80B型脱色摇床购自南京大学生物技术开发公司；6孔培养板购自丹麦NUNC公司；LSM510型激光共聚焦显微镜为德国Zeiss公司产品。1.2兔RPE细胞的培养空气针处死灰兔2～3只后，即刻取下兔眼，浸泡于0.1M PBS(NaCl 8.00g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，K2HPO40.2g溶于1000ml蒸馏水，pH7.4)中，4℃冰箱1h。无菌条件下剪开眼球，弃去眼前节及玻璃体，完整吸除视网膜神经层。眼杯内用D-Hanks液(NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·H2O 0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g溶于1000ml蒸馏水，pH7.4)冲洗二遍，加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化30min，用滴管吹打使RPE细胞分离，收集细胞，离心洗涤后加入DMEM培养液(含100U/ml青霉素钠，100μg/ml链霉素，20％新生牛血清，pH7.4)，接种于50ml培养瓶中，每3d换液一次。细胞长至近融合状态时，用0.25％胰酶消化，传代。3～4代细胞用于实验。1.3 氯化钴模拟缺氧将25×25mm盖玻片洗净常规消毒处理后，浸泡于0.1％多聚赖氨酸中2～4h，取出晾干2～4h，放入6孔培养板中备用。将传至第三代的RPE细胞接种于6孔培养板中的盖玻片上，待细胞长满玻片的50％～60％时开始实验。倾去培养液，用D-Hanks液冲洗2～3遍后，加入含有终浓度为125μmol/L氯化钴的DMEM培养液，分别继续培养0，1，2，4，6h。倾去培养液，用于免疫荧光试验。1.4 物理缺氧将传至第三代的RPE细胞接种于6孔培养板中的盖玻片上，待细胞长满玻片的50％～60％时开始实验。倾去培养液，用D-Hanks液冲洗2～3遍后，置于95％N2、5％CO2的37℃培养箱中，分别继续培养0，1，2，4，6h。倾去培养液，用于免疫荧光试验。1.5 免疫组织化学试验和激光共聚焦显微镜下半定量观察分别将经缺氧和氯化钴处理及Gen预处理的RPE细胞置于脱色摇床上用4℃PBS冲洗2次，每次5min。100％甲醇室温固定10min。用4℃PBS冲洗细胞2次。加入小鼠抗VEGF蛋白的单克隆抗体(1∶200稀释)50μl，4℃孵育1h。用4℃PBS冲洗细胞4次。加入山羊抗小鼠IgG-FITC(1∶200稀释)50μl，4℃孵育1h。用4℃PBS冲洗细胞4次。每待测样品加入200μl PBS后，分别置于联结电脑的激光共聚焦显微镜下，×40物镜，7％滤光片，激发光波长为488nm，预扫描后选定最佳细胞扫描参数，并在实验中保持不变。每个视野激光扫描2次后，可纪录全细胞中的平均荧光强度，并存储所采集的实验数据。本实验以全细胞中的平均荧光强度作为判断VEGF表达的指标。2、结果2.1 RPE细胞培养及形态观察原代培养的兔RPE细胞多呈扁平多角形，胞浆内充满黑色或褐色色素颗粒。当细胞进入分裂期后，细胞内色素颗粒随多次分裂逐渐稀释减少，细胞逐渐透明，至第三、四代，细胞内无明显的色素颗粒，而成均一透明的单层梭形细胞。2.2 氯化钴模拟缺氧对RPE细胞VEGF蛋白表达的影响125μmol/L氯化钴处理后，选取0、1、2、4、6h细胞。在激光共聚焦荧光显微镜下可观察到与不加一抗组相比，缺氧0h组胞浆中有较弱的荧光，提示有低水平VEGF蛋白的表达。而后随着缺氧时间的延长，荧光比值的增加表现为时间依赖性，氯化钴处理4h后胞浆中荧光比值的增加趋缓，形成平台期，在缺氧6h达到高峰。(图1)2.3 Gen对氯化钴模拟缺氧4h RPE细胞VEGF蛋白表达的影响以125μmol/L氯化钴+DMSO处理RPE细胞4h为对照组，125μmol/L氯化钴+终浓度分别为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Gen处理RPE细胞4h后的荧光比值明显降低，且随浓度的增高依次递减。平均荧光强度比值分析提示Gen可显著抑制氯化钴模拟缺氧4h后RPE细胞VEGF蛋白的表达，且呈浓度依赖性。(图2)2.4 物理缺氧对RPE细胞VEGF蛋白表达的影响将接种RPE的六孔板置于95％N2、5％CO2的37℃培养箱中，分别继续培养0，1，2，4，6h。在激光共聚焦荧光显微镜下可观察到与不加一抗组相比，缺氧0h组胞浆中有较弱的荧光。随着缺氧时间的延长，荧光比值的增加表现为时间依赖性。(图3)2.5 Gen对物理缺氧4h RPE细胞VEGF蛋白表达的影响以缺氧+DMSO处理RPE细胞4h为对照组，终浓度分别为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Gen处理RPE细胞4h后的荧光比值明显降低，且随浓度的增高依次递减。(图4)五
图1.氯化钴模拟缺氧对RPE细胞VEGF蛋白表达的影响。A氯化钴模拟缺氧后0、1、2、4、6h RPE细胞激光共聚焦荧光显微镜图像。BRPE细胞VEGF蛋白表达以对照组的荧光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01vs 0h。图2. Gen对氯化钴模拟缺氧引起的RPE细胞VEGF蛋白表达的作用。AGen(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)处理RPE细胞后激光共聚焦荧光显微镜图像。BRPE细胞VEGF蛋白表达以对照组的荧光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01 vs 0μmol/L Gen。图3.物理缺氧对RPE细胞VEGF蛋白表达的影响。A物理缺氧后0、1、2、4、6h RPE细胞激光共聚焦荧光显微镜图像。BRPE细胞VEGF蛋白表达以对照组的荧光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01vs 0h。图4.Gen对物理缺氧引起的RPE细胞VEGF蛋白表达的作用。AGen(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)处理RPE细胞后激光共聚焦荧光显微镜图像。BRPE细胞VEGF蛋白表达以对照组的荧光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01 vs 0μmol/L Gen。
权利要求
1.一类4’，5，7-三羟基异黄酮(Genistein，简写Gen)的应用，其特征在于该药物为Gen纯品，或含有Gen的豆类及相关植物的提取物，或以Gen为主要成分的复方制剂，可用于制备预防和治疗视网膜和角膜血管新生的药物。
2.一类预防和治疗视网膜和角膜血管新生的药物，其特征在于Gen纯品，或含有Gen的豆类及相关植物的提取物，或以Gen为主要成分的复方制剂，可制备成片剂、胶囊、口服液、静脉及肌肉注射剂、脂质体、微胶囊和滴眼液等制剂形式。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域。本发明涉及预防和治疗视网膜和角膜血管新生的药物。该药物为4’，5，7－三羟基异黄酮(Genistein，简写Gen)纯品，或含有Gen的豆类及相关植物的粗提取物，或以Gen为主要成分的复方制剂。可制备成片剂、胶囊、口服液、静脉及肌肉注射剂、脂质体、微胶囊和滴眼液等制剂形式。经整体动物试验和培养细胞试验证实，该药物可以明显抑制疾病模型C57BL/6小鼠的视网膜血管新生，也可抑制多种因素所致兔和大鼠的角膜血管新生。该药物还可以抑制物理缺氧和化学缺氧所致的兔视网膜色素上皮细胞VEGF和HIF1蛋白表达，表明该药物通过抑制血管新生的诱导因子表达而发挥预防和治疗视网膜和角膜血管新生。
文档编号A61P27/02GK1424030SQ02148598
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月23日 优先权日2002年12月23日
发明者王斌, 邹颖, 肖继皋 申请人:南京医科大学