专利名称：一种全人源抗vegf单克隆抗体、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术：
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提
尚ο肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过l_2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。贝伐单抗(Avastin，bevacizumab)是抗人 VEGF 的人源化抗体(Cancer Resl997 ； 57 :4593-9)，它于2004年被美国食品药品管理局批准为转移性结直肠癌的一线治疗药物。 但Bevacizumab是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化，且存在着亲和力不高的问题。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗 VEGF 抗体 11A7。更具体地，本发明公开了全人源抗VEGF抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 8所示；本发明公开了上述全人源抗VEGF抗体，重链氨基酸序列为SEQ IDNO 10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 12所示；本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗VEGF抗体；本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗VEGF抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :5所示，编码全人源抗VEGF抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :7所示；
本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗VEGF抗体重链的核苷酸序列为SEQ ID NO 9所示，编码全人源抗VEGF抗体轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO 11所示；本发明还公开了一种表达载体，含有上述的核苷酸序列，为PCDNA3. 1/ZE0(+)或 pcDNA3. 1 (+)；本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为CHO-Kl细胞；本发明进一步公开了上述全人源抗VEGF抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗VEGF单链抗体；全人源抗VEGF完整抗体分子真核表达载体的构建；全人源抗VEGF完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源抗VEGF完整抗体分子的纯化。本发明最后公开了上述的全人源抗VEGF抗体在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途，其中肿瘤疾病为结直肠癌。本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明与人源化抗体 bevacizumab和人源抗VEGF抗体6A6 (按照中国专利申请号02111093. X，申请日2002年3 月20日，发明名称为《人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物》中公开的方法制备得到)相比，本发明得到的抗体具有更高的抗体亲和力，更强地抑制肿瘤细胞增殖的能力；体内抗肿瘤实验结果表明，本发明得到的抗体可以明显抑制肿瘤的增长。
图1，细胞增殖实验结果；图2，肿瘤生长曲线图。
具体实施例方式以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例抗体的制备(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂anvitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22 :197-207)和文献(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)报道的序列分别设计引物采用 RT-PCR 反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2分别显示了重链恒定区(Ch)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :4分别显示了轻链恒定区(CJ的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/CH 和 pGEM-T/Q。(2) cDNA 的制备收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用iTrizol试剂anvitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出 cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
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(3)引物设计参考文献(Immunotechnology，1998，3 :271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)基因的 VHBack，VaFor, VJack 和 \For 引物。VHBack，VaFor, VLBack 和 VLFor 的序列见 Immunotechnology，1998,3 :271_278。其中在 V11Back 引物的 5，端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在V11For引物的5’端加上序 ^lJ gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc,在 VlBack 弓|物的 5，端力口上序列 tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct,在 VLFor 弓|物的 5，端力口上含有 Not I 位点的序列 atgcggccgc。(4).噬菌体抗体库的构建及筛选采用(2) 4^々cDNAfP (3)中的弓|物，利用 recombinant Phage antibodysystem 试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phage antibody system试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“重组人VEGF165蛋白”(购自R&D公司)。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人VEGF单链抗体11A7&FV，测序后获得其基因序列。SEQ ID N0:5和 SEQID NO :6分别显示了 11A7&FV重链可变区核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID N0: 7和SEQ ID NO 8分别显示了 llA7kFv轻链可变区\的核苷酸序列和氨基酸序列。(5)全人源抗体在真核细胞中的表达以11A7&FV基因和pGEM_T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG CTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物， 回收目的条带并克隆到PGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段 11A7VhCh，与用 HindIII 和 EcoR I 酶切的质粒 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen 公司)进行连接， 构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (11A7VhCh)。以11A7&FV基因和pGEM-T/Q载体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟，得到PCR产物，其5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用 HindIII 和 EcoR I 酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段11A7\Q，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1/ZE0(+) anvitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (11A7VLCL)。 于3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90% -95%融合时进行转染取质粒101^(质粒？(^嫩3.1(+) (11Α7νΗ(:Η)4μβ，质粒 pcDNA3. 1/ΖΕ0(+)(11A7VLCL)6 μ g)禾口 20 μ lLipofectamine2000Reagent(Invitrogen 公司产品)按LipofectamindOOOReagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含 600 μ g/ml G418 (Invitrogen 公司产品)禾口 250 μ g/ml Zeocin (Invitrogen 公司产品)的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fe) (KPL公司)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myeloma IgGl, κ (Sigma)，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人 IgG(K) ((Southern Biotechnology Associates 公司)进行结合反应，37°C 温育 lh，加入 TMB显色液于37°C作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A45tl值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用I^rotein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体11A7。 将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO :9和SEQ IDN0:10分别显示了全人源抗体11A7的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ IDNO 11和SEQ ID NO 12 分别显示了全人源抗体11A7的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。实验例人源抗体6A6 按照中国专利申请号02111093.X申请日2002年2月30日发明名称《人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物》中公开的方法制备得到实验例1. VEGF抗体亲和力测定运用Biacore T100 (Biacore AB，Uppsala，Sweden)检测 VEGF 抗体的亲和力常数。将VEGF165(R&D公司产品)通过氨基共价结合与CM5生物传感芯片(GE Healthcare) 上，将全人源抗体11A7，Bevacizumab，人源抗体6A6(按照中国专利申请号02111093. X申请日2002年2月30日发明名称《人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物》中公开的方法制备得到)和阴性对照抗体(Rituximab市售产品)(以PBS/0. 05% TWEEN-20 (ICIAmericas)(去污剂)配)溶液，配成不同的浓度(2倍比浓度稀释)，以50 μ 1/ min的流速通过芯片。每次检查之后，用5μ 1 50mM盐酸水溶液以3μ 1/min的流速洗涤，从而将残留的抗体从固定化的配体上洗脱下来。用BIAevalution软件(TlOOevalution 2.0 版，GE Healthcare公司)，通过非线性回归法分析结合曲线。结果如表1所示，全人源抗体 11A7的KD值显著低于Bevacizumab和人源抗体6A6，说明全人源抗体11A7对VEGF的亲和力高于Bevacizumab和人源抗体6A6，亲和力实验结果见表1。表1亲和力实验结果
权利要求
1.一种全人源抗VEGF单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:8所示。
2.权利要求1所述的全人源抗VEGF单克隆抗体，其特征在于，重链氨基酸序列为SEQ ID NO 10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID N0:12所示。
3.编码权利要求1所述的全人源抗VEGF单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :5所示，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :7所示。
4.编码权利要求2所述的全人源抗VEGF单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链的核苷酸序列为SEQ ID NO 9所示，轻链的核苷酸序列为SEQ IDNO 11所示。
5.含有权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体，为pcDNA3.1/ZE0⑴或 pcDNA3. 1 (+)。
6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞，为CHO-Kl细胞。
7.权利要求1或2所述的全人源抗VEGF单克隆抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗VEGF单链抗体、全人源抗VEGF完整抗体分子真核表达载体的构建、全人源抗VEGF完整抗体分子在CHO细胞中的表达和全人源抗VEGF完整抗体分子的纯化四个步骤。
8.权利要求1或2所述的全人源抗VEGF单克隆抗体在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中肿瘤疾病为结直肠癌。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗VEGF单克隆抗体、其制备方法及用途。本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗VEGF抗体11A7，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO8所示。本发明还公开了11A7抗体的制备方法以及编码11A7抗体的核苷酸序列、含该核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的11A7抗体与人源化抗体bevacizumab相比具有更高的抗体亲和力，更强地抑制肿瘤细胞增殖的能力，可明显抑制肿瘤的增长，可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61P35/00GK102167740SQ20101012526
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月25日 优先权日2010年2月25日
发明者仝昕, 李川, 王淑蕙, 阚颖 申请人:百迈博药业有限公司