专利名称：一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法，应用该方法能有效提高单纯疱疹病毒特异性地感染肿瘤细胞的能力，规避免疫反应和体内中和抗体，降低毒副作用，提高安全性。
背景技术：
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)是包膜双链DNA病毒，通常根据抗原性的差别分为I型(HSV-I)和II型(HSV-2)。I型疱疹病主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官。II型疱疹病毒主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染，II型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV被激活而发病。人是单纯疤疹病毒唯一的自然宿主，主要通过直接接触传染。目前，HSV-I已成为重要的肿瘤基因治疗病毒载体和溶瘤病毒，其主要原因在于 ①HSV-I是基因组长为1521Λ的包膜双链DNA病毒，其容量大，可插入外源大片段，由于 HSV-I基因组编码的基因中有一半是非必需基因，可被外源治疗基因所替换；②HSV-I的宿主细胞范围广，可感染静息期和非静息期细胞，感染效率高，即使在感染复数(MOI)很低的情况下，HSV在体外仍然可以感染70%左右的细胞群体；③在感染的宿主细胞中，HSV-I 的全部复制循环过程可在20小时内结束，释放出数千计的子代病毒颗粒；④HSV-I病毒颗粒既能通过细胞膜融合进行直接的细胞-细胞传播，也能通过细胞外空间(extracellular space)进行传播，这对于溶瘤病毒尤其有用，因为低剂量的病毒就可以在实体瘤内实现高效的病毒侵入(Viral Penetration)；⑤临床上有多种抗HSV-I的药物(如无环鸟苷、 泛昔洛韦等)用于治疗HSV-I的感染，而HSV-I表达抗肿瘤自杀基因——胸苷激酶(HSV thymidine kinasa, HSV-TK)，这就为HSV-TK的抗肿瘤作用提供了一个安全机制，因为可用药物关闭HSV-I的复制循环；⑥HSV-I能有效感染多种实验动物，有利于建立动物模型，也便于把临床前研究结果平移到(translation)临床试验中。因此，目前全世界范围内有近百个有关HSV的方案进入各期临床研究阶段。然而，如同其他任何病毒类似，HSV-I的宿主细胞范围广，并非专一感染肿瘤细胞。如何使溶瘤HSV从体外特异地导入肿瘤细胞，即细胞转导的靶向性(Cell TransductionalTargeting)，是HSV-I介导的肿瘤基因治疗和溶瘤HSV病毒治疗亟待解决的一个问题。目前的解决方法主要是依赖于瘤内注射，但该方法的临床局限性比较大，尤其无法用于肿瘤已经扩散的患者。再者，溶瘤HSV还存在较强的免疫原性，这对于重复给药也是一个严重挑战。因而需要对HSV-I进行细胞转导靶向修饰，即重靶向(Re-targeting)。受体介导的靶向给药是靶向治疗的重要途径。自1986年发现叶酸(folic acid,folate, FA)是由受体介导的内吞途径进入细胞以来，叶酸受体(Folate Receptor, FR)介导的靶向给药系统就取得长足进展。与其它受体介导的基因传递方式相比，叶酸受体系统有其独特优点①FR仅在肿瘤细胞膜表面高表达，而在绝大多数正常组织中，几乎不表达， 故具有很好的肿瘤组织特异性；②FR的配体是叶酸，FA是人体必需的维生素，但人体不能合成FA，需摄取外源性FA。叶酸易通过-羧基与其他分子结合，且不会导致其亲和力降低； 此外叶酸还具有、低免疫原性、易于修饰、体积小、高度化学稳定性和生物学稳定性、与有机溶剂的生理相容性、低成本等优点；③FA与FR具有高亲和力，通过FR介导的内吞作用，能有效将结合FR的叶酸、叶酸偶联物等摄人细胞。目前，叶酸受体介导的靶向给药系统广泛应用于基因药物、蛋白药物、化疗药物、毒素药物、放射性药物、单克隆抗体等，并已取得良好的进展。通常利用叶酸受体介导的基因药物靶向传递需要将配体与阳离子多聚物化学交联，基因药物再与偶联物通过静电结合，形成配体-阳离子多聚物-基因药物复合物，通过受体-配体的作用，将基因药物导入靶细胞。为提高受体介导的基因转移效率，通常需以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)为接头，以便更有效提呈和介导叶酸与叶酸受体在肿瘤细胞表面的结合。通常，药物的聚乙二醇修饰，即PEG化(PEGylation)，是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体等上。自1977年聚乙二醇被首次用于修饰牛血清白蛋白以来，聚乙二醇化技术迅速发展，现已成为改善蛋白质药物和非蛋白质药物临床效果的重要手段。这是因为PEG安全、无毒，具有油水二亲性。PEG与药物相连， 能够增大药物的相对分子量，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，延长药物的半衰期，增大药物的水溶性，增强药物的稳定性，并且PEG链包裹在药物表面能够遮蔽药物的抗原决定簇，降低药物的免疫原性；同时改变了药物的分子结构从而改进了药物动力学和药效学的性质，提高了作用部位的血药浓度。目前已有多个聚乙二醇化的药物(如干扰素、腺苷脱氨酶、阿霉素等)获得FDA的批准进入市场，而处于临床前研究和临床试验阶段的PEG化的药物有数十种之多。近年来，已有研究开始尝试病毒(如腺病毒)的PEG化用于肿瘤的基因治疗。1998 年Wfelsh MJ就尝试PEG包裹腺病毒以逃避其中和抗体，Jame M. Wilson等把腺病毒PEG化显著增强了其转导效率和稳定性，Michael A. Barry等发现PEG化的腺病毒可有效降低腺病毒的自然免疫反应，Pastore L.等也现PEG化的腺病毒显著提高了其安全性。hinsaku Nakagawal等用靶向肿瘤新生血管的RGD短肽PEG化修饰腺病毒显著增强其细胞转导效率和抗体逃避能力，而h Kyung Oh等发现叶酸固定化(Folate Immobilized)的PEG化腺病毒可重靶向肿瘤细胞。此外Maria A. Croyle等也发现PEG化的慢病毒载体可防止其在血清中失活，You-Kyoung Kim等也发现PEG化的杆状病毒载体在体内体外均能调控转导效率， Hong T. Le等发现PEG化的腺相关病毒可作为基因输送的载体等等。提高病毒特异性地感染肿瘤细胞的能力，同时有效规避机体对HSV-I的免疫反应，降低毒副作用，增前安全性等是本领域研究人员的关注热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法及其应。本发明使HSV的天然细胞嗜性被外源靶向物质所取代，因而可特异性地被转导入肿瘤细胞或组织，而不感染正常细胞或组织，同时也因此使HSV在到达肿瘤细胞前有效规避机体的中和抗体的清除。具体而言，本发明的一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法，其特征在于，主要是使用外源靶向物质叶酸-聚乙二醇纳米粒(folate-PEGylated Nanoparticles, FPN)化学改性或修饰HSV-1，通过叶酸受体外源靶向物质实现特异性导入肿瘤细胞，同时避免HSV-I在到达肿瘤细胞前就被机体免疫系统清除。本发明中重靶向的单纯疱疹病毒主要选自I型，其次是II型。所述的重靶向的单纯疱疹病毒主要是重组单纯疱疹病毒，其次是非重组单纯疱疹病毒(野生型)。其中，重组单纯疱疹病毒包括复制缺陷型的重组单纯疱疹病毒和条件复制型的溶瘤单纯疱疹病毒。本发明中，单纯疱疹病毒的天然细胞嗜性被外源靶向物质所取代，因而使单纯疱疹病毒被特异性地转导入肿瘤细胞或组织，而不感染正常细胞或组织。所述的外源靶向物质主要是叶酸，其次是其它肿瘤细胞高表达受体的配体分子， 包括但不限于表皮生长因子、血管内皮生长因子、雌激素、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。本发明中，外源靶向物质与单纯疱疹病毒的结合，主要是通过温和的化学耦合方式，其次是通过生物方式和物理方式。本发明中，重靶向的单纯疱疹病毒的靶细胞主要是肿瘤细胞，其次是肿瘤新生血管内皮细胞。本发明单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法包括下述步骤1.HSV的培养与纯化采用I型(HSV-I)，或II型(HSV-2)单纯疱疹病毒，无论是HSV-1或HSV-2，都包括重组单纯疱疹病毒和非重组单纯疱疹病毒(野生型)。其中，单纯疱疹病毒主要是重组单纯疱疹病毒，包括复制缺陷型的重组单纯疱疹病毒和条件复制型的溶瘤单纯疱疹病毒(如 MGH1、G207、G47、NV1020、AE618、7134 等)。单纯疱疹病毒的培养优先地在非洲绿毛猴肾细胞(Vero细胞)及其衍生细胞(如 2-2,911等)中进行，其次在293细胞、CHO细胞、Hela细胞等中扩增。常规培养Vero细胞，单纯疱疹病毒按感染复数(MOI)为0. 01进行接种，继续培养 72小时，分别常规离心收集培养物上清和细胞，常规冷冻裂解法裂解细胞并离心收集病毒， 上述病毒合并保存于-80°C，以备纯化。上述保存的病毒原液用常规的蔗糖密度梯度离心法进行纯化，所得到得纯化病毒颗粒保存于-80°C，以用于后续的靶向修饰。反复上述生产和纯化过程至所需病毒量，通常最低病毒量为1 X IO10个病毒颗粒。2. FA-PEG 和 poly cat ion-PEG-FA 的合成及表征本发明中外源靶向物质主要是叶酸，其次是其它肿瘤细胞高表达受体的配体分子，包括但不限于表皮生长因子、血管内皮生长因子、雌激素、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)。外源靶向物质与HSV-I的结合，主要是通过温和的化学耦合方式，以保持病毒活力。通常，外源靶向物质需要PEG化后方能与HSV-I进行温和的化学偶联，本发明中主要是使用叶酸-聚乙二醇纳米粒(FPN)化学改性或修饰HSV-I。因此首先合成FA-PEG (其合成过程和化学式结构如图1所示)，然后用红外光谱、1H NMR(Nuclear Magnetic Resonance, 核磁共振)等技术测定上述合成的耦合物的结构和纯度，必要时可用基质时间飞行质谱 (matrix-assisted time-of flight mass spectrometer, MALDI-T0F)技术进行进一步表征分析。纯度超过95 %的FA-PEG偶联物可用于后续的HSV的靶向修饰。外源靶向物质与HSV-I的结合，还可以通过生物方式和物理方式。首先合成 polycation-PEG-FA，本发明中选择天然氨基多糖-壳聚糖(chitosan，CS)作为聚阳离子组分，所合成的CS-PEG-FA化学式结构见图2。合成的CS-PEG-FA用红外光谱、 NMR和/或 MALDI-T0F等技术确认其结构和取代度。纯度超过95%的CS-PEG-FA偶联物可用于后续的 HSV的靶向修饰。3.单纯疱疹病毒的FA-PEG化修饰在制备与纯化单纯疱疹病毒的基础上，将单纯疱疹病毒分别和FA-PEG进行化学偶联修饰(图幻以及和CS-PEG-FA进行包囊修饰(图4)，用荧光胺法确定单纯疱疹病毒的修饰程度，用动态光散射仪(Dynamic light scattering instrument, DLS)测定修饰的病毒的粒径大小，用kta电位仪测定FA-PEG修饰单纯疱疹病毒的表面电荷。同时用常规空斑计数法测定所修饰的HSV的滴度。4.体外细胞实验HSV经过PEG化修饰后，其天然的细胞转导途径被阻断，经修饰的HSV能否被细胞摄入，并具有肿瘤细胞的转导特异性，用体外细胞实验检验其能否有效降低HSV的免疫原性。本发明中，培养叶酸受体过表达的上皮癌细胞KB和叶酸受体缺陷的肺癌细胞 A549，用FA-PEG-HSV、PEG-HSV分别感染，同时以未修饰的HSV作对照。病毒的感染程度用病毒所致的细胞空斑数，免疫荧光细胞化学方法标记表达病毒蛋白的细胞，用流式细胞仪对被感染的细胞进行计数，比较FA-PEG化修饰的HSV和其他HSV的在感染上述细胞之间的异同。结果显示，FA-PEG化修饰的HSV(FA-PEG-HSV)可显著提高靶向转导肿瘤细胞能力 3-10 倍。同时，用FA-PEG-HSV、PEG-HSV和未修饰的HSV分别感染巨噬细胞RAW 264. 1，用 ELISA检测IL-6 (Interleukin 6，IL_6)的分泌量(巨噬细胞分泌细胞因子IL-6的分泌量可直接反应免疫反应的程度)，比较其差异。此外，也可以通过测定感染细胞的HSV基因组的DNA含量间接反应不同病毒直接的免疫反应差异。提取感染了不同病毒的巨噬细胞RAW 264. 1的总DNA，用PCR和定量PCR扩增HSV-I基因组中HSV-TK基因片段，通过电泳比较他们之间的异同。结果显示，FA-PEG化修饰的HSV (FA-PEG-HSV)可有效降低单纯疱疹病毒的免疫原性50% -80%。本发明涉及到的实验技术和方法可以参考本领域已知技术，及到的病毒株及实验用细胞株均可通过商业渠道购得。本发明使用外源靶向物质尤其通过聚乙二醇化叶酸化学改性或修饰单纯疱疹病毒HSV的表面糖蛋白，使其天然的细胞嗜性丧失，而是被特异性地转导入肿瘤细胞或组织， 对其它正常细胞或组织不感染。应用本方法能有效提高单纯疱疹病毒特异性地感染肿瘤细胞的能力，规避免疫反应和体内中和抗体，降低毒副作用，提高安全性。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
图IFA-PEG的合成及化学式结构示图。图2CS-PEG-FA的化学式结构示图。图3FA-PEG化学偶联修饰HSV示意图。图4CS-PEG-FA包囊修饰HSV示意图。
具体实施例方式实施例1HSV-I的培养与纯化Vero细胞接种于直径为12. 5cm的细胞培养皿中，待细胞长至80%满时，细胞培养基更换为含有5%新生小牛血清的DMEM培养基，并以MOI = 0. 05接种病毒HSV。在37°C， 含有5% CO2的培养箱中继续培养72小时。将细胞培养基上清和细胞碎片收集到无菌的冻存管中，-80°C保存。将上述收集到的病毒上清和细胞反复冻融三次，从而充分裂解细胞，释放出细胞中的HSV病毒颗粒。将冻融三次的病毒液放入离心管中，5000rpm，4°C离心10分钟，收集病毒上清。12000rpm，4°C离心30分钟，进一步去除病毒上清中的细胞碎片。将初步纯化好的病毒上清液25ml加入到无菌的超速离心管中(30ml，Beckman Coulter)。将5ml含有25% 蔗糖的HBSS溶液用移液管小心的加入到超速离心管管底，25000rpm，4°C超速离心4小时 (离心机转子型号为Beckman SW^转子)。离心后，倒掉上清液，用2501 HBSS重悬超速离心管底部的HBSS沉淀。将重悬的G207病毒溶液置于4°C摇床，轻柔摇过夜。3000rpm，4°C离心10分钟，进一步去除细胞碎片。取出部分纯化后的病毒进行滴度测定，剩余的病毒-80°C 保存。实施例2FA-PEG的合成及表征将叶酸与NHS形成活化酯，即将叶酸溶于二甲亚砜(DMSO)，与二环己基碳二亚胺 (DCC)，η-羟基丁二酰胺以摩尔比为1 2 2的比率反应，搅拌18小时，整个反应在氮气保护的条件下进行。将所得混悬物15000rpm离心30分钟，除去白色不溶物，取黄色上清液。将与上述叶酸活化物摩尔比为1 8的NH2-PEG-COOH溶于DMS0，在氮气保护的条件下与叶酸活化物反应4小时，将所得物质分别在DMSO和超纯水中于4°C条件下分别透析 3天和2天，将最终产品在_20°C冷冻干燥。将冻干后的产品FA-PEG取部分样品(约5mg)溶于氘代DMSO中，通过核磁共振进行检测，确认反应情况及结构。实施例3
单纯疱疹病毒的FA-PEG化修饰分取甲氧基-PEG-NHS(mPEG)溶于 ^nl HBSS,加入 HSV (mPEG 与 HSV 的比例为 IPFU 的HSV加入1 X IO7个mPEG分子)，冰浴下反应4小时。反应后所得的PEG-FA在超纯水中于4°C条件下透析2天，将最终产品在-80°C保存。将FA-PEG-C00H溶于HBSS中，加入EDC和NHS进行活化，其摩尔比为 1 10 10，室温反应1小时，取活化后的FA-PEG-C00H溶于anl冊33，加入把￥(把￥与 FA-PEG-C00H的比例为IPFU的HSV加入1 X IO7个FA-PEG-C00H分子)，在冰浴下反应4 小时。反应后所得的PEG-FA在超纯水中于4°C条件下透析2天，将最终产品FA-PEG-HSV 在-80°C保存。进一步检测FA-PEG-HSV的纯度，具体是将荧光氨染料溶于丙酮中，配置成7mg/ mL的荧光氨溶液。1001的荧光氨染料中加入9001的HSV或FA-PEG-HSV，立刻混合，然后在黑暗环境下孵育15分钟。通过分光光度计检测荧光强度(激发波长为390nm，发光波长为 475nm)，用PEG- 二胺绘制标准曲线。实施例4靶向修饰的HSV病毒粒径及其zeta电位检测将HSV、PEG-HSV和FA-PEG-HSV溶于超纯水，用动态光散射仪(Dynamic lightscattering instrument，DLS，Malvern公司)分别测定各组病毒颗粒直径的大小。将HSV、PEG-HSV 和 FA-PEG-HSV 分别溶于 2mL 的缓冲液 HBSS (Hank，s Balanced SaltSolution，其成分为 0. 137M NaCl, 5. 4mM KC1,0. 25mM Na2HPO4,0. 44mM KH2PO4,1. 3mM CaCl2,1. OmM MgSO4,4. 2mM NaHCO3, pH7. 4)中，用雷射光散射仪(ZetasizerNano System, Malvern公司)分别测定各组病毒的表面zeta电位大小。实施例5HSV病毒的滴度检测将Vero细胞以3X IO5细胞/孔的密度接种至6孔板中。接种M小时后，待Vero 细胞长至100%满时，去掉细胞培养基，PBS洗一次细胞。然后将事先用DMEM培养基依次10 倍稀释好的HSV病毒或PEG修饰过的HSV病毒加入每孔中。在37°C，含有5% CO2的培养箱中孵育2小时使病毒与细胞充分结合。2小时后，用移液管吸去未与细胞结合的病毒，每孔加入2ml新生小牛血清含量为5%的DMEM培养基，在37°C，含有5% CO2的培养箱中继续培养68小时。68小时后，用移液管吸去细胞上清，每孔加入浓度为10%的甲醛固定液1ml，室温孵育30分钟后，吸去10%甲醛溶液，每孔加入Iml的10%结晶紫(上海生工)溶液-将 Vero细胞染色。室温孵育30分钟后，用清水冲洗6孔板中的Vero细胞，数出每孔的空斑数量，并根据下列公式计算出病毒的PFU值。PFU =空斑数量X病毒稀释倍数实施例6靶向修饰的HSV病毒靶向性检测KB和A549细胞分别以1 X IO5细胞/孔接种于M孔板中进行常规培养。一天后， 分别用HSV、PEG-HSV和FA-PEG-HSV以MOI = 1感染两种细胞系，在37°C，含有5% CO2的培养箱中培养72小时，收集细胞和细胞培养基，化冻三次裂解细胞从而释放细胞中的子代病毒颗粒，检测各组病毒感染细胞后子代PFU数。
实施例7HSV病毒的免疫原性的测定巨噬细胞RAW 264. 1以细胞密度为1 X IO6细胞/孔接种于6孔板中进行常规培养，一天后，用2ml分别包含2 X IO8个病毒颗粒的HSV、PEG-HSV和FA-PEG-HSV的新鲜培养基继续培养M小时。用常规酶联免疫法(ELISA)测定细胞培养物中的白细胞介素6(IL-6) 的分泌量。统计比较各组间IL-2表达量的差异，从而判定其免疫原性。
权利要求
1.一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法，其特征在于，使用外源靶向物质化学改性或修饰单纯疱疹病毒HSV，通过外源靶向物质实现特异性导入肿瘤细胞，避免单纯疱疹病毒 HSV到达肿瘤细胞前被机体免疫系统清除，通过下述步骤1)培养与纯化单纯疱疹病毒，获得最低病毒量为IX1010个病毒颗粒；2)外源靶向物质与单纯疱疹病毒结合，获得纯度超过95%的偶联物；3)单纯疱疹病毒的外源靶向物质-PEG化修饰；4)体外细胞实验验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重靶向的单纯疱疹病毒是I型单纯疱疹病毒或II型单纯疱疹病毒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单纯疱疹病毒是重组单纯疱疹病毒或非重组单纯疱疹病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的重组单纯疱疹病毒包括复制缺陷型的重组单纯疱疹病毒和条件复制型的溶瘤单纯疱疹病毒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源靶向物质选自叶酸或其它肿瘤细胞高表达受体的配体分子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源靶向物质是叶酸。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的其它肿瘤细胞高表达受体的配体分子包括但不限于表皮生长因子、血管内皮生长因子、雌激素、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源靶向物质通过化学耦合方式或生物方式或物理方式与单纯疱疹病毒结合。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重靶向的单纯疱疹病毒的靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤新生血管内皮细胞。
10.权利要求1的重靶向的单纯疱疹病毒在制备提高其特异性地感染肿瘤细胞的能力、规避免疫反应和体内病毒的中和抗体、降低毒副作用和提高安全性制剂中的用途。
全文摘要
本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法，本发明使用外源靶向物质尤其通过聚乙二醇化叶酸化学改性或修饰单纯疱疹病毒HSV的表面糖蛋白，使其天然的细胞嗜性丧失，而是被特异性地转导入肿瘤细胞或组织，对其它正常细胞或组织不感染。应用本方法能有效提高单纯疱疹病毒特异性地感染肿瘤细胞的能力，规避免疫反应和体内中和抗体，降低毒副作用，提高安全性。
文档编号A61P35/00GK102191224SQ20101012499
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者田聆, 薛京伦, 郭圣荣 申请人:复旦大学