专利名称：中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin基因编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑 制剂(EsCystatin)基因的体外重组表达技术及其活性鉴定。本发明利用体外重组表达技 术获得了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin蛋白，该重组蛋白对木瓜蛋白酶 具有一定抑制作用，以及在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
背景技术：
半胱氨酸蛋白酶抑制剂是广泛存在于动植物组织和体液中的蛋白酶抑制剂，它能 与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成紧密的复合物，抑制他们的活性，从而保 护蛋白质的二硫键不被半氨酸蛋白酶破坏，阻止蛋白的降解。半胱氨酸蛋白抑制剂是抑制 半胱氨酸蛋白酶的一类超家族，根据它们的结构特征可分为三个家族。第一类半胱氨酸蛋 白酶抑制剂家族是一类低分子量蛋白，无二硫键；第二类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，也 是只有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，至少有两个分子内二硫键，第三类半胱氨酸蛋 白酶抑制剂家族是含有多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，每个结构域中的二硫键的位置 类似于第二类家族。在脊椎动物中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是抑制半胱氨酸蛋白水解酶的 一类蛋白家族，主要是组织蛋白酶家族的强抑制剂。它们可保护和调控内源蛋白水解酶活 性。在人类抵抗心血管疾病，脑梗死高血压病、糖尿病、原发性肾病、恶性肿瘤时，出现难以 控制蛋白质水解和组织损伤，半胱氨酸蛋白酶抑制剂起到调控和保护的功能。近年来，无 脊椎动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂也有零星报道，比如在肝吸虫(Fasciola hepatica), 线虫(Acanthocheilonema viteae)，马来丝虫(Brugia malayi)，盘尾丝虫(Onchocerca volvulus),巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis),捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)和马蹄蟹(Trachypleus tridentatus)中的半胱氨酸蛋白酶可参与机体的免 疫防御。但是在甲壳动物中还没有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道。中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)属于甲壳动物，是我国重要的水产养殖品种之 一。然而，随着养殖规模和养殖条件的恶化，病害发生日益频繁，尤其是病毒、细菌、真菌等 微生物引起的传染性疾病，每年均造成巨大的经济损失，严重阻碍了甲壳动物养殖业的发 展。因此，开展中华绒螯蟹免疫机制研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，以期通过 蟹自身免疫抵抗力的提高来防止和减少蟹病的发生，具有十分重要的理论与实践意义。因 此从中华绒螯蟹中克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，并对其体外原核重组表达蛋白的抑制 活性进行深入研究，将有助于开发天然的水产药物用于人类疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，为进一步研 究中华绒螯蟹防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治，开发医药产品和饲料添加 剂奠定应用基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因EsCystatin，具有序列SEQIDNo. 1中 碱基序列。其是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin的cDNA序列， 该序列全长为1486bp，包括开放阅读框363bp，编码120个氨基酸，5，非编码区长为92bp， 3’非编码区长为1031bp，有一个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)，和多聚腺苷酸尾巴。利用 PEASY-E1表达载体在大肠杆菌中Rosetta-gami表达菌株中重组表达了该蛋白，表达产物 对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。木瓜蛋白酶浓度为lPg mL—1。当重组蛋白浓度达到 300 u gmL—1时，接近89%的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组蛋白浓度达到350 u g mL—1时，木 瓜蛋白酶活性100%被抑制。其编码蛋白具有SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列，分子量为13. 39kDa,等电点为 5. 48，具有一个半胱氨酸蛋白酶样结构域，没有半胱氨酸残基，没有二硫键。本发明利用表达序列标签技术和cDNA末端快速扩增技术从中华绒螯蟹中克隆到 半胱蛋白酶抑制剂的cDNA的全长序列，通过PCR技术，扩增该基因的全部编码区片段克隆 到pEASY-El表达载体中，在大肠杆菌Rosetta-gami中实现原核体外重组表达。重组产物 经镍琼脂糖凝胶纯化，透析复性后，对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。当重组蛋白浓度达 到300iig mL—1时，接近89%的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组蛋白浓度达到350 iig mL—1 时，木瓜蛋白酶活性完全被抑制。本发明为中华绒螯蟹防御机制提供理论基础，并为中华绒 螯蟹的病害防治，开发医药产品和饲料添加剂奠定应用基础。
图示为本发明中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用图。
具体实施例方式下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。实验例1:中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆用T3引物对中华绒螯蟹血细胞cDNA文库测序获得了 7535条高质量的EST序列， 这些序列被拼接成911条contigs和2032条singletons，通称为Unigenes。其中一条拼 接序列推导出的氨基酸序列与高等动物人，鼠中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白具有较高的 同源性，经SMART软件进行预测，该序列具有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域，序列的 3’端有一个加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴(poly A)。根据这条拼接序列设计正向 引物 P1 (5，-AATGGCGTTCAACACTTCAC-3，)和正向引物 P2(5，-CATCACAATACTATCCTCGCTCAC-3，)和 adaptor dT 引物(5，-GGCCACGCGTCGACTAGTACT17_3，)采用 3，末端的快速扩增技术 扩增半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的3’末端，所得序列进行拼接。然后采用引物P3(5’-TCGA ATTCCCTCAGCACCGGACG-3，)和引物 P4(5，-TTGAGATTTGCTAAGCTTTATTTAGT-3，)扩增中华绒 螯蟹半胱蛋白酶抑制基因的cDNA全长，克隆到pMD-18T载体，选取阳性克隆送至生物公司 进行测序。测序结果与经BLAST分析显示该扩增片段为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。实验例2:本发明的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区体外原核重组表达与抑制活性测定1、重组载体的构建本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pEASY_El原核表达载体。通过PCR 技术，引物 P5 (5’ -ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGAATT-3，)和 P6 (5’ -G AAATAGGAGATGGGTCGGTCCAAT-3’)扩增中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区片段。 反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，65°C退火30秒， 72°C延伸30秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟。将PCR产物直接连接到pEASY_El 原核表达载体，连接液转化大肠杆菌T0P10，菌落PCR筛选并测序。2、重组蛋白的表达和纯化用构建好的重组载体转化Rosetta-gami表达菌株，并筛选阳性克隆，测序确认表 达框的正确性。挑取单克隆，接种于50mL LB液体培养基中，37°C震荡摇床中培养12-16小 时，然后以1 100的比例接种200mL LB液体培养基中，37°C培养至0D600 = 0. 5-0. 7。加入 IPTG，使终浓度达到Immol/mL，继续培养4h。4°C，5000rpm,离心lOmin，收集菌体，于_20°C 冻存备用。同时做未诱导对照，取lml菌液离心，弃去上清后，加入80 iiL水和20 iiL 5X蛋 白上样缓冲液，100°C沸水煮沸10分钟，稍离心，收集上清液和和沉淀，SDS-PAGE检测表达 产物。重组蛋白以包涵体形式存在，以常规方法经过包涵体纯化、复性获得重组中华绒 螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白。 3、重组蛋白的抑制活性测定在每支EP管中加入50 ii L酪蛋白(5. Omg ml/1)，37 °C保温lOmin后，加入 30iiL木瓜蛋白酶(lmg mL—1)和200 y L适量纯化后的重组蛋白，再加缓冲液(50mmol L_1pH7. 6Tris-HCl,2mmol I71 半胱氨酸盐酸盐，0. 1 讓ol L^EDTA)至终体积 300 u L，37°C保 温20min后，加入3mL考马斯亮蓝G250溶液，混勻，室温放置20min，在595nm波长下测剩余 木瓜蛋白酶活性。每一数据测定3次，取平均值。实验结果当重组蛋白浓度达到300 u g mL—1时，接近89%的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组 蛋白浓度达到350 yg mL—1时，木瓜蛋白酶活性100%被抑制(附图所示)。
权利要求
一种中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，它具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其所示信息为(1)序列特征长度1486个碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性(2)分子类型cDNA(3)假设否(4)反义否(5)来源中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(6)序列描述SEQ ID No.1tcgaattccc tcagcaccgg acgagagagc tacatttttt cctcctctga agtgatttgt60cttcgtcttc gtccacgacc ccaaggaaca agatgggtct cagggtcatc agtgtaggac 120tcttcattac tacagtgttg ttaggcatga aagcaaccgc tgtcgggatg cctggaggac 180tgtcagagga gaagccgatg actcccgagg tgcaggagct catcaacgaa gtcaggcccg 240atgtggagga gcacctgggt cgccccgtgt ctcgcttcga ggggttgaac tacaagaccc 300aggtggtgtc aggcctcaac tacttcgtca aggttgacat cggtgacaac gaggtggtgc 360acatcagggt gtaccatacc ttcgacggca ccaacaccct gaatggcgtt caacacttca 420ccgacaaatt ggaccgaccc atctcctatt tctgaggcac ccatccaccc atgatatagt 480aactaagaaa gcagagtccc ctcggtggtt aactatacta tatgcaccca cccaccgcca 540tcacaatact atcctcgctc actcgcatac atacctttcg tttttaaaag attgattata 600gtctatcgac tctataactt gagcactgtg gcttggcccg gggaaccccc cattgtttac 660acaactagcg atgacctgcg catggcgatc tgtctcactg ttagtctacg ttatctattt 720atgcagtata tatataaatt cataatacaa ttacatggtg ttatgaatgg cttgggattt 780gagggaaaga gaacgactcg ggaaaccctc catttcactt gtcaacgtgg ctcatgcgac 840cttgccgcct gaaggacctt ggcaacaggc gccaagccgc actgttaatt cacccttcct 900ccaccatggg aaactcacgt cctgcacagc caagcaaaag agatcatata taacactaat 960aagagagaga gagagaggta gcgagcccct ctgatctcga gtagagtgat ggagccatgt 1020ggcgcagaag ctcggtctcc ctgagcaacg cctaaaggct gaagttagag tcgatggagt 1080ataattatat cgttcatgat tttactgtta caaaagatat atagacccac aaggaaatat 1140tgattagttt attcatgatt ttagtgttgc aagagagata tgcccacaac tatgtaagga 1200gaattgaagt gcttaaatgt atggttgatt cctattttaa atgttgcaag gagatattaa 1260agcaaattat agagaaagga tcgtggtgct tgatttgtca tttcagacgt taaacataaa 1320acaaaggttt agagtgaaaa tgtttataag cagaatttaa ctttcaagta aactcgatta 1380ctcattcaac tatatatata gtattataca taatctctgg tggagggtat ttttacatga 1440ttactaaata aagcttagca aatctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1486
2.权力1要求所述中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂基因编码的蛋白，它具有SEQID No. 2所示的氨基酸序列，其所示信息为(1)序列特征 长度120个氨基酸 类型氨基酸 链型单链拓扑结构线性(2)分子类型蛋白质(3)序列描述:SEQID No. 2Met Gly Leu Arg Val lie Ser Val Gly Leu Phe lie Thr Thr Val 51015Leu Leu Gly Met Lys Aal Thr Ala Val Gly Met Pro Gly Gly Leu202530Ser Glu Glu Lys Pro Met Thr Pro Glu Val Gin Glu Leu lie Asn354045Glu Val Arg Pro Asp Val Glu Glu His Leu Gly Arg Pro Val Ser505560Arg Phe Glu Gly Leu Asn Tyr Lys Thr Gin Val Val Ser Gly Leu657075Asn Tyr Phe Val Lys Val Asp lie Gly Asp Asn Glu Val Val His 808590lie Arg Val Tyr His Thr Phe Asp Gly Thr Asn Thr Leu Asn Gly 95100105Val Gin His Phe Thr Asp Lys Leu Asp Arg Pro lie Ser Tyr Phe 110115120
3.一种根据权利要求2所述的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白的制备方法，其特 征在于⑴利用引物P5和P6扩增中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂基因编码区片段；⑵ PCR扩增产物与pEASY-El载体连接，连接后转化大肠杆菌T0P10，筛选转化子，测序鉴定； (3)重组质粒pEASY-El-cystatin转入表达菌株Rosetta-gami进行诱导培养，超声波破碎 处理菌体收获重组蛋白，经镍柱纯化，透析复性后得到具有活性的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋 白抑制剂蛋白。
4.一种权利要求3所述的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白的应用。其特征在于 中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂的重组产物可作为蛋白酶的抑制剂在开发抗菌类药物和 饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
全文摘要
本发明涉及分子生物学和生物化学技术领域，中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EsCystatin)基因体外重组表达技术及其功能鉴定。公开了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有序列SEQ ID NO.1核苷酸序列和SEQ ID NO.2中氨基酸序列。还公开了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用，利用本发明所获得的重组蛋白在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
文档编号A61K38/57GK101851627SQ20101012489
公开日2010年10月6日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者宋林生, 李凤梅, 王玲玲, 盖雪梅, 邱丽梅 申请人:中国科学院海洋研究所