一种中华绒螯蟹微孢子虫MIRA引物、检测方法和检测试剂盒

本发明属于水产领域，具体涉及一种中华绒螯蟹微孢子虫mira引物、检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

1、中华绒螯蟹（俗称河蟹）在中国的淡水养殖业中占有重要地位，其经济价值和营养价值较高。随着中华绒螯蟹养殖快速、大规模的发展，致使水体环境状况急剧恶化，病害经常发生且越来越严重，其中由微孢子虫引起的肝胰腺坏死病在中华绒螯蟹的养殖中造成了严重的损失。中华绒螯蟹微孢子虫最早是由王文在研究中华绒螯蟹颤抖病时发现感染中华绒螯蟹的，并证实微孢子虫感染本质上是病原体利用宿主的免疫状态减弱进行机会性感染。2007年，王文建立了一种新的 endoreticulatus eriocheirsp. nov.分支。继这一初步发现后，stentiford等人提出形成一个新的属( hepatospora)，并将中华绒螯蟹肝胰腺中的微孢子虫命名为 hepatospora eriocheir。

2、目前有多种检测方法可用于微孢子虫检测，包括组织病理切片检测、显微镜检测以及pcr等方法的分子诊断。虽然生理生化方法结合显微镜的观察可以对中华绒螯蟹微孢子虫进行初步鉴定，且操作方法也不困难，但其对操作人员的技术水平要求较高，不适合全面推广。pcr、rt-pcr技术等分子检测方法普遍需要昂贵的仪器设备无法脱离实验室使用。本实验建立的中华绒螯蟹微孢子虫mira检测技术在37℃下仅需25 min，即可完成反应，最低检测限度为1 copies/μl高于普通104copies/μl的检测限度，检测准确率达100%且有着良好的特异性。研究结果还表明，中华绒螯蟹微孢子虫的mira检测方法可以适用于临床样品检测。综上所述，恒温扩增技术能够快速对中华绒螯蟹微孢子虫进行检测，且反应所需时间短、温度低、仪器设备简单，具有临床应用性可脱离实验室，在养殖现场进行快速检测。因此，建立的mira方法是检测中华绒螯蟹微孢子虫的一种有前途的替代方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明根据中华绒螯蟹微孢子虫保守序列设计并筛选出特异性扩增引物，对筛选出的特异性扩增引物进行标记物修饰，随后对mira反应条件进行优化，结果显示mira在37℃下25分钟即可实现检测。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：中华绒螯蟹微孢子虫mira引物：

4、chi4-17-f：tttttgtattaaatgggatattctgtaggt，seq id no.1；

5、chi4-223-r： aggtactccatcatccgcatcatcttcatc，seq id no.2。

6、进一步地，所述试剂盒还包括mira混合酶、缓冲液、中华绒螯蟹微孢子虫dna、无菌无酶水、醋酸镁、抽提液。

7、进一步地，所述试剂盒的反应体系为：

8、2× mira 混合酶缓冲液14.7 μl（潍坊安普未来生物科技有限公司dna恒温快速扩增试剂盒）；

9、中华绒螯蟹微孢子虫dna 1 μl；

10、无菌无酶水6.05 μl；

11、10 μmol/l的正向引物1 μl；

12、10 μmol/l的反向引物1 μl；

13、醋酸镁1.25 μl。

14、本发明还提供一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测方法，所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，包括以下步骤：

15、(1) 将所需组分冰箱中取出，室温融化，振荡混匀；

16、(2) 完全融化混匀后向每个酶干粉反应管加入29.4 μl mira 混合酶缓冲液，上下颠倒混匀后将其均分为2份，每份14.7 μl；

17、(3) 向每个反应管中分别加入1 μl上游引物和1 μl下游引物，上游引物和下游引物浓度分别为10 μm；

18、(4) 然后依次加入6.05 μlddh2o和1 μl核酸模板；

19、(5) 最后向反应管中加入1.25 μl醋酸镁并充分混合(上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀)；

20、(6) 混匀后，将反应液快速离心至管子底部，然后立即将反应管放入37℃恒温设备中，孵育25 min；

21、(7) 反应结束后，加入75 μl抽提液，混合反应液，12000 rpm离心5 min，取5 μl上清进行琼脂糖凝胶电泳检测。

22、进一步地，所述抽提液为包括tris饱和酚、氯仿、异戊醇，tris饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1。

23、本发明还提供用于检测中华绒螯蟹微孢子虫mira的引物，所述引物的序列为：中华绒螯蟹微孢子虫mira引物：

24、chi4-17-f：tttttgtattaaatgggatattctgtaggt，seq id no.1；

25、chi4-223-r： aggtactccatcatccgcatcatcttcatc，seq id no.2。

26、本发明的有益效果为：

27、与现有的检测中华绒螯蟹微孢子虫的方法比，mira检测技术具有无需热循环、检测时间短、操作简便、灵敏度高、设备配置简单等明显优势效果显著。

28、与普通pcr检测相比，本实验建立的中华绒螯蟹微孢子虫mira检测技术在37℃下仅需30 min，即可完成反应，最低检测限度为1 copies/μl高于普通104copies/μl的检测限度，检测准确率达100%且有着良好的特异性。

29、本发明无需pcr仪器、检测时间短、操作简便、灵敏度高、设备配置简单, 37℃孵育25 min即可完成。

技术特征：

1.一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：中华绒螯蟹微孢子虫mira引物：

2.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括mira混合酶、缓冲液、中华绒螯蟹微孢子虫dna、无菌无酶水、醋酸镁、抽提液。

3.根据权利要求2所述的一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：

4.一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测方法，所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种中华绒螯蟹微孢子虫mira的检测方法，其特征在于，所述抽提液为包括tris饱和酚、氯仿、异戊醇，tris饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1。

6.用于检测中华绒螯蟹微孢子虫mira的引物，其特征在于，所述引物的序列为：中华绒螯蟹微孢子虫mira引物：

技术总结
本申请根据中华绒螯蟹微孢子虫保守序列设计并筛选出特异性扩增引物，对筛选出的特异性扩增引物进行标记物修饰，随后对MIRA反应条件进行优化；本申请MIRA检测技术具有无需热循环、检测时间短、操作简便、灵敏度高、设备配置简单等明显优势效果显著；与普通PCR检测相比，本实验建立的中华绒螯蟹微孢子虫MIRA检测技术在37℃下仅需25 min，即可完成反应，最低检测限度为1 copies/μL高于普通PCR 10<supgt;4</supgt; copies/μL的检测限度，检测准确率达100%且有着良好的特异性。

技术研发人员：孟庆国,宫思楠,郭颖,顾伟
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15