一种从苍术根茎中分离出的内生细菌及筛选方法和应用

本发明涉及苍术内生菌的，尤其涉及一种从苍术根茎中分离出的内生细菌及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、药用植物内生菌对宿主的生长发育和品质形成具有重要的促进作用。苍术具有丰富多样的内生真菌、细菌和放线菌资源，其中的有益菌对苍术的生长发育具有积极的促进作用。苍术的挥发油与内生菌之间也存在紧密的相互作用关系，不同内生菌对苍术挥发油的组成和含量具有不同的调节作用，可能在苍术的品质形成过程中发挥重要作用。虽然有研究分离了不同化学型苍术的内生菌，但是2个化学型苍术是移栽至同一植物园之后才进行内生菌的分离，因此不能反映2个化学型苍术在原生环境中内生菌的多样性，导致我们对不同产地和不同化学型苍术内生菌多样性的了解不够深入，限制了我们对苍术内生微生物与化学型之间关系的认识。

2、近几十年来，由于人们的过度采挖和生态环境的严重破坏，道地产区的野生苍术资源已濒临枯竭。虽然当地有部分农民对野生苍术进行驯化栽培，但是规模较小，品质较差。另外，苍术栽培过程中还存在严重的连作障碍现象，不仅影响苍术自身的生长发育，还影响根际土壤微生物群落组成，导致真菌、细菌和放线菌之间的比例失调，病虫害加剧。因此，如何提高苍术的栽培效率和品质是未来的重点研究方向。植物内生菌具有促进植物生长、增强植物抗逆境、抗病虫害等功能，是未来农业生产中最具应用潜力的微生物资源。基于此，提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种从苍术根茎中分离出的内生细菌及筛选方法和应用，能够显著提高单株鲜重、根鲜重、茎叶重、根长和根干重等生物指标以及挥发油的含量。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种从苍术根茎中分离出的内生细菌，所述内生细菌的保藏名称为食芳香族物副伯克霍尔德氏菌pat10，拉丁文为paraburkholderia aromaticivorans，保藏日期：2023年7月5日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.27816。

4、本发明还提供了一种内生细菌的筛选方法，包含以下步骤：

5、(1)将苍术根茎接种到tsa培养基上，36～38℃的培养箱中培养，得到菌落；

6、(2)将步骤(1)中的菌落，分离纯化后得到内生细菌。

7、作为优选，步骤(1)中所述的tsa培养基包括如下重量份数的原料：胰蛋白胨10～20g/l，大豆胨3～7g/l，氯化钠3～7g/l，琼脂10～20g/l。

8、作为优选，步骤(1)中所述苍术根茎在接种前经过预处理：

9、所述预处理的方法为：

10、(1)将苍术根茎用水冲洗干净后削去表皮，并切成0.4～0.6×0.4～0.6×1.3～1.7cm3的小长方体；

11、(2)将小长方体用水漂洗1～5遍，然后用72～78％的酒精浸泡1～3min，再用水漂洗1～5遍，然后用2.3～2.7％的次氯酸钠浸泡1～9min，最后用水漂洗1～5遍，切成0.5～1.5mm的薄片。

12、作为优选，步骤(2)中所述的分离纯化菌种的方法为：

13、将tsa培养基中的菌落，转接到新的tsa培养基中，采用平板划线法分离、纯化，直至有纯的单菌落产生。

14、本发明还提供了一种内生细菌在促进苍术生长发育、提高品质中的应用。

15、本发明还提供了一种利用内生细菌促进苍术生长发育、提高品质的方法，将内生细菌悬浮液接种在苍术幼苗的根周围，每棵幼苗接种5～15ml内生细菌悬浮液，重复3～7次。

16、作为优选，所述苍术幼苗为移栽至土壤后定植生长7～11d的幼苗，所述内生细菌悬浮液的制备方法为，将内生细菌用tsb液体培养基培养，在摇床上200～240rpm培养44～52h，离心处理后用等体积马铃薯葡萄糖液体培养基重悬细菌细胞，得到内生细菌悬浮液。

17、作为优选，所述的tsb培养基包括如下重量份数的原料：胰蛋白胨10～20g/l，大豆胨3～7g/l，氯化钠3～7g/l，琼脂10～20g/l。

18、作为优选，所述马铃薯葡萄糖液体培养基的制备方法为：称取去皮的马铃薯150～250g，加水950～1050ml，煮沸25～35分钟，过滤后加入15～25g葡萄糖，调节ph至5.4～5.8。

19、作为优选，所述离心的转速为2000～5000rpm，离心时间为3～8min，所述内生细菌悬浮液中内生细菌的浓度为0.8～1.2×108个/ml。

20、本发明提供了一种从苍术根茎中分离出的内生细菌及其筛选方法和应用，所述内生细菌的保藏名称为食芳香族物副伯克霍尔德氏菌pat10，拉丁文为paraburkholderiaaromaticivorans，保藏日期：2023年7月5日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.27816。本发明的苍术根茎内生细菌可以促进养分吸收、抑制病原菌、提高宿主系统抗性，促进苍术的健康生长，提高苍术产量；还可以调节苍术根际和叶际微生物的群落组成，对恢复根际微生物群落结构、消除连作障碍的危害具有巨大的潜力。本发明的有益效果如下：

21、1、将根茎内生菌用于苍术的品种繁育，获得品质优良的苍术品种。在培育苍术新品种时，加强微生物与苍术的共同培育，避免有益微生物的丢失，为获得抗逆性强、品质优良的苍术药材提供保障。

22、2、苍术根茎内生菌可以通过促进养分吸收、抑制病原菌、提高宿主系统抗性等促进苍术的健康生长，提高苍术产量；还可以调节苍术根际和叶际微生物的群落组成，对恢复根际微生物群落结构、消除连作障碍的危害具有巨大的潜力。

23、3、苍术内生菌对苍术次生代谢产物的组成和积累具有重要的调节作用。可以调节苍术挥发油成分的配比关系，进而满足优质苍术药材生产的要求。

24、保藏说明

25、食芳香族物副伯克霍尔德氏菌，保藏名称为食芳香族物副伯克霍尔德氏菌pat10，拉丁文为paraburkholderia aromaticivorans，保藏日期：2023年7月5日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.27816，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

技术特征：

1.一种从苍术根茎中分离出的内生细菌，其特征在于，所述内生细菌的保藏名称为食芳香族物副伯克霍尔德氏菌pat10，拉丁文为paraburkholderia aromaticivorans，保藏日期：2023年7月5日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.27816。

2.权利要求1所述的内生细菌的筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述的tsa培养基包括如下重量份数的原料：胰蛋白胨10～20g/l，大豆胨3～7g/l，氯化钠3～7g/l，琼脂10～20g/l。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述苍术根茎在接种前经过预处理：

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述的分离纯化菌种的方法为：

6.一种利用权利要求1所述的内生细菌或者权利要求2～5任意一项所述筛选方法得到的内生细菌在促进苍术生长发育、提高品质中的应用。

7.一种利用权利要求1所述的内生细菌或者权利要求2～5任意一项所述筛选方法得到的内生细菌促进苍术生长发育、提高品质的方法，其特征在于，将内生细菌悬浮液接种在苍术幼苗的根周围，每棵幼苗接种5～15ml内生细菌悬浮液，重复3～7次。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述苍术幼苗为移栽至土壤后定植生长7～11d的幼苗，所述内生细菌悬浮液的制备方法为，将内生细菌用tsb液体培养基培养，在摇床上200～240rpm培养44～52h，离心处理后用等体积马铃薯葡萄糖液体培养基重悬细菌细胞，得到内生细菌悬浮液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的tsb培养基包括如下重量份数的原料：胰蛋白胨10～20g/l，大豆胨3～7g/l，氯化钠3～7g/l，琼脂10～20g/l。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为2000～5000rpm，离心时间为3～8min，所述内生细菌悬浮液中内生细菌的浓度为0.8～1.2×108个/ml。

技术总结
本发明涉及苍术内生菌的技术领域，本发明提供了一种从苍术根茎中分离出的内生细菌及其筛选方法和应用，所述内生细菌的保藏名称为食芳香族物副伯克霍尔德氏菌PaT10，拉丁文为Paraburkholderia aromaticivorans，保藏日期：2023年7月5日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.27816。本发明的苍术根茎内生细菌可以促进养分吸收、抑制病原菌、提高宿主系统抗性，促进苍术的健康生长，提高苍术产量；还可以调节苍术根际和叶际微生物的群落组成，对恢复根际微生物群落结构、消除连作障碍的危害具有巨大的潜力。

技术研发人员：郭兰萍,王红阳,王升,张成才,康传志,王月枫,李阔,林怀斌
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15