荧光探针组合及其在检测目标基因中的应用

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及荧光探针组合及其在检测目标基因中的应用。

背景技术：

1、基因检测是通过血液、其他体液或细胞对dna进行检测的技术。目前在临床领域中，基因检测应用于辅助临床诊断，主要体现在遗传病检测、遗传性肿瘤检测、个体化用药、病原微生物基因检测以及药物基因组检测等方面。目前应用最为成熟且最具代表性的基因检测服务是无创产前基因检测筛查新生儿遗传性疾病。基因检测也常被应用于癌症的风险预测和早期诊断。影像检查很难发现特别早期的癌症，但影像诊断，内视镜检查等无法确认的微细癌细胞(5mm以下)通常会向血液中释放游离dna，rna等。通过超早期癌症筛查技术，比如ctdna检测、粪便基因检测等技术，可以实现早发现早治疗。除此之外，基因检测还可协助个体化用药指导，以此来筛选药物、判断药物剂量及预测副作用等。近年来，病原微生物的基因组研究也取得了飞速的发展。病原微生物基因检测使人类从更高层次上掌握它们的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。

2、针对基因检测的技术大体分为单基因检测技术和多基因检测技术。单基因检测是指针对某一特定基因进行测序的技术，适用于具有特异疾病表型的疾病。单基因检测技术中应用最广泛的是sanger测序。sanger测序对于验证某一个位点的变异，或者检测几个外显子，非常适用，但速度慢和成本高。实时荧光定量pcr(rt-pcr)也能进行单基因检测，具有特异性强、灵敏度高、高通量等特点。但rt-pcr技术也存在一些缺点，如容易污染，操作较为繁琐。因此，一些操作简单、准确度高、可替代性的检测技术及产品仍有市场需求。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了荧光探针组合、试剂盒及其应用、检测目标基因的方法、提取目标基因的方法和生物样本原位标记的方法，利用本发明的荧光探针针对目标基因的特定区域进行设计，可以识别出目标基因的复制和转录水平，具有操作简单、特异性强、准确度高和灵敏度高等优点，不仅有望用于肿瘤、神经退行性疾病等疾病的筛查或伴随诊断，也有助于更好地开展生物学研究，具有重要应用价值。

2、在本发明的一个方面，本发明提出了一种荧光探针组合。根据本发明的实施例，所述荧光探针组合包括：具有荧光基团修饰的核酸引物，所述具有荧光基团的核酸引物用于结合目标基因中与可形成g-四链体区域相邻的核酸序列；荧光化合物，所述荧光化合物用于结合目标基因中可形成g-四链体区域；所述荧光基团和荧光化合物可发生荧光共振能量转移效应。

3、g-四链体是由富含鸟嘌呤碱基的单链dna在一价阳离子(如k+和na+)的条件下通过分子间氢键作用形成的一种特殊的dna二级结构。g-四链体具有平行、反平行和(3+1)杂合型等多种不同的拓扑结构。更重要的是，g-四链体在生物体内具有丰富的生物学功能。计算机模拟计算表明，在人体基因组中大约含有376000个可以形成g-四链体的序列，它们主要位于端粒和一些重要的原癌基因(包括c-myc、vegf、k-ras、bcl-2、c-kit等)的启动子区。g-四链体在调控这些基因的转录、复制和重组以及保持端粒稳定性方面具有重要作用。

4、本发明的荧光探针组合中，具有荧光基团修饰的核酸引物结合到目标基因可形成g-四链体区域相邻的核酸序列，荧光化合物结合目标基因可形成g-四链体区域，荧光基团和荧光化合物靠近时可发生荧光共振能量转移效应(fret)，并且产生的荧光强度与目标基因的含量呈正相关。由此，利用本发明的荧光探针组合可以实现目标基因检测、提取或原位标记，具有重要意义。

5、根据本发明的实施例，上述荧光探针组合还可以具有下列附加技术特征：

6、根据本发明的实施例，所述核酸引物选自目标基因中与可形成g-四链体区域相邻的核酸序列的互补序列或与所述互补序列相比增加1～40个碱基的序列。

7、根据本发明的实施例，所述核酸引物的长度选自5～500个碱基，优选5～70个碱基。可以使得核酸引物更加特异性地靶向结合到目标基因可形成g-四链体区域相邻的核酸序列。

8、根据本发明的实施例，所述核酸序列中靠近所述g-四链体区域的末端与所述g-四链体区域中靠近所述核酸序列的末端相距1～6个碱基。由此，以便使荧光基团和荧光化合物可以更好地发生荧光共振能量转移效应。

9、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自fam基团、fitc基团、amca基团、alexafluor基团、cy5.5基团、cy5基团、cy7基团、cy3.5基团、cy3基团、fitc基团或tamara基团。

10、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自cy3基团、cy3.5基团、cy5基团、cy5.5基团、cy7基团、fam基团或amca基团，优选cy3基团或cy5基团。由此，既不容易影响核酸引物与目标基因可形成g-四链体区域相邻的核酸序列的特异性结合，也容易与荧光化合物发生荧光共振能量转移效应。

11、根据本发明的实施例，所述荧光化合物为式i-iv任一所示的化合物或其立体异构体的化合物或其反离子；

12、

13、其中，n＝1、2或3；r1为氢、c1-6烷基、苯基或c1-4烷基取代的苯基；r和r’独立地为氢原子、氟、氯、溴、碘、苯基、c1-6烷基、c1-6卤代烷基或c1-6烷氧基；r2和r3独立地为c1-6烷基、烷氧基或羟基；r4-r7独立地为氢、c1-6烷基、苯基或c1-4烷基取代的苯基；x、x1和x2独立地为碳、氧、硫、硒或碲；反离子独立地为三乙胺、氯离子、溴离子或碘离子。

14、根据本发明的实施例，r1为氢或c1-6烷基；r和r’独立地为氢原子、氟、氯、溴或碘；r2和r3独立地为c1-4烷基；r4-r7独立地为氢或c1-6烷基；x、x1和x2独立地为碳、氧或硫。

15、根据本发明的实施例，所述荧光化合物为下列化合物或其立体异构体的化合物或其反离子：

16、

17、

18、上述荧光化合物既容易结合目标基因中与可形成g-四链体区域相邻的核酸序列，也容易与荧光化合物发生荧光共振能量转移效应。

19、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自cy3基团，所述荧光化合物选自

20、

21、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自cy3.5基团，所述荧光化合物选自

22、

23、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自cy5基团，所述荧光化合物选自

24、

25、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自cy5.5基团，所述荧光化合物选自

26、

27、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自cy7基团，所述荧光化合物选自

28、

29、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自fam基团，所述荧光化合物选自

30、

31、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自amca基团，所述荧光化合物选自

32、

33、根据本发明的实施例，所述荧光基团选自fitc基团，所述荧光化合物选自

34、

35、在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述荧光探针组合。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒中的荧光探针组合可以特异性地结合目标基因中g-四链体区域及其相邻的核酸序列，荧光基团和荧光化合物发生荧光共振能量转移效应，并且产生的荧光强度与目标基因的含量呈正相关。由此，利用本发明的荧光探针组合可以实现目标基因检测、提取或原位标记，具有重要意义。

36、根据本发明的实施例，所述荧光组合探针是以溶液的形式提供的，所述溶液中的溶剂选自生理盐水、钾盐溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、磷酸盐的缓冲溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、乙腈溶液、二甲基亚砜溶液和二甲酰胺溶液的至少一种。其中，需要说明的是，“甲醇溶液”可以是纯的甲醇，也可以是甲醇和水以任意比例混合得到的溶液。同理，“乙醇溶液”、“乙腈溶液”、“二甲基亚砜溶液”和“二甲酰胺溶液”也是如此，在此不再一一赘述。

37、根据本发明的实施例，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液和磷酸盐的缓冲溶液的ph值均为4.5-8.2，浓度均为0.1-50mmol/l。由此，缓冲液的ph值与细胞内的ph值接近，与细胞的生物相容性好。

38、在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述荧光探针组合在目标基因检测和/或生物样本原位标记中的用途。如前所述，本发明的荧光探针组合可以特异性地结合目标基因中g-四链体区域及其相邻的核酸序列，荧光基团和荧光化合物发生荧光共振能量转移效应，并且产生的荧光强度与目标基因的含量呈正相关。由此，利用本发明的荧光探针组合可以实现目标基因检测和原位标记，以诊断或者非诊断为目的，具有重要意义。

39、根据本发明的实施例，所述目标基因选自单基因。

40、根据本发明的实施例，所述生物样本选自细胞、微生物或组织切片。

41、根据本发明的实施例，所述标记的方式包括染色。

42、在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述荧光探针组合在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断疾病。如前所述，本发明的荧光探针可用于目标基因的检测，从而有助于疾病的诊断。

43、根据本发明的实施例，所述疾病选自单基因疾病。具体地，疾病包括下列至少一种基因异常所引发的疾病：c-myc基因、cy3基因、cy3.5基因、cy5基因、cy5.5基因、cy7基因、fam基因、amca基因、fitc基因。

44、在本发明的又一方面，本发明提出了一种利用前面所述荧光探针组合或试剂盒检测目标基因的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：基于目标基因可形成g-四链体区域相邻的核酸序列，设计用于结合所述核酸序列的具有荧光基团修饰的核酸引物；将所述具有荧光基团修饰的核酸引物、用于结合目标基因可形成g-四链体区域的荧光化合物与生物样本进行接触，产生荧光信号；基于所述荧光信号，对所述生物样本中目标基因进行定性和定量分析。由于荧光基团和荧光化合物发生荧光共振能量转移效应，且荧光信号强度与目标基因含量呈正相关，由此，可以实现准确检测目标基因的目的。具体地，既可以识别检测目标基因g-四链体，也可以进一步基于目标基因g-四链体结构，以便获知目标基因信息，以诊断或非诊断为目的。

45、根据本发明的实施例，所述目标基因为单基因。

46、根据本发明的实施例，所述生物样本选自体液、细胞、dna或rna。

47、在本发明的又一方面，本发明提出了一种生物样本原位标记的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述荧光探针组合与生物样本接触，所述生物样本中目标基因处产生荧光信号。由此，可以对生物样本中的目标基因进行原位标记，便于对其研究分析。

48、根据本发明的实施例，所述目标基因为单基因。

49、根据本发明的实施例，所述生物样本选自体液、细胞、dna或rna。

50、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。