提高中华绒螯蟹肝胰腺活性的乳酸菌复合剂及其制备方法与流程

本发明属于生物化学领域，涉及一种乳酸菌复合剂，具体为一种提高中华绒螯蟹肝胰腺活性的乳酸菌复合剂及其制备方法。

背景技术：

中华绒螯蟹(eriocheirsinensis)又称中华绒螯蟹，是我国重要的养殖经济蟹类。我国的中华绒螯蟹养殖模式在不断的改善和发展，养殖产量也在逐年上升。2014年中华绒螯蟹肝胰腺养殖产量高达79.65万吨，总产值达500亿元左右，中华绒螯蟹养殖已成为提高就业水平和改善人民生活质量的一个有效的手段。

中华绒螯蟹的品质及其安全性是目前危害产业发展的关键性因素。中华绒螯蟹肝胰腺是其多种生物功能代谢的重要器官，包括摄食、解毒等。提高中华绒螯蟹肝胰腺活性，不但可以有效促进中华绒螯蟹生长，还能提高中华绒螯蟹对外源性污染物的代谢速率，提高存活率，提高中华绒螯蟹品质，保障食品安全。例如，养殖环境中明细抗菌剂(防治弧菌等细菌性疾病)、杀虫剂(清塘等)的使用会造成外源性化学污染物破坏中华绒螯蟹肝胰腺的养殖环境，造成中华绒螯蟹肝胰腺的慢性中毒，甚至损伤中华绒螯蟹肝胰腺肝胰腺等重要的组织器官，影响中华绒螯蟹肝胰腺的蜕壳、摄食和生长，再加上水体ph偏高、水体溶氧低、蟹塘底质差等环境因子的胁迫，极易造成某些疾病的大规模爆发，造成重要的经济损失，并威胁中华绒螯蟹养殖品品质。

中华绒螯蟹肝胰腺活性的降低，中华绒螯蟹会出现停止摄食、仅仅依靠消耗自身营养来维持生命活动，最终出现中华绒螯蟹营养不足，此外，养殖过程中大量投喂冰鲜鱼和高蛋白饲料，均会严重影响中华绒螯蟹肝胰腺肝胰腺的物质代谢过程。如，池塘边果蔬泼洒的农药会直接损害中华绒螯蟹肝胰腺的肝胰腺组织，干扰其正常生理代谢，影响中华绒螯蟹摄食和生长，降低其免疫力。此外，由于清塘药物残留等胁迫因子作用下，虾青素被大量消耗来去除机体应对胁迫产生的活性氧，最终中华绒螯蟹肝胰腺肝胰腺会出现白化症。如何保障和提高养殖过程中中华绒螯蟹肝胰腺活性成为关键性技术因素之一。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种提高中华绒螯蟹肝胰腺活性的乳酸菌复合剂及其制备方法，该乳酸菌复合剂有效提高中华绒螯蟹肝胰腺活性和韧性，促生长，提高存活率，提高中华绒螯蟹品质。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种提高中华绒螯蟹肝胰腺活性的乳酸菌复合剂，包括如下组分：格氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和缓冲剂，其中，格氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌的总活菌浓度为大于等于100亿/克。

优选的，所述乳酸菌复合剂还包括葡萄糖。

作为一种优选方案，所述乳酸菌复合剂由如下质量百分比的组分组成：格氏乳杆菌15～20％，植物乳杆菌12～25％，嗜酸乳杆菌10～25％，缓冲剂0.8～5.5％，葡萄糖30～45％。

更佳地，所述乳酸菌复合剂由如下质量百分比的组分组成：格氏乳杆菌20％，植物乳杆菌15％，嗜酸乳杆菌15％，缓冲剂5％，葡萄糖45％。

更优选地，格氏乳杆菌的活菌浓度为80～100亿/克。

更优选地，植物乳杆菌的活菌浓度为70～100亿/克。

更优选地，嗜酸乳杆菌的活菌浓度为50～100亿/克。

作为一种优选实施方案，所述格氏乳杆菌的活菌浓度为100亿/克，植物乳杆菌的活菌浓度为100亿/克，嗜酸乳杆菌的活菌浓度为100亿/克。

优选的，所述缓冲剂包括如下组分：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁和氯化钠。

优选地，所述缓冲剂中各组分占所述乳酸菌复合剂的质量百分比为：磷酸二氢钾0.1～1％、磷酸氢二钾0.1～1％、硫酸镁0.1～1％、氯化钠0.5～2.5％。

本发明的另一目的是提供上述提高中华绒螯蟹肝胰腺活性的乳酸菌复合剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)制备纳格氏乳杆菌：将格氏乳杆菌菌株接种到培养基中，活化后进行发酵，获取格氏乳杆菌菌粉；

步骤2)制备植物乳杆菌：将植物乳杆菌菌株接种到培养基中，活化后进行发酵，获取植物乳杆菌菌粉；

步骤3)制备嗜酸乳杆菌：将嗜酸乳杆菌原种接种到培养基中，发酵，获取嗜酸乳杆菌菌粉；

步骤4)配置缓冲剂；

步骤5)所述格氏乳杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉与缓冲剂混合均匀即得。

需要注意的是，上述培养基为液体培养基，根据《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克d.w.拉塞尔著)指导制备而得。

优选地，上述发酵为二级发酵。

优选地，步骤1)中的活化时间为18h。

优选地，步骤1)中发酵是按照5％接种量进行发酵。

更优选地，步骤1)发酵培养基配方为(质量分数)可溶性淀粉37％、豆粉30％、鱼粉20％、糖蜜10％，氯化钠3％。

更优选地，步骤1)中的发酵是在28℃发酵36h。

优选地，步骤1)还包括发酵后，用柠檬酸将液体发酵物的ph值调至4～4.5。

优选地，步骤2)中的活化时间为24h。

优选地，步骤2)中发酵是按照5％接种量进行发酵。

更优选地，步骤2)发酵培养基配方为(质量分数)可溶性淀粉45％、黄原胶10％、糖蜜30％、豆粉12％、氯化钠3％。

更优选地，步骤2)中的发酵是在28℃下发酵48h。

优选地，步骤2)还包括发酵后，用柠檬酸将液体发酵物的ph值调至4。

优选地，步骤1)中获取所述格氏乳杆菌菌粉的操作为：冷冻干燥。

优选地，步骤2)中获取所述植物乳杆菌菌粉的操作为：冷冻干燥。

优选地，步骤3)中发酵是按照5％接种量进行发酵。

更优选地，步骤3)发酵培养基配方为(质量分数)麸皮38％、秸秆20％、豆饼粉29％、尿酸1％、氯化钠2％、草酸10％。

更优选地，步骤3)在37℃下发酵56h。

优选地，步骤3)中获取所述嗜酸乳杆菌菌粉的操作为：将液体发酵物于-40℃冷冻干燥。

本发明还提供上述提高中华绒螯蟹肝胰腺活性的乳酸菌复合剂在中华绒螯蟹养殖中的应用。

本发明的有益效果是：

在水产养殖中：有效提高中华绒螯蟹肝胰腺活性，具体体现在降低中华绒螯蟹血淋巴中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、肝糖元和谷丙转氨酶活力，从而避免空肠空胃、鳃丝萎缩，避免上皮细胞角质膜变薄、细胞核异染色质化、酶体数量增等现象，提高中华绒螯蟹生理活性，提高中华绒螯蟹品质。

此外，本发明提供的水体乳酸菌复合剂配方组分较少，生产流程简单，生产工序少，成本低廉，环境友好，符合“提质增效、减量增收、绿色发展、富裕渔民”的渔业生产转方式调结构的工作方针，也是中华绒螯蟹绿色减排提质增效养殖的核心技术，是推动水产养殖绿色发展的重要方向，应用前景十分广阔，具有很大的推广意义。

附图说明

图1是实施例中空白对照组中华绒螯蟹肝胰腺组织切片显微图(100×)。

图2是实施例中实验组1中华绒螯蟹肝胰腺组织切片显微图(100×)。

图3是实施例中实验组2中华绒螯蟹肝胰腺组织切片显微图(100×)。

图4是实施例中实验组3中华绒螯蟹肝胰腺组织切片显微图(100×)。

具体实施方式

下面结合实施方式对本发明作进一步详细、完整地说明。

所需仪器及试剂：

(1)仪器：

超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，发酵罐，冷冻干燥仪，生化培养箱，干燥箱，粉碎机。

(2)试剂：

液体培养基，根据《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克d.w.拉塞尔著)指导制备而得。

格氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌，由江苏宏螯农业发展有限公司自行分离鉴定。

葡萄糖，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

磷酸二氢钾，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

磷酸氢二钾，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

硫酸镁，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

氯化钠，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

实施例1～4

分别按照表1中各组分的质量百分比及活菌浓度采用以下方法制备本发明提供的乳酸菌复合剂：

表1

实施例1～4所用乳酸菌复合制剂制备步骤如下：

(1)制备格氏乳杆菌菌粉：无菌条件下，将格氏乳杆菌菌株接种到液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化18h，随后将活化后的格氏乳杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行二级发酵36h，以柠檬酸调节ph至4，冷冻干燥，即得格氏乳杆菌菌粉；发酵培养基配方为(质量分数)可溶性淀粉37％、豆粉30％、鱼粉20％、糖蜜10％，氯化钠3％。

(2)制备植物乳杆菌菌粉：无菌条件下，将植物乳杆菌菌株接种到液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化24h，随后将活化后的植物乳杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行二级发酵48h，以柠檬酸调节ph至4，冷冻干燥，即得植物乳杆菌菌粉；发酵培养基配方为(质量分数)可溶性淀粉45％、黄原胶10％、糖蜜30％、豆粉12％、氯化钠3％。

(3)制备嗜酸乳杆菌菌粉：无菌条件下，将嗜酸乳杆菌菌株接种到液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化24h，随后将活化后的嗜酸乳杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行二级发酵48h，以柠檬酸调节ph至4，与-40℃下冷冻干燥，即得嗜酸乳杆菌菌粉；发酵培养基配方为(质量分数)麸皮38％、秸秆20％、豆饼粉29％、尿酸1％、氯化钠2％、草酸10％。

(4)制备缓冲剂：按照表1所列配比混合均匀磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁和氯化钠粉末，即得营养剂。

(5)将上述格氏乳杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、缓冲剂按照表1的百分含量混合均匀后得到所述乳酸菌复合剂，常温保存即可。

活性效果实验：

(1)酶活分析

对中华绒螯蟹分组分别投喂实施例1～4所制备得到的乳酸复合制剂之后，对中华绒螯蟹肝胰腺抽样，测定谷氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、血清总蛋白、血清白蛋白等参数，结果见表2(乳酸复合制剂对中华绒螯蟹肝胰腺生化指标的影响(n＝5))。试验结果表明使用乳酸复合制剂后，中华绒螯蟹肝胰腺谷氨酸氨基转移酶等活性显著提高，而总蛋白及白蛋白无显著性差异，说明乳酸复合制剂的安全性。

表2

(2)组织切片分析

设置未投喂乳酸复合剂的中华绒螯蟹作为空白对照组，将实施例1所制备的乳酸复合剂按照3％的投喂量分别投喂15d(实验组1)、30d(实验组2)、45d(实验组3)，并比较空白对照组合实验组1～3的中华绒螯蟹肝胰腺细胞。

由图1～4可看出，相比空白对照组，投喂实施例1所制备的乳酸复合制剂的中华绒螯蟹肝胰腺细胞界限明显，无细胞空泡变性，细胞横纹清晰，肌间隙变窄。以上结果说明乳酸能大幅度提供中华绒螯蟹肝胰腺组织的韧性。

同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同设备等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。