专利名称：重组1型单纯疱疹病毒及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子病毒基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种重组1型单纯疱疹病毒，同时还涉及重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，还涉及重组1型单纯疱疹病毒在抗肿瘤中的应用。
背景技术：
病毒感染敏感宿主细胞(包括肿瘤细胞)并在其内大量复制，最终导致细胞裂解死亡。若病毒只能选择性地在肿瘤细胞内复制，而对正常细胞无害，则病毒可能成为高效杀肿瘤制剂。这是所有进行癌症治疗的最基本的重要原则，可惜目前所有抗癌药物都做不到这一点，它们敌我不分，在杀死癌细胞的同时也杀死了正常细胞，使癌症治疗失败。我们正是根据这一原则，提出创新性思路，进行较长期的工作，取得了成果，故而提出专利申请。
随着分子生物学、病毒学、免疫学等相关学科的发展和交叉渗透，利用基因工程方法改造病毒，使其选择性地杀死肿瘤细胞而对正常细胞安全已经成为可能。基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段，将极大程度地改变人类疾病治疗的历史进程。基因治疗有可能率先取得突破的是发病机制明确的遗传病的治疗，如囊性纤维变性[Marshall，1995]。值得探索的研究是感染性疾病，如艾滋病和肿瘤的基因治疗。肿瘤患者数量繁多，缺乏有效的治疗手段，预后极差，对基因治疗提出了迫切要求，而且肿瘤基因治疗的伦理学问题较少，因此肿瘤基因治疗的研究成为备受关注的热点。
上世纪初，人们发现肿瘤患者在感染病毒或接种病毒疫苗后，肿瘤偶尔会消退，由此产生了用病毒治疗肿瘤的设想。几十年来，呼肠孤病毒(Reovirus)、流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、流感病毒(Influenza virus)和麻疹病毒(Measles virus)等三十多种野生型病毒(既未经基因工程改造)曾先后用于治疗肿瘤，结果大多是相似的治疗初期，肿瘤明显消退，但随着治疗的继续深入，肿块恢复生长，由于这类野生型病毒都能感染正常细胞，因而均伴随有病毒感染和病毒感染引起的免疫反应带来的毒副作用[Sinkovics J and Horvath J，1993]。在经历了多次失败后，人们逐渐放弃了对野生型病毒治疗模式的探索[Sinkovics J and Horvath J，1993]。
二十世纪九十年代，分子生物学、肿瘤学及病毒学的发展突飞猛进，肿瘤发生的分子机制，细胞与病毒间的作用机制，信号传导通路，凋亡抑制与诱发机制等逐渐被阐明。人们开始有目的地选择和改造一些病毒，例如改造人呼肠孤病毒(Reovirus)，单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)，腺病毒(Adenovirus)，反转录病毒(Retrovirus)等，使它们能选择性地在肿瘤细胞中复制，并进一步杀灭肿块，但对正常细胞不能造成裂解性感染。这一类病毒，被称为条件性复制病毒或选择性复制病毒(Conditionalreplicative viruses)，或溶瘤病毒(Oncolytic viruses)。
构建病毒载体，也就是有目的地构建一种重组病毒，传统方法是共转染后同源重组，筛选重组病毒。一种新的方法是细菌人工染色体(BAC，bacterial artificialchromosome)(Shizuya H.et al.，1992)在大肠杆菌的“性质粒”F因子(F factor)的基础上发展起来的。这种方法不用从野生型病毒中筛选重组体，可以直接得到重组病毒，但必须借助于同源重组的方法。在大肠杆菌中，同源重组是依赖各种重组酶完成的。依赖RecA蛋白的同源重组(Yang XW，1997)是利用一种温度敏感型的穿梭载体(shuttlingvector)。这个载体含有一个温度敏感型复制起始子(ts-ori)，使它在30℃时可在宿主菌中顺利复制，而在43℃培养环境中会从宿主菌中丢失；穿梭载体中还包含一个大肠杆菌的RecA基因，它的表达产物可克服因为BAC的宿主菌是重组缺陷型(RecA-)而不能有效进行同源重组的弊端；另外，它也含有筛选标记和负筛选标记，因为如果选择四环素抗性，镰孢菌酸就可以作为一种针对四环素的负筛选剂，含有四环素抗性基因的细菌是不能在含镰孢菌酸的平板上生长的。
许多病毒基因组中存在凋亡诱发基因和凋亡抑制基因，且处于相对平衡状态。正是由于凋亡诱发基因的存在，病毒才导致细胞凋亡；另一方面，正是由于凋亡抑制基因的存在，病毒在细胞中才得以复制，产生子代病毒，感染周围的细胞。从整体上看，缺失凋亡抑制基因的病毒感染正常细胞仅能诱发细胞凋亡而不能抑制细胞凋亡，因而细胞死亡，病毒不能复制，不会对机体造成严重危害。由于肿瘤细胞呈无限增殖状态或“凋亡抑制”状态，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的复制，因此这种病毒在肿瘤细胞内能选择性增殖，进而裂解杀死肿瘤细胞[Nurse，1997]。
已发现的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirus)的E1B[Rao，1992]、单纯疱疹病毒(HSV)的icp34.5[Chou，1992]、痘病毒的CrmA[Datta，1997]、人巨细胞病毒(HCMV)的IE1、IE2[Zhu，1995]、人乳头瘤病毒(HPV)的E6[Xu，1995]等基因。根据上述理论，缺失这些基因的病毒都可望用于肿瘤的生物治疗。
1996年10月，Science报道了美国ONYX制药公司的Bischoff等人用缺失凋亡抑制基因E1B55K的腺病毒治疗肿瘤的研究。这种腺病毒在正常细胞中不复制，但能在癌细胞中复制并最终裂解杀灭癌细胞。将这种腺病毒注入荷人宫颈癌的裸鼠瘤体内，发现所有肿瘤尺寸均显著减小，60％的实验肿瘤完全消退[Bischoff，1996]。1997年11月，Science又报道了一期临床试验结果32例受试头颈癌患者中，12例肿瘤尺寸明显减小，减小幅度可达90％，未发现任何毒副作用。用其他肿瘤进行的安全性实验和用头颈癌进行的二期临床试验正在进行之中。据报道，在二期临床中，由于1例患者死亡，故以后的开发工作停止。
另一类改造病毒的方法是缺失病毒核苷酸代谢所需要的酶，包括胸腺核苷酸激酶，核苷酸还原酶，脱氧尿苷酸酶等。这一类病毒裂解杀死肿瘤细胞的分子基础是肿瘤细胞的核苷酸代谢远较正常组织细胞旺盛，肿瘤细胞可以为病毒提供DNA复制所必须的这些酶，而正常细胞却不能，由此达到了选择性裂解杀死肿瘤细胞的目的。这一类病毒以缺失核糖核苷还原酶(ribonucleotide reductase)的hr3为代表(Mineta，T.et al.，1994)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组1型单纯疱疹病毒，该病毒靶向性强，安全性好，可选择性地感染肿瘤细胞，而对正常细胞无毒害作用。
本发明的另一个目的在于提供一种制备重组1型单纯疱疹病毒的方法，该方法简单易行，而且检测直观明了。
本发明的再一个目的在于提供一种重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防肿瘤中的应用，作为抗肿瘤候选药物，靶向性强，安全性好，提高了抗肿瘤效果。
本发明还涉及重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防人肝癌中的应用。
本发明还涉及重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防人膀胱癌中的应用。
本发明还涉及重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防入神经胶质瘤中的应用。
本发明还涉及重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防人喉癌中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施
重组1型单纯疱疹病毒Simplexvirus Herps simplexvirus 1rHSVΔrr-34.5/lac(A Herpes Simplex Virus Type I with an Diplex Inactive icp34.5 and rr gene)，保藏中心编号CCTCC-V200601，保藏日2006年2月14日。一种制备重组1型单纯疱疹病毒的步骤如下1.重组质粒pHSV1-Δrr的构建1)重组质粒pAEB的构建细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes，BAC)BAC-V1(Strathdee CA et al.，1999)整合了HSV-1的全基因组，只在非必须基因UL41(编码vhs蛋白)处插入了BAC的各个元件(原核复制起点，氯霉素抗性基因)。以HSV-1的细菌人工染色体BAC-V1 DNA为模板用PCR技术分别扩增HSV-1的核糖核苷还原酶大亚基基因(3410bp，Genebank编号NC001806)的A(480bp，140-620nt)、B(388bp，1717-2105nt)两个片段，A的上下游引物中含EcoRI酶切位点，B的上下游引物中含XhoI酶切位点。回收PCR产物，分别以EcoRI和XhoI单酶切，并克隆到质粒pIRES-EGFP(购自Clonetech公司)(IRES为内部核糖体进入位点，EGFP为增强型绿色荧光蛋白基因)的同样酶切位点，因为pIRES-EGFP的IRES上游362bp含有一个EcoRI酶切位点，EGFP下游288bp含有一个XhoI酶切位点，因而可得到重组质粒pAEB，A，B片段可作为同源重组的两个臂使用。
2)穿梭质粒pSV1-AEB的构建质粒pSV1-RecA(Yang w.et al.，1997)的RecA基因上游含有一个SalI酶切位点；重组质粒pAEB的A片段上游7bp含有一个SalI酶切位点，B片段下游65bp含有一个SalI酶切位点。用SalI酶切质粒pSV1-RecA4小时后，牛肠去磷酸化酶(CIAP)处理0.5小时，纯化回收；同时用SalI酶切质粒pAEB，切下含有A-IRES-EGFP-B的3500bp的片段，纯化回收，并与上述SalI酶切的质粒pSV1-RecA连接构建质粒pSV1-AEB。
3)RecA依赖的共整和体的形成将质粒pSV1-AEB电转化含HSV-1细菌人工染色体BAC-V1 DNA的大肠杆菌DH10B，铺在含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB平板上，30℃培养过夜。用无菌牙签随机挑取菌落至LB中漂洗，漂洗液再次接种在含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB平板上，在43℃过夜培养，使质粒pSV1-AEB的DNA和BAC-V1 DNA通过A、B臂在HSV-1的rr基因处同源重组形成共整和体菌落。
4)rr基因失活重组质粒pHSV1-Δrr的获得将上述由pSV1-AEB和BAC-V1 DNA的共整和体菌落在含氯霉素(12.5mg/L)的LB平板中划线，43℃培养过夜，诱导同源重组的发生和共整和体的解离，接着用四环素的反筛选剂镰胞菌酸筛选重组菌落，得到含HSV-1基因组的rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr(核糖核苷还原酶大亚基基因620-1717nt共1097bp缺失，其中插入了IRES-EGFP基因导致rr基因失活)。
2.重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的构建1)β-半乳糖苷酶(lacZ)表达盒的获得与纯化猴病毒40(SV40)启动子(1bp-419bp)控制着载体pSV-β-Galactosidase(购自promega公司)上的lacZ基因(710bp-3755bp)的表达，pSV-β-Galactosidased的lacZ基因3′端含有1个PolyA序列(4021bp-4156bp)；SV40启动子上游(6814bp)和lacZ编码序列的近3′末端(3701bp)处各含有1个EcoRI位点，lacZ表达盒下游4151bp处则含有1个BamHI位点；故用BamHI和EcoRI双酶消化，DE81膜回收大片段，获得LacZ表达盒(4160bp)，其中含有SV40(启动子)-lacZ-polyA.
2)中间载体I pFL的构建载体pFastBac1(购自Gibco公司)多克隆位点(MCS)中含有EcoRI和BamHI位点，用EcoRI和BamHI双酶切消化，与步骤1)中EcoRI和BamHI双酶消化的lacZ表达盒连接，构建中间载体I pFL，该中间载体I pFL的lacZ表达盒上游(即SV40启动子上游)具有载体自身的1个Not1位点。
3)中间载体II pBL的构建BamHI和XhoI双酶切中间载体I pFL以切下lacZ表达盒；同时BamHI和XhoI双酶切质粒pBluescript-M13成线型DNA；将lacZ表达盒与线型pBluescript-M13连接，构建成中间载体II pBL，使lacZ表达盒下游也获得载体本身的1个NotI位点；于是，lacZ表达盒上下游均带有NotI位点。
4)转移载体pIL的构建质粒p4789(B.Roizman.et al.，1994)带有完整的HSV-1的icp34.5基因(Genebank编号M33699)及其侧翼序列；用NotI酶切质粒p4789，以切去icp34.5基因262bp到终止子1084bp的长823bp序列；同时再以NotI酶切中间载体II pBL，获得lacZ表达盒，并连接到经NotI酶切的质粒p4789上，构建转移载体pIL。该转移载体pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp并被lacZ表达盒插入双重灭活。
5)重组病毒的获得转移载体pIL与1.4)中得到的rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr共转染叙利亚仓鼠肾细胞系(BHK21)(购自中国典型培养物保藏中心，武汉)，经过同源重组，获得icp34.5基因被lacZ表达盒插入失活、核糖核苷还原酶基因rr被EGFP基因插入失活的重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δrr-34.5/lac，用病毒上清感染含Xgal软琼脂培养基的BHK21细胞，挑出蓝斑，进行稀释，再接种BHK21细胞，进行空斑纯化。
构建程序包括用PCR方法扩增出HSV核糖核苷还原酶基因rr的两个片段--480bp的A片段和388bp的B片段，作为同源重组臂。将两个同源重组臂分别插入pIRES-EGFP载体的EcoRI和XhoI位点，得到中间载体pAEB。将A-IRES-EGFP-B表达盒(2800bp)以SalI切下，插入温敏型质粒pSV1-RecA中，得到穿梭质粒pSV1-AEB。在第一次同源重组的过程中，pSV1-AEB与BAC-V1 DNA形成了共整合体。第二次同源重组的第一步，是在氯霉素抗性的平板上43℃培养，使共整合体解离，并逐渐丢失pSV1骨架。接着用四环素的反筛选剂镰胞菌酸筛选重组菌落，只有确实发生了共整合体解离并丢失了pSV1骨架的菌落被筛选出来。经过两次同源重组，得到含HSV-1基因组和rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr。
将含有lacZ表达盒的质粒载体pSV-β-Galactosidase用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因为lacZ中还含有另一个EcoRI位点)并回收含有SV40启动子的4160bp的完整lacZ表达盒，插入到同样用BamHI/EcoRI双酶切的转座载体pFastBac1中，构建成中间载体I pFL；将含有lacZ表达盒的载体pFL用BamHI/XhoI双酶切并回收完整的lacZ表达盒，插入到同样用BamHI/XhoI双酶切的质粒载体pBluescript-M13中，构建成中间载体II pBL；用NotI酶切p4789从icp34.5基因中切除从第262个密码子(262bp)到终止密码(1084bp)的823bp序列，但保留其左右侧翼序列。用NotI酶切pBL并回收完整的lacZ表达盒，将lacZ表达盒用T4DNA连接酶连接到用NotI酶切的p4789质粒载体中，构建成转移载体pIL。转移载体pIL与rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr共转染叙利亚仓鼠肾细胞系BHK21细胞，由于转移载体pIL被lacZ表达盒插入失活，使icp34.5基因被分开成左右侧翼序列，左翼650bp右翼1500bp与pHSV1-Δrr的icp34.5基因左右侧翼序列同源，经过同源重组，等位双交换，获得icp34.5基因被、lacZ表达盒插入失活、核糖核苷还原酶基因rr被EGFP基因插入失活的重组1型单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac，用病毒上清感染含Xgal软琼脂培养基的BHK21细胞，挑出蓝斑，进行有限稀释，再接种BHK21细胞，进一步空斑纯化。用PCR扩增icp34.5基因鉴定重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac，即以人工合成的DNA序列CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC和CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC作引物，进行PCR鉴别重组病毒含有被lacZ表达盒插入失活的icp34.5基因；用病毒感染细胞后基因表达的方法鉴定重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac，即以病毒感染细胞5天后绿色荧光蛋白的表达鉴定核糖核苷还原酶基因中被插入的EGFP基因。
本发明的用途是作为抗肿瘤候选药物，其靶向性强，安全性好。
本重组1型单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac与其它重组1型单纯疱疹病毒、野生型1型单纯疱疹病毒及其它抗肿瘤药物相比，具有如下特点1)HSV-1基因组较大(150kb)，一级结构已经清楚，大约70个基因可被代替而仍能在某些细胞中进行复制，因而插入外源基因的容量可高达30kb，为提高治癌效率，可分别插入各种细胞因子基因，突变型病毒容易包装[Roizman，1996]，是产品更新换代的基础。
2)HSV-1宿主范围较宽，包括分裂的和非分裂的细胞。可以说它可感染迄今研究过的所有类型的脊椎动物细胞[Fields，1990]。本发明构建的重组单纯疱疹病毒可望用于多种肿瘤的治疗(人肝癌、人膀胱癌、人神经胶质瘤、人喉癌)。
3)本发明中，icp34.5基因被NotI酶切缺失和lacZ表达盒插入双重灭活，核糖核苷还原酶基因rr被缺失和EGFP表达盒插入双重灭活，所以含有这种双基因双重灭活的重组1型单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac应该是一种非常稳定的突变型病毒，很难回复突变成野生型，保证了产品的安全性。
4)本发明的重组单纯疱疹病毒的核糖核苷还原酶基因rr和icp34.5基因被缺失插入失活。核糖核苷还原酶基因rr是核苷酸代谢必需的酶，肿瘤细胞的核苷酸代谢远较正常组织细胞旺盛，肿瘤细胞可以为病毒提供DNA复制所必须的这些酶，而正常细胞却不能(Mineta，1994)。icp34.5是HSV-1基因组中的凋亡抑制基因，也是一个重要的神经毒基因，icp34.5失活的HSV-1，不仅毒力大大下降，还可能使病毒获得利用肿瘤细胞中有缺陷的IFN-PKR信号传导途径的能力，选择性地在这一类细胞中增值(Farassati，2001)。
5)本发明的重组单纯疱疹病毒的icp34.5基因被lacZ插入失活，lacZ在SV40启动子驱动下高效表达，在X-Gal存在下，空斑成为兰色，因此，lacZ作为报道基因，可以监测、鉴定重组病毒，作为产品质量检测标准之一。
6)理论上和实验室研究已经证明，本发明构建的重组病毒能有效地靶向性杀死几种人癌细胞，不杀死人体正常细胞，具有安全性。
7)本发明构建的重组单纯疱疹病毒能像野生型HSV一样对抗疱疹病毒的有效药物阿昔洛韦敏感，为该重组病毒在人体内的应用提供保障。既是，倘若有个别病人因机体差异而出现病毒反应，则可以及时用阿昔洛韦进行治疗，绝对保障病人的安全。
8)实验研究已经证明，该重组单纯疱疹病毒用国家药典允许的Vero细胞生产，滴度较高，便于实现工业化生产。
9)HSV是嗜神经性病毒，icp34.5基因是其关键性基因和神经毒力基因[Thompson，1983]，缺失icp34.5基因的重组单纯疱疹病毒无神经毒性，对小鼠的半致死剂量下降10万倍，这是该重组单纯疱疹病毒特别适于脑癌治疗的分子基础。
图1重组1型单纯疱疹病毒的构建过程，A为含HSV-1基因组但rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr的构建，B为重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的构建。其中MCS多克隆位点；A，Brr基因左右臂片段；EGFP增强型绿色荧光蛋白基因；IRES内部核糖体进入位点；lacZβ-半乳糖苷酶基因；Ampr氨苄抗性基因；Tetr四环素抗性；PCMVCMV启动子；PPolh多角体基因启动子；SV40 promoterSV40启动子；SV40 polyASV40终止序列；T7 promoterT7启动子；T3 promoterT3启动子；p1，p2，p3，p4，p5，p6，p7，p8PCR扩增引物。
图2同源重组臂A、B的PCR鉴定图，其中1500bp DNA Ladder分子量参照，2A片段，3B片段，4λDNA HindIII/EcoRI分子量参照。A片段为480bp，B片段为388bp，说明同源重组臂A、B扩增成功。
图3重组质粒pAEB的PCR和酶切鉴定图，其中MλDNA HindIII/EcoRI分子量参照；1从pAEB中PCR扩增出的A片段；2EcoRI酶切pAEB产生的A片段；3从pAEB中PCR扩增出的B片段；4XhoI酶切pAEB产生的B片段；5EcoRI酶切pIRES-EGFP使其线型化；6pAEB的PCR，以引物p7、p8扩增EGFP片段；7pAEB的PCR，以引物p1、p6扩增出含A的大片段；8pAEB的PCR，以引物p4、p5扩增出含B的大片段。扩增片段A为480bp，B为388bp；EcoRI单酶切pAEB，释放出A 480bp和质粒5600bp两个片段，XhoI单酶切pAEB，释放出B390bp和质粒5700bp两个片段；p1和p6，p4和p5配对，扩增产物分别为900bp和780bp，p7、p8引物对则扩增出了710bp的EGFP片段。说明重组质粒pAEB构建成功。(引物扩增位点见图1A)图4构建穿梭质粒pSV1-AEB的各质粒酶切鉴定图，其中MλDNA HindIII/EcoRI分子量参照；1SalI酶切质粒pSV1-AEB，释放11kb和2.8kb的两个片段；2SalI酶切使质粒pSV1-RecA使其线性化，产生11kb片段；3SalI酶切质粒pAEB释放2.8kb、2.3kb和900bp三个片段，其中2.8kb片段为A-IRES-EGFP-B盒。说明穿梭质粒pSV1-AEB构建成功。
图5pHSV1-Δrr基因组的测序，A为以p1为引物测序的结果，B为以p4为引物测的结果。图A、B阴影部分为IRES-EGFP序列，其余为rr基因A片段和B片段序列。IRES-EGFP表达盒取代了HSV-1的核糖核苷还原酶大亚基基因的A、B片段间的区域。说明重组质粒pHSV1-Δrr基因组构建成功。
图6中间载体I pFL的结构和酶切鉴定图，其中图B的AλDNA/HindIII分子量参照；BNotI酶切；CEcoRI酶切；D.BamhI/HindIII酶切。NotI酶切使pFL线性化，产生8.9Kb片段；lacZ含有两个EcoRI位点，以EcoRI酶切释放3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切产生4.1Kb和4.7Kb两个片段。说明中间载体构建成功。
图7中间载体II pBL的结构和酶切鉴定图，其中图B的AλDNA/HindIII分子量参照；BBamHI酶切；CNot1酶切；DBamHI/HindIII酶切。用BamHI酶切使pBL线性化，产生约7.1Kb片段；Not1酶切产生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切后得到3.3Kb和3.7Kb的片段。说明中间载体构建成功。
图8转移载体pIL的结构和酶切鉴定图，其中图B的AλDNA/HindIII分子量参照；BPstI酶切；CXbaI酶切；DNotI酶切。PstI酶切使pIL线性化，得到9.4Kb片段；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb两个片段；NotI酶切产生4.1Kb和5.3Kb两个片段。说明转移载体构建成功。
图9 Xgal筛选重组单纯疱疹病毒，蓝斑(箭头)表示含有该重组病毒。
图10 PCR鉴定重组1型单纯疱疹病毒，ADNA分子量参照(1543、994、695、515、377bp)；B该重组病毒；C野生病毒。PCR引物为icp34.5基因的缺失区，约1.7Kb，野生病毒检测到了1.7Kb的缺失片段，而重组病毒的这一片段已被缺失，所以用PCR扩增不出。说明重组1型单纯疱疹病毒构建成功。
图11重组单纯疱疹病毒感染Vero细胞5天后绿色荧光蛋白的表达。
图12 rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV对阿昔洛韦(ACV)的敏感性， 代表wtHSV； 代表rHSVΔrr-34.5/lac。说明阿昔洛韦(ACV)对rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV是同样敏感。
图13 rHSVΔrr-34.5/lac在肿瘤细胞和正常细胞中的复制效率， 代表人神经胶质瘤U251细胞； 代表正常羊膜wish细胞。说明该重组病毒在U251细胞中能正常复制，最高病毒滴度在感染24小时，到72小时滴度逐渐缓慢下降，对正常wish细胞无毒害作用。
图14rHSVΔrr-34.5/lac对人神经胶质瘤U251细胞、人膀胱癌EJ细胞、人肝癌Hep3B细胞、人喉癌Hep2细胞、正常羊膜Wish细胞的杀伤效率， 代表正常羊膜wish细胞； 代表人肝癌Hep3B细胞； 代表人膀胱癌EJ细胞； 代表人神经胶质瘤U251细胞； 代表人喉癌Hep2细胞。说明该病毒对正常羊膜Wish细胞不感染，而对Hep3B细胞杀伤率最高，72小时达100％，以下依次为U251细胞、Hep2细胞和EJ细胞，对U251细胞和Hep2细胞的杀伤率到96小时也达100％。
图15荷人肝癌细胞Hep-3B的裸鼠模型。
图16 rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠肿瘤与对照组裸鼠肿瘤的对比，其中A未治疗对照组；B低剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组；C高剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组。说明高剂量治疗组和低剂量治疗组对人肝癌细胞有显著疗效，特别是高剂量治疗组有极显著疗效。
图17各组裸鼠的肿瘤大小随时间变化的趋势图，其中 代表高剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组； 代表中剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组； 代表低剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组； 代表未治疗组； 代表化疗药物治疗组。说明未治疗对照组裸鼠的肿瘤体积随时间延长而持续大幅增加；各治疗组裸鼠的肿瘤体积在治疗初期上升幅度较大，但在治疗中、后期，治疗裸鼠的肿瘤体积上升幅度明显减小，最终各治疗组裸鼠肿瘤体积远远小于未治疗对照组；化疗药物对照组裸鼠的肿瘤体积也是一直持续增加，但上升幅度小于未治疗对照组，最终治疗效果不及高，中剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组。
图18治疗后的裸鼠肿瘤图片。各治疗组裸鼠肿瘤体积远远小于未治疗对照组，高剂量治疗组则有极显著疗效。
图19治疗裸鼠各器官的聚合酶基因RT-PCR电泳检测，仅在肿瘤块中检测到rHSVΔrr-34.5/lac的聚合酶基因，其他器官中均检测不到。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而不感染裸鼠的任何细胞、组织和器官。
图20治疗裸鼠各器官的tk基因RT-PCR电泳检测，仅在肿瘤块中检测到rHSVΔrr-34.5/lac的tk基因，其他器官中均检测不到。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而不感染裸鼠的任何细胞、组织和器官。
图21 rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠各脏器病理切片(放大倍数20×3.3)。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对正常组织无害。
图22未治疗组裸鼠各脏器病理切片(放大倍数20×3.3)。以此与图21的对比，同样说明重组病毒对正常组织无害。
图23治疗组裸鼠的脑组织电镜照片(放大倍数40000)和肿瘤组织电镜照片(放大倍数15000)。在肿瘤组织中可见rHSVΔrr-34.5/lac颗粒(箭头所示)，而在脑组织未见到，说明rHSVΔrr-34.5/lac只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对脑组织无害。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中具体实验条件和方法，通常按照常规条件并参考下列资料进行如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，“分子克隆实验指南”(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，“细胞实验指南”；E.哈洛等，科学出版社，2002，“抗体技术实验指南”等所述的方法，或接照制造厂商操作指南所建议的方法。
实施例1重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的构建和获得质粒载体pSV-β-Galactosidase购自promega公司，转座载体pFastBac1购自Gibco公司。载体pSV-β-Galactosidase上含有lacZ表达盒，SV40启动子控制其表达。质粒载体pBluescript-M13购自Stratagene公司。质粒p4789由芝加哥大学Roizman B教授公开(Lagunoff，M.，and B.Roizman.1994.Expression of a herpes simplex virus1 open reading frame antisense to the γ134.5 gene and transcribed by an RNA 3′coterminal with the unspliced latency-associated transcript.J.Virol.686021-6028)，上面含有完整HSVicp34.5基因及其侧翼序列。质粒pIRES-EGFP购自Clonetech公司，这个质粒上含有一个增强型绿色荧光蛋白标记。质粒pSV1-RecA由Rockfeller University的Yang和Heintz教授公开(Yang，X.W.，Model，P.，Heintz，N..1997.Homologous recombination based modification in Escherichia coli andgermline transmission intransgenic mice of a bacterial artiEcial chromosome Nat.Biotechnol.15859-865)。整合了HSV全基因组的细菌人工染色体BAC-V1由加拿大University of Western Ontario的Strathdee CA教授公开(Strathdee CA.1999.Transposing BACs to the future.Nat Biotechnol.Apr；17(4)332-3)，BAC-V1在HSV-1的非必须基因UL41(编码vhs蛋白，功能是促进蛋白成熟)处插入了BAC的各个元件原核复制起点，氯霉素抗性基因。叙利亚仓鼠肾细胞系BHK21细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC010)。引物p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8由上海生工(SANGON)公司合成。本实施例实验条件和方法，参考了下列资料“分子克隆实验指南”(第二版)；“细胞实验指南”。
rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr的构建重组质粒pAEB的构建细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes，BAC)BAC-V1整合了HSV-1的全基因组，只在非必须基因UL41(编码vhs蛋白)处插入了BAC的各个元件(原核复制起点，氯霉素抗性基因)。以HSV-1的细菌人工染色体BAC-V1 DNA为模板用PCR技术分别扩增HSV-1的核糖核苷还原酶大亚基基因(3410bp)的A(480bp，140-620nt)、B(388bp，1717-2105nt)两个片段(图2)，A的上下游引物中含EcoRI酶切位点，B的上下游引物中含XhoI酶切位点。A上游引物p15′-cag gaa ttc aat ggc gtg atg gtg ctt t(140-160nt)，A下游引物p25′-tct gaa ttc gtg tcc tcc gag tca tcc(620-590nt)(gaattc为EcoRI酶切位点)；B上游引物p35′-tttt ctc gag ctg aac ctg ggg accggc aac(1717-1738nt)，B下游引物p45′-tttt ctc gag gtc cag gtg gcgaat cag gc(2105-2085nt)(ctc gag为XhoI酶切位点)。PCR条件预变性95℃，5min；25个循环94℃，1min，60℃，1min，72℃，1min；延伸72℃，10min。回收PCR产物，分别以EcoRI和XhoI单酶切，并克隆到质粒pIRES-EGFP(IRES为内部核糖体进入位点，EGFP为增强型绿色荧光蛋白基因)的同样酶切位点，因为pIRES-EGFP的IRES上游362bp含有一个EcoRI酶切位点，EGFP下游288bp含有一个XhoI酶切位点。在pIRES-EGFP的EGFP盒的上下游设计引物p55′-atg ctc gac ctg cag ttg g(1275-1256nt)，p65′-gtc ctg ctg gag ttcgtg ac(2560-2580nt)。p1和p6、p4和p5配对，以PCR扩增鉴定插入方向，A和B正向插入扩增的产物分别为900bp和780bp，重组质粒命名为pAEB(图3)。穿梭质粒pSV1-AEB的构建质粒pSV1-RecA的RecA基因上游含有一个SalI酶切位点；重组质粒pAEB的A片段上游7bp含有一个SalI酶切位点，B片段下游65bp含有一个SalI酶切位点。用SalI酶切质粒pSV1-RecA 4小时后，牛肠去磷酸化酶(CIAP)处理0.5小时，纯化回收；同时用SalI酶切质粒pAEB，切下含有A-IRES-EGFP-B的2800bp的片段，纯化回收，并与上述SalI酶切的质粒pSV1-RecA连接，转化大肠杆菌DH5α后，涂于含10μg/ml四环素的LB平板上，30℃培养过夜，挑选克隆。以质粒pIRES-EGFP的EGFP表达盒设计引物p75’-atg gtgagc aag ggc gag(1905nt-1923nt)，p85’-gaa cat gtc gag cag gtac(2601nt-2622nt)。以p7和p8为引物，PCR鉴定阳性克隆，鉴定正确的质粒命名为pSV1-AEB(图4)。
RecA依赖的共整和体的形成取5μl质粒pSV1-AEB电转化200μl含HSV-BAC DNA的大肠杆菌DH10B感受态细胞，铺在含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB平板上，30℃培养过夜。用无菌牙签随机挑取8～10个菌落至1ml LB中漂洗，分别取100μl漂洗液再次接种在两个含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB平板上，分别于43℃和30℃过夜培养。对照30℃培养的平板上，长满菌层，而43℃培养的平板上，只有少数菌落，周围有散在的卫星菌落，挑选20个这种菌落，在含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB平板上划线，43℃培养过夜，使质粒pSV1-AEB的DNA和BAC-V1 DNA通过A、B臂在HSV-1的rr基因处同源重组形成共整和体菌落。随机挑取10个菌落接种于5ml含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB培养液中，43℃振荡培养过夜，提取BAC DNA，以p7、p8为引物进行PCR鉴定。这个共整合体含有pSV1-AEB的四环素抗性基因(Tet+)和BAC-V1的氯霉素抗性基因(Ch1+)，因此是双抗性的。那些仅带有单抗性的未转化克隆在双抗性的平板上不会生长。由于pSV1-AEB使用的是温敏型启动子，43℃培养会使那些单独存在的pSV1-AEB无法复制，并进一步丢失。只有那些形成共整合体，既能够利用BAC DNA上的普通复制起始子又同时具有双抗性的菌落才能在这种条件下生长。
rr基因失活重组质粒pHSV1-Δrr的获得将上述PCR鉴定的由pSV1-AEB和BAC-V1 DNA形成的共整和体菌液在含氯霉素(12.5mg/L)的LB平板中划线，43℃培养过夜，诱导同源重组的发生和共整和体的解离，在这一过程中，细菌会丢失温敏性质粒pSV1，同时也失去四环素抗性基因，由于失去了四环素的压力作用，共整合体解离，而43℃培养又使温敏的pSV1骨架无法复制，逐渐丢失。从平板中挑选8-16个单克隆，在镰孢菌酸(3mg/L)+氯霉素(1.25mg/L)TB平板上划线，37℃培养2～3天。设两组对照，一个在含氯霉素(12.5mg/L)和四环素(10mg/L)的LB平板划线，另一个在12.5μg/ml氯霉素的LB平板上划线；四环素+氯霉素平板上的克隆应该不生长，镰孢菌酸+氯霉素平板中的菌落数应少于氯霉素平板。在镰孢菌酸+氯霉素平板中生长的这些菌落就是重组菌落。在这一过程中，只有那些确实发生了共整合体解离并丢失了pSV1骨架的菌落被筛选出来。挑取10个菌落接种于5ml含12.5mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；提取BAC DNA，分别以p1、p4为引物测序，进行序列分析(图5)。鉴定正确的质粒命名为pHSV1-Δrr(核糖核苷还原酶大亚基基因620-1717nt共1097bp缺失，其中插入了IRES-EGFP表达盒)。
重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的构建中间载体I pFL的构建从含有lacZ表达盒的载体pSV-β-Galactosidase上用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因lacZ中还含有一个EcoRI位点)并回收完整的带SV40启动子的lacZ表达盒(4160bp)，插入到同样用BamHI/EcoRI双酶切的转座载体pFastBac1(多克隆位点中含有EcoRI和BamHI位点)中。取质粒DNA1-5μl加入到50μl的大肠杆菌TG1感受态细胞中进行热休克转化，转化时提前1h将Xgal涂在含Amp的LB平皿上，37℃过夜培养，根据蓝色菌落挑选出转座载体pFL，以NotI、EcoRI、BamHI/HindIII酶切pFL来鉴定阳性克隆(图6)。NotI酶切使pFL线性化，产生8.9Kb片段；lacZ含有两个EcoRI位点，以EcoRI酶切释放3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切产生4.1Kb和4.7Kb两个片段。
说明中间载体I构建成功。
中间载体IIpBL的构建从含有lacZ表达盒的中间载体I pFL上用BamHI/XhoI双酶切，并回收完整的带SV40启动子的lacZ表达盒，插入到同样用BamHI/XhoI双酶切的质粒载体pBluescript-M13中，构建中间载体II pBL。取质粒DNA1-5μl加入到50μl的大肠杆菌TG1感受态细胞中进行热休克转化，转化时提前1h将Xgal涂在含Amp的LB平皿上，37℃过夜培养，根据蓝色菌落挑选出转座载体，以BamHI、NotI、BamHI/HindIII酶切pBL来鉴定(图7)。BamHI酶切使pBL线性化，产生约7.1Kb片段；Not1酶切产生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切后得到3.3Kb和3.7Kb的片段。说明中间载体II构建成功。
转移载体pIL的构建用Not1酶切p4789以除去icp34.5基因从第262个密码子到终止密码子1084bp的长823bp序列，但保留其左右侧翼序列650bp和1500bp；pBL同时也用NotI酶切，并回收完整的带SV40启动子的lacZ表达盒，将lacZ表达盒连接到用Not1酶切的p4789中，构建转移载体pIL。取质粒DNA1-5μl加入到50μl的大肠杆菌TG1感受态细胞中进行热休克转化，转化时提前1h将Xgal涂在含Amp的LB平皿上，37℃过夜培养，根据蓝色菌落挑选出转座载体，用PstI、XbaI、NotI酶切鉴定(图8)。PstI酶切pIL得到9.4Kb；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb两个片段；NotI酶切产生4.1Kb和5.3Kb两个片段。说明转移载体构建成功。
重组病毒的获得转移载体pIL与含有完整HSV-1基因组但rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr共转染BHK21细胞取两个预先加入200μL 1640培养基(未加血清)的EP管，一个加20μg pIL和20μg pHSV1-Δrr DNA，混匀；另一个加8μL Lipofectin转染试剂，混匀。将两管合并混匀，静置45min，使Lipofectin包裹DNA。临用前补加无血清培养液1640，以使转染混合液能均匀覆盖细胞层。取70-80％丰度的单层BHK21细胞1瓶，弃培养液。用未加血清的培养液清洗瓶壁数次，然后加转染混合液。37℃温育6h后弃转染混合液，换常规1640培养基，37℃培养。由于转移载体pIL上插入了lacZ表达盒，icp34.5基因失活，但保留有icp34.5基因的左右侧翼序列，它们与pHSV1-Δrr的icp34.5基因左右侧翼序列同源；经过同源重组，获得icp34.5基因被lacZ表达盒插入失活、核糖核苷还原酶基因被EGFP基因插入失活的重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δrr-34.5/lac；用病毒上清0.2ml感染含Xgal软琼脂培养基的BHK21细胞，37℃培养36-42小时，挑出蓝斑(图9)，进行有限稀释，再用0.2ml接种细胞，进一步进行空斑纯化。
实施例2重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的鉴定供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac以及由Rayfield M等公开的HSV-1 F株(Rayfield M.，Michaels G.S.，Feldmann R.，Muzyczka N.1985.Comparisonof the DNA sequence and secondary structure of the herpes simplex virus L/Sjurction and the adeno-associated virus terminal repeat.J Theor Biol.115477-494.)。icp34.5基因引物由上海生工(SANGON)公司合成。非洲绿猴肾Vero细胞系购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC029)。本实施例实验条件和方法，参考了下列资料“分子克隆实验指南”(第二版)；“细胞实验指南”。
正向引物5’-CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC-3’反向引物5’-CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC-3’用PCR技术扩增icp34.5基因进行鉴定。反应体系10×buffer 5μL，dNTP(2.5mM)5μL，正向引物(10pmol/ul)2.5μL，反向引物(10pmol/ul)2.5μL，HSV DNA 5μL，MgCl2(25mM)5μL，ddH2O 25μL，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5μL。扩增条件94℃，90秒；56℃，90秒；72℃，120秒；循环35次。预变性5分钟(94℃)，终延伸10分钟(72℃)。结果证明重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac缺失了野生病毒wtHSV中的icp34.5基因(图10)。
用DMEM培养液在35mm培养板上培养Vero细胞，待Vero细胞长成单层后，弃去DMEM培养液，用PBS洗细胞表面，接种该重组病毒0.2ml，37℃吸附1-2小时，弃去上清，加入2％小牛血清的培养基，37℃培养5天，在倒置荧光显微镜下观察，出现了发绿色荧光的细胞(图11)。结果证明重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac成功地插入了EGFP基因。
实施例3重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的扩增供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac。非洲绿猴肾Vero细胞系购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC029)。本实施例实验条件和方法，参考了下列资料“细胞实验指南”。
用DMEM培养液在35mm培养板上培养Vero细胞，待Vero细胞长成单层后，弃去DMEM培养液，用PBS洗细胞表面，接种该重组病毒0.2ml，37℃吸附1-2小时，弃去上清，同时设一瓶不加病毒的细胞作对照；加入2％小牛血清的培养基，37℃培养；80％的细胞出现病变后，反复冻融三次，收获病毒；在4℃以8000rpm离心30分钟，收集上清，置于4℃短期保存；若需要长期保存，则加入10％甘油，置于-80℃。
实施例4重组单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac的安全性供试病毒为实施例1构建的重组病毒，以及由Rayfield M等公开的HSV-1 F株(Rayfield M.，Michaels G.S.，Feldmann R.，Muzyczka N.1985.Comparison of the DNAsequence and secondary structure of the herpes simplex virus L/S junction andthe adeno-associated virus terminal repeat.J Theor Biol.115477-494.)。人神经胶质瘤U251细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC093)。人羊膜wish细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC040)。抗疱疹药物阿昔洛韦(ACV)购自药店。本实施例实验条件和方法，参考了下列资料“分子克隆实验指南”(第二版)；“细胞实验指南”。
选择对单纯疱疹病毒敏感的昆明种小鼠作受试对象，比较了rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV的半数致死剂量(LD50)。实验第21天的死亡情况及两种病毒的LD50见表1。结果表明icp34.5基因的缺失大大地降低了HSV的毒性，rHSVΔrr-34.5/lac的LD50为wtHSV的10万倍，即毒力降低10万倍，说明rHSVΔrr-34.5/lac有较好的安全性。
抗疱疹药物阿昔洛韦(ACV)是毒性极低的药物前体，HSV tK基因表达产物TK(胸苷激酶)使ACV磷酸化并激活成为细胞毒性药物而杀死细胞。虽然缺失icp34.5基因和核糖核苷还原酶基因，但HSV的tK基因完整，能有效表达TK酶蛋白，以活化抗疱疹药物ACV，发挥杀细胞作用；由于rHSVΔrr-34.5/lac感染复制是靶向性的，所以正常细胞中没有rHSVΔrr-34.5/lac增殖，即没有tk基因的表达，ACV不会被激活，所以正常细胞既不会由于rHSVΔrr-34.5/lac杀死，也不会被活化的ACV毒杀；而对容许rHSVΔrr-34.5/lac增殖的恶性肿瘤细胞来说，不仅会因rHSVΔrr-34.5/lac增殖而被有效裂解杀死，而且由于rHSVΔrr-34.5/lac有效增殖而使tk基因有效表达，产生TK酶蛋白，激活ACV前体成细胞毒性药物，与rHSVΔrr-34.5/lac增殖裂解杀癌细胞协同，杀死癌细胞。所以，当用ACV后，只要有rHSVΔrr-34.5/lac基因表达，ACV便被激活，rHSVΔrr-34.5/lac感染的细胞便被杀死，rHSVΔrr-34.5/lac也就失去了增殖的条件，导致rHSVΔrr-34.5/lac被机体的正常免疫系统清除，毒性消除；若没有应用ACV，rHSVΔrr-34.5/lac便会无限制地增殖并裂解肿瘤细胞，同时释放子代rHSVΔrr-34.5/lac，子代rHSVΔrr-34.5/lac再感染、裂解新的肿瘤细胞，如此循环，以至所有肿瘤细胞彻底消灭；所有肿瘤细胞彻底消灭了，子代rHSVΔrr-34.5/lac也就失去了繁衍下一代rHSVΔrr-34.5/lac的场所，也就被机体的免疫系统作为异物排斥和吞噬细胞清除。
实验证明用对rHSVΔrr-34.5/lac敏感的神经胶质瘤U251细胞接种重组型和野生型病毒，换用含不同浓度(0、0.5、0.7、1.0、1.5ug/ml)ACV的培养基培养。计算两种病毒对ACV的半耐受浓度EC50，比较其敏感性，结果表明rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV一样，对抗疱疹药物ACV敏感(见图12)。所以在用rHSVΔrr-34.5/lac治疗肿瘤的过程中，可用阿昔洛韦(ACV)对万一出现的重组病毒的副作用进行有效控制。
表1.wtHSV和rHSVΔrr-34.5/lac半数致死剂量(LD50)
注ND为没有进行实验实施例5重组单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac对人神经胶质瘤、人膀胱癌、人肝癌、人喉癌的杀瘤测定供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac以及由Rayfield M等公开的HSV-1 F株(Rayfield M.，Michaels G.S.，Feldmann R.，Muzyczka N.1985.Comparison ofthe DNA sequence and secondary structure of the herpes simplex virus L/S junctionand the adeno-associated virus terminal repeat.J Theor Biol.115477-494.)。人神经胶质瘤U251细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC093)。人膀胱癌EJ细胞细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC120)。人肝癌Hep3B细胞细胞细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC070)。人喉癌Hep2细胞细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC004)。人羊膜wish细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC040)。本实施例实验条件和方法，参考了下列资料“分子克隆实验指南”(第二版)；“细胞实验指南”。
以人神经胶质瘤U251细胞为肿瘤细胞的代表，以正常羊膜wish细胞为对照，比较重组单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac在肿瘤细胞和正常细胞中的复制效率，结果见图13。可以看出rHSVΔrr-34.5/lac选择性地在人神经胶质瘤U251细胞中复制；而对正常细胞基本上不复制，表明病毒感染正常细胞后诱发其凋亡，病毒不能复制，随后自然降解。
用MTT法定量测定重组单纯疱疹病毒对人神经胶质瘤U251细胞、人膀胱癌EJ细胞、人肝癌Hep3B细胞、人喉癌Hep2细胞的杀伤效率。结果见图14。试验结果表明，U251、EJ、Hep3B、Hep2五种人肿瘤细胞对rHSVΔrr-34.5/lac敏感，但这些敏感细胞的增值动力曲线各异。在这些敏感细胞中，Hep3B细胞对rHSVΔrr-34.5/lac感染反应最为迅速，U251和Hep2细胞次之，EJ细胞也比较敏感，正常人羊膜wish细胞对rHSVΔrr-34.5/lac感染不敏感，感染后基本无细胞病变，亦无细胞死亡。本实验结果引申出一个重要结论任何药物都不是万能的，预计本重组病毒适用于肝癌和脑癌的治疗，对一些癌症如肺部癌症可能无效。
实施例6荷人肝癌Hep-3B裸鼠模型的建立人肝癌Hep-3B细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，细胞号GDC070)，并经体外培养实验证明rHSVΔrr-34.5/lac能在Hep-3B细胞上复制增殖，产生细胞病变效应(CPE)；用MTT技术证实了rHSVΔrr-34.5/lac对Hep-3B细胞的毒杀作用。本实施例实验条件和方法，参考了下列资料“细胞实验指南”。
实验裸鼠由湖北省实验动物研究中心提供并负责全程管理和饲养。
大量培养Hep-3B细胞，待细胞形成致密单层时，消化收集细胞在无菌离心管中，1000rpm，离心5min；收集细胞沉淀，加入10ml新鲜MEM培养基重悬细胞沉淀；取100μl细胞悬液稀释，混匀后滴加在细胞计数板上计数细胞；1000rpm，5min，离心沉淀细胞；加入新鲜MEM培养基重悬细胞沉淀，使终剂量为5×108cells/ml。
将1ml Hep-3B细胞浓缩液用无菌注射器注射到5只裸鼠的腋下(0.2ml/只)，一星期后，裸鼠注射部位长出绿豆大小瘤状突起；30天后，瘤状突起物增大；处死荷瘤裸鼠，切下瘤状物，并用解剖刀完全切碎，然后用套筒针管将切碎的瘤状物全部等量移植到另外的5只健康裸鼠腋下。30天后，移植的裸鼠腋下均出现直径约0.8cm的瘤状物；处死其中1只移植裸鼠，取瘤状物作病理检查和作原代细胞培养，证实瘤状物为Hep-3B肿瘤块。另4只实验裸鼠20天后，待移植肿瘤生长至直径3.5cm左右；处死之，切下肿瘤，并捣碎成米粒大小，用套筒针管第二次移植至180只裸鼠腋下；15天后，80％的移植裸鼠出现移植肿瘤，直径在0.5cm-1.5cm之间(图15)；选取125只作rHSVΔrr-34.5/lac治疗实验。
实施例7重组单纯疱疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac作为抗肿瘤药物在治疗或预防荷人肝癌Hep-3B裸鼠中的应用供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac，供试裸鼠为实施例6建立的荷人肝癌Hep-3b裸鼠模型。TRIzol试剂购自Invitrogen公司。PCR引物在基康生物公司合成，扩增单纯疱疹病毒DNA多聚酶基因Pol(215bp)的正向引物为GCT CGA GTGCGA AAA AAC GTT C，反向引物为CGG GGC GCT CGG CTA AC；扩增单纯疱疹病毒tk基因(335bp)的正向引物为GAC CAG CGC CCA GAT AAC AA，反向引物为CCA GCA TAG CCAGGT CAA GC。PCR反应体系95℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 30sec共30个循环进行扩增。血液学指标用日本东亚医用电子公司生产的F-820型血球计数仪测定；血液生化指标用德国产Eppendorf FG124型半自动生化分析仪测定，试剂盒由北京中生生物制品有限公司提供。本实施例中的实验条件和方法参考了下列资料“分子克隆实验指南”(第二版)；“细胞实验指南”；“抗体技术实验指南”。
将选取的125只裸鼠按肿瘤大小分组，保证每组裸鼠的平均肿瘤大小基本一致，一共分为5个组rHSVΔrr-34.5/lac高剂量(5×106pfu/mL)治疗组，rHSVΔrr-34.5/lac中剂量(5×105pfu/mL)治疗组，rHSVΔrr-34.5/lac低剂量(5×104pfu/mL)治疗组，未治疗对照组(注射不含rHSVΔrr-34.5/lac的Vero细胞悬液)，化疗药物阿霉素ADM对照组(3.333mg ADM/ml)。分组后当天，按上述分组施以不同的处理；瘤内注射0.1ml/次/鼠试剂，病毒组每周注射一次，共3次，ADM对照组每间隔三周作一次注射。
治疗期间，观察受试动物生活状态，记录裸鼠死亡数，隔天测量裸鼠肿瘤大小及体重，绘制裸鼠肿瘤体积/时间变化曲线。在第三次瘤内注射治疗后一个星期开始分三批(每周一批)处死裸鼠；眼球取血，做血常规以及血液生化检查；取全部肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾和大脑，分别测量重量、用RT-PCR技术检测重组病毒的mRNA和组织病理学检测等。
部分解剖后的rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠肿瘤与未治疗对照组裸鼠肿瘤照相，结果见图16。结果表明，未治疗对照组裸鼠的瘤块体积大、颜色鲜艳、血管丰富；高剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠的瘤块体积最小，血管不丰富；低剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠瘤块体积比未治疗对照组要小，且肿瘤块血管没有增生。
各组裸鼠的肿瘤大小随时间变化的趋势如图17。结果表明，未治疗对照组裸鼠的肿瘤体积随时间延长而持续大幅增加，且在治疗期间呈加速上升趋势，肿瘤体积由最初的30mm3增大接近20倍至最终的557mm3；rHSVΔrr-34.5/lac各治疗组裸鼠的肿瘤体积在治疗初期上升幅度较大，但仍远远低于未治疗对照组的上升幅度，且在治疗中、后期，治疗裸鼠的肿瘤体积上升幅度明显减小，最终各rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠肿瘤体积远远小于未治疗对照组；化疗药物阿霉素对照组裸鼠的肿瘤体积也是一直持续增加，但上升幅度小于未治疗对照组，最终治疗效果不及高、中剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组，只是略优于低剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组。各组肿瘤大小变化趋势说明，在治疗初期，rHSVΔrr-34.5/lac增殖尚不占优势，癌细胞增加数目大于rHSVΔrr-34.5/lac杀死癌细胞数目，所以肿瘤体积仍在增大；随着rHSVΔrr-34.5/lac在肿瘤细胞中复制直至rHSVΔrr-34.5/lac趋于对数增殖，在治疗的中、后期，rHSVΔrr-34.5/lac杀死癌细胞数大于癌细胞自身增殖数，以至肿瘤平均体积迅速减小、乃至消失(图18)。
rHSVΔrr-34.5/lac对荷人肝癌Hep-3B裸鼠的治疗效果见表2。rHSVΔrr-34.5/lac对在体Hep-3B肿瘤有非常显著的抑制作用；rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠生活状态正常，高、中、低剂量治疗组裸鼠均没有因rHSVΔrr-34.5/lac副作用引起死亡。未治疗对照组因没有得到治疗，有将近30％的裸鼠死于快速生长的肿瘤；而其余的裸鼠肿瘤体积增长得很大，并且生活状态极差。化疗药物对照组裸鼠经ADM治疗后肿瘤体积和重量有所减少，但是有明显的副作用，裸鼠生活状态不好，死亡率达15％。rHSVΔrr-34.5/lac显示了极好的抗癌效果和安全性。
表2.rHSVΔrr-34.5/lac对荷Hep-3B裸鼠治疗效果一览表
用RT-PCR技术鉴定rHSVΔrr-34.5/lac在组织内的分布。迅速解剖各组实验裸鼠，收集肿瘤、心、肝、脾、肺、肾和大脑等组织，立刻将其置于-20℃保存。取材结束后，立即分别用TRIzol提取肿瘤和各脏器细胞的总RNA。分别以单纯疱疹病毒多聚酶基因(215bp)和tk基因(335bp)引物对提取的裸鼠各组织总RNA进行RT-PCR。结果见图19、20。实验结果显示，rHSVΔrr-34.5/lac基因转录仅见之于治疗组裸鼠的肿瘤组织中，而两个对照(未治疗对照组和ADM对照组)裸鼠肿瘤组织和所有实验动物的心、肝、脾、肺、肾和脑组织都没有扩增出相应该基因序列条带，从而证明了rHSVΔrr-34.5/lac只在治疗组裸鼠的肿瘤组织中复制。这就说明了rHSVΔrr-34.5/lac不感染实验动物正常组织和细胞，即对实验动物正常组织无害，rHSVΔrr-34.5/lac具有极好的靶向性抗癌效果。
试验在中期和结束时分别对受试动物进行了血液学和血液生化学指标检测分析。血液学分析共有白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白剂量(MCHC)、血小板计数(PLT)、红细胞体积分布宽度变异数(RDW-CV)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板平均体积(MPV)等11项指标；血液生化分析共有尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、三酸甘油脂(TRI)、胆固醇(CHO)、总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(GOT)、谷草转氨酶(GPT)、肌酐(CRE)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBI)等10项指标。计算了各试验组裸鼠的血液学和血液生化检测均值和标准差，并进行了显著性检验(见表3、4)。
结果(表3)表明rHSVΔrr-34.5/lac各治疗组与未治疗对照组比较，11项血液学指标均无显著性差异(P＞0.05)；而ADM药物对照组与未治疗对照组比较，白细胞计数(WBC)显著减少(P＜0.05)，此外，其它10项血液学指标均无显著性差异(P＞0.05)。
结果(表4)表明rHSVΔrr-34.5/lac各治疗组与未治疗对照组比较，10项生化指标均无显著性差异(P＞0.05)。从而可以得出结论rHSVΔrr-34.5/lac对受试动物的肝功能、肾功能、酶类、以及血脂等项目均无不良影响；而化疗药物阿霉素对照组与未治疗对照组比较，总胆蛋白(TBI)指标比未治疗对照组指标显著增高(P＜0.05)，表明对肝功能有毒副作用，而rHSVΔrr-34.5/lac治疗不产生毒副作用。
表3.血液学指标检测结果
表4.血液生化指标检测结果
系统临床病检在实验裸鼠处死后立即进行。先观察各组实验裸鼠的胸腔、腹腔、颅腔及各脏器的位置、形状、大小、质地、色泽等情况，均未发现异常；再对心、肝、脾、肺、肾、脑等器官和肿瘤称重并计算脏器和肿瘤系数，对各给药组与未治疗对照组间进行显著性检验(t检验)，结果见表5。研究结果表明，rHSVΔrr-34.5/lac各治疗组与未治疗对照组比较，各脏器重量及脏器系数均无显著性差异(P＞0.05)，定量的说明了rHSVΔrr-34.5/lac对治疗裸鼠各正常脏器无任何影响和副作用；而rHSVΔrr-34.5/lac各治疗组与未治疗对照组比较，肿瘤显著缩小，rHSVΔrr-34.5/lac各治疗组与未治疗对照组之间肿瘤重量和肿瘤系数均有显著性差异(P＜0.05)，其中高、中剂量rHSVΔrr-34.5/lac治疗组之间有极显著性差异(P＜0.01)，反映了rHSVΔrr-34.5/lac对荷Hep-3B裸鼠肿瘤存在极有效的抑制作用。
表5.系统临床病检结果
对实验各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑进行病理切片检查，结果见图21、22。结果表明rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠与未治疗对照组裸鼠的各脏器均正常，说明rHSVΔrr-34.5/lac不影响受试裸鼠的正常组织。
对实验组裸鼠的脑和肿瘤组织进行电镜观察，结果见图23。结果表明在rHSVΔrr-34.5/lac治疗组裸鼠的脑组织中检测不到rHSVΔrr-34.5/lac，而在肿瘤组织中清晰可见rHSVΔrr-34.5/lac颗粒。
权利要求
1.一种重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于重组1型单纯疱疹病毒(SimplexvirusHerps simplexvirus 1)rHSVΔrr-34.5/lac，CCTCC-V200601。
2.一种用于实现权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，包括下列步骤A.重组质粒pHSV1-Δrr的构建首先是重组质粒pAEB的构建，细菌人工染色体BAC-V1整合了HSV-1的全基因组，只在非必须基因UL41处插入了BAC的各个元件，以HSV-1的细菌人工染色体BAC-V1 DNA为模板用PCR分别扩增HSV-1的核糖核苷还原酶大亚基基因3410bp的长480bp的A片段，位于140-620nt，和长388bp的B片段，位于1717-2105nt，A的上下游引物中含EcoRI酶切位点，B的上下游引物中含XhoI酶切位点，回收PCR产物，分别以EcoRI和XhoI单酶切，并克隆到质粒pIRES-EGFP的同样酶切位点，pIRES-EGFP的IRES上游362bp含有一个BcoRI酶切位点，EGFP下游288bp含有一个XhoI酶切位点，得到重组质粒pAEB，其中A，B片段作为同源重组的两个臂使用；其次是穿梭质粒pSV1-AEB的构建，质粒pSV1-RecA的RecA基因上游含有一个SalI酶切位点，重组质粒pAEB的A片段上游7bp含有一个SalI酶切位点，B片段下游65bp含有一个SalI酶切位点，用SalI酶切质粒pSV1-RecA 4小时后，牛肠去磷酸化酶处理0.5小时，纯化回收，同时用SalI酶切质粒pAEB，切下含有A-IRES-EGFP-B的3500bp的片段，纯化回收，并与SalI酶切的线型质粒pSV1-RecA连接构建质粒pSV1-AEB；第三是RecA依赖的共整和体的形成，将质粒pSV1-AEB电转化含HSV-1细菌人工染色体BAC-V1DNA的大肠杆菌DH10B，铺在含氯霉素12.5mg/L和四环素10mg/L的LB平板上，30℃培养过夜，用无菌牙签随机挑取菌落至LB中漂洗，漂洗液再次接种在含氯霉素12.5mg/L和四环素10mg/L的LB平板上，在43℃过夜培养，使质粒pSV1-AEB的DNA和BAC-V1 DNA通过A、B臂在HSV-1的rr基因处同源重组形成共整和体菌落；第四是rr基因失活重组质粒pHSV1-Δrr的获得，将上述由pSV1-AEB和BAC-V1DNA的共整和体菌落在含氯霉素12.5mg/L的LB平板中划线，43℃培养过夜，诱导同源重组的发生和共整和体的解离，接着用四环素的反筛选剂镰胞菌酸筛选重组菌落，得到含HSV-1基因组的rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr；B.重组病毒rHSVΔrr-34.5/lac的构建首先是β-半乳糖苷酶表达盒的获得与纯化，猴病毒SV40启动子控制着载体pSV-β-Galactosidase上的lacZ基因的表达，pSV-β-Galactosidase的lacZ基因3′端含有1个PolyA序列，位于4021bp-4156bp，SV40启动子上游6814bp处和lacZ编码序列的近3′末端3701bp处各含有1个EcoRI位点，lacZ表达盒下游4151bp处则含有1个BamHI位点，用BamHI和EcoRI双酶消化，DE81膜回收片段，获得LacZ表达盒4160bp；其次是中间载体I pFL的构建，载体pFastBacl多克隆位点中含有EcoRI和BamHI位点，用EcoRI/BamHI双酶切消化，与EcoRI和BamHI双酶消化的lacZ表达盒连接，构建中间载体I pFL，中间载体I pFL的lacZ表达盒上游具有载体自身的1个Not1位点；第三是中间载体II pBL的构建，BamHI/XhoI双酶切中间载体I pFL以切下lacZ表达盒，同时以BamHI/XhoI双酶切质粒pBluescript-M13成线型DNA，将lacZ表达盒与线型pBluescript-M13连接，构建成中间载体II pBL，使lacZ表达盒下游也获得载体本身的1个NotI位点，lacZ表达盒上下游均带有NotI位点；第四是转移载体pIL的构建，质粒p4789带有完整的HSV-1的icp34.5基因及其侧翼序列，用NotI酶切质粒p4789，以切去icp34.5基因262bp到终止子1084bp的长823bp序列，同时再以NotI酶切中间载体II pBL，获得lacZ表达盒，并连接到经NotI酶切的质粒p4789上，构建转移载体pIL，该转移载体pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp并被lacZ表达盒插入双重灭活；第五是重组病毒的获得，转移载体pIL与步骤A中得到的rr基因失活的重组质粒pHSV1-Δrr共转染叙利亚仓鼠肾细胞系BHK21，经过同源重组，获得icp34.5基因被lacZ表达盒插入失活、核糖核苷还原酶基因rr被EGFP基因插入失活的重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δrr-34.5/lac，用病毒上清感染含Xgal软琼脂培养基的BHK21细胞，挑出蓝斑，进行稀释，再接种BHK21细胞，进行空斑纯化。
3.重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防肿瘤中的应用。
4.重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防人肝癌肿瘤中的应用。
5.重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防人膀胱癌细胞的应用。
6.重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防入神经胶质瘤细胞中的应用。
7.重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物在治疗或预防人喉癌细胞中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组1型单纯疱疹病毒及制备方法，重组1型单纯疱疹病毒为rHSVΔrr－34.5/lac，CCTCC－V200601。步骤是重组质粒pAEB构建，穿梭质粒pSV1－AEB构建，RecA依赖的共整和体的形成，同源重组产生rr基因失活的重组质粒pHSV1－Δrr；β－半乳糖苷酶表达盒的获得与纯化，中间载体I pFL构建，中间载体II pBL构建，转移载体pIL构建，重组1型单纯疱疹病毒rHSVΔrr－34.5/lac的获得。本发明中凋亡抑制基因icp34.5也是神经毒基因被报导基因lacZ插入失活，核糖核苷还原酶基因rr被EGFP插入失活，重组1型单纯疱疹病毒仅在肿瘤细胞中复制，同时作为抗肿瘤药物在治疗或预防肿瘤中的应用，对正常细胞安全，具有很好的靶向性和选择性。
文档编号C12N15/861GK1844376SQ200610018400
公开日2006年10月11日 申请日期2006年2月23日 优先权日2006年2月23日
发明者齐义鹏, 祝华斌, 董长垣, 肖庚富, 兰萍, 薛峰, 苏越, 胡宝利, 肖巍 申请人:武汉大学