专利名称：逆境特异诱导双向表达活性的水稻启动子cpip的鉴定和利用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。具体地说涉及一种植物逆境特异诱导启动子的分离鉴定和应用。该启动子被命名为CPIP，被干旱或盐诱导并具有双向诱导表达活性，将其应用于植物抗逆基因特别是用于重要作物抗逆基因的遗传转化，达到提高植物抗逆性的目的。
背景技术：
水稻是最重要的粮食作物之一，我国是世界上第一种稻大国。非生物逆境(干旱、冷害和土壤盐渍化等)严重威胁着水稻产量和品质。在面临逆境胁迫时，植物的许多信号传递系统被开启，一批应答基因被诱导，包括直接起保护作用的功能蛋白基因(渗透调节物质、抗氧化物质、功能蛋白等)和在信号传递与胁迫应答基因表达中起调节作用的调控基因(转录因子、蛋白激酶等)(Xiong等，Cell signaling during cold，droughtand salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。尽管已有文献报道从植物中分离了大量抗逆相关基因并且在植物中超量表达这些基因对提高植物抗逆性有一定效果(Thomashow等，Plant coldacclimationFreezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol Biol 50571-599，1999；Shinozaki等，Molecular response to dehydration and low temperatureDifferences and cross-talk between two stress signaling pathways.Curr Opin Plant Biol 3217-223.2000；Saijo等，Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold andsalt/drought tolerance on rice plants.Plant J 23319-327，2000；Kim等，CIPK3，a calciumsensor-associated protein kinase that regulates abscisic acid and cold signal transduction inArabidopsis.Plant Cell 15411-423，2003)，但超量表达往往会产生一些负面的影响，如影响植物原来的产量潜力或导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应(Shavindra等，Transgenic approaches toincrease dehydration-stress tolerance in plants.Mol Breed 5493-503，1999)。利用逆境诱导型启动子来控制抗逆基因的表达越来越受到重视，一些逆境应答的启动子，如SalT启动子(Garcia等，Theexpression of the salt-responsive gene salT from rice is regulated by hormonal and developmentalcues，Planta.207172-180，1998)，RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，Characterization ofthe expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of itspromoter in transgenic plants.Mol Gen Genet 23331-340，1993；Kasuga等，A combination of theArabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperaturestress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol 45346-350，2004)，HVA1启动子(Xu等，Expression of a late embryogenesis abundant protein gene，HVA1，from barley conferstolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice.Plant Physiol 110249-257，1996；Ho和Wu等，Production of water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants USpatent，US5981842，1999)也已经鉴定出来并尝试了在一些作物的抗逆改良中应用。但已经鉴定的启动子要么特异性不强(即非诱导情况下表达量较高)，要么诱导强度不高，使得实际的应用价值大打折扣。另一方面，出于生物安全性的考虑，更是迫切需要条件诱导型(如盐诱导)启动子来控制遗传转化过程中筛选标记基因的表达。此外，由于到目前为止几乎所有用于遗传转化的启动子都只有单方向上的表达活性；即使个别启动子在另一方向有表达活性，但由于活性通常很低而无实际应用价值。具有双向强诱导表达活性的启动子不仅在构建遗传转化载体时能减少外源片段的数量，而且可以用于控制需要协同表达才能起作用的多基因的载体构建和转化。但是迄今为止尚无双向强诱导表达活性的启动子的鉴定和在遗传转化中利用的报道。
本发明是鉴定一个盐和干旱等逆境强烈诱导的水稻蛋白酶抑制子基因的启动子，该启动子具有双向逆境强诱导表达活性并且分别控制一个蛋白酶抑制子基因的表达。通过启动子活性分析，将具有双向逆境强诱导表达活性的启动子区段用于调控筛选标记基因和抗逆基因(或同时控制多个抗逆基因)在水稻中的表达，从而有效地提高了植物的抗逆性。
发明内容
本发明的目的是克隆、鉴定一个盐和干旱强烈诱导且具有双向表达活性的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗逆相关基因的表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗逆性。
本发明通过以下技术方案实现首先是分离盐和干旱强烈诱导表达的启动子。所分离的盐和干旱强烈诱导表达的启动子(该启动子的序列如SEQ ID NO1所示)来源于水稻。该启动子控制的水稻内源基因为糜蛋白酶抑制子(ChymotrypsinProteinase inhibitor)家族的两个成员，即这两个基因反向串联排列共同受一个具有双向表达活性的启动子控制(如图2所示)。该启动子命名为CPIP(Chymotrypsin Proteinase Inhibitor Promoter)。这两个基因分别命名为OsCPI1(GenBank登录号AY878695)和OsCPI2(GenBank登录号AY878694)，它们都能被干旱、高盐胁迫、冷害以及脱落酸(ABA)诱导(如图3所示)。该启动子CPIP的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，序列全长1893个碱基，根据现有文献报道，例如Skriver等，Cis-acting DNA elements responsive togibberellin and its antagonist abscisic acid.Proc Natl Acad Sci USA.887266-7270.1991；Simpson等，Two different novel cis-acting elements of erd1，a clpA homologous Arabidopsis gene functionin induction by dehydration stress and dark-induced senescence.Plant J 33259-270，2003和Urao等，An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.Plant Cell 51529-1539，1993；Abe等，Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcriptional activators in abscisic acid signalling.Plant Cell1563-78，2003，我们得知其中在307-311，423-427，571-575，1173-1177碱基位含有逆境相关的ABA应答元件ABRELATERD1，并在碱基位325-330，801-806，878-883，1384-1389，1849-1854含有MYB类转录因子结合的干旱应答顺式作用元件。
本发明所提供的启动子CPIP区域含有多个逆境相关顺式作用元件(如图1所示)，能特异性地对逆境和ABA起应答反应。申请人利用启动子CPIP的正向和反向构建的诱导性表达载体pCAMBIA1391Z-CPIP(如图4所示)可以在植物受到逆境胁迫时强烈地诱导报告基因GUS的表达(如图5、6、7所示)。本发明的效果详见具体实施方式
。
更详细的技术方案如下所述一种被干旱或盐诱导并具有双向诱导表达活性的启动子CPIP，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。具体地说它是SEQ ID NO1所示1-1893位碱基所示的序列。
如附图1所述，上述启动子序列的区域内除含有基本启动子元件外(例如CAAT-box，TATA-box)，还包含多个逆境应答顺式作用元件(例如ACGTATERD1，ABRELATERD1，MYB1AT和MYBCORE)的组合。
申请人将所述的启动子CPIP全部或部分序列构建成一种植物表达载体pCAMBIA1391Z-CPIP(如附图4所述)，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的植物表达载体pCAMBIA1391Z-CPIP转化水稻栽培品种植株，得到耐盐或抗旱的转基因水稻植株，从而完成了本发明。
本发明的启动子可以通过遗传转化培育的抗逆植物材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、种子或细胞无性系。
按照以上的技术方案，很显然，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的启动子CPIP构建抗逆相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗逆性。受体植物可以是包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也可以包括其他一些重要的经济作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄作物上的应用。
序列表SEQ ID NO1，公开了本发明克隆的水稻启动子CPIP的序列。
图1显示的是启动子CPIP序列。下划线序列为扩增启动子CPIP所用的引物序列。阴影显示的是基本启动子元件序列。ABRE类的逆境应答元件核心序列用文本框表示。MYB类逆境应答元件序列用波浪线表示。
图2显示的是启动子CPIP与OsCPI1和OsCPI2两个基因在水稻基因组(位于第一染色长臂，加红框)中的位置关系。启动子CPIP包含了OsCPI1和OsCPI2两个基因各自的第一个外显子以保证转录活性。
图3显示的是OsCPI1和OsCPI2基因能被多种逆境(干旱、200mM/L NaCl、100μM/L ABA)诱导表达。
图4是本发明构建的表达载体pCAMBIA1391Z-CPIP物理图谱。该载体含潮霉素(HRG)抗性筛选基因，启动子CPIP被融合到GUS基因5’端非翻译区。引物CPIP-F/M13F若能扩增出约1900bp片段，即CPIP正向连入；否则CPIP被反向连入。
图5显示的是启动子CPIP正向控制下的GUS基因在干旱胁迫处理下的诱导表达。CPIP-GUS融合基因的水稻转化植株干旱进行处理后，按图中标注的时间点取样，Northern检测GUS表达量的变化(A)并定量测定对应植株取样点的GUS蛋白活性(B)。野生型植株(CK)与阳性转化植株b是在土壤中干旱胁迫；阳性植株a是在吸干根部水分后暴露空气中干旱胁迫。
图6显示的是启动子CPIP正向控制下的报告基因GUS转基因水稻在高盐(200mM/L NaCl)下叶片中GUS表达量(A)和GUS活性分析(B)。图中CK为野生型对照，a、b为两棵独立转化植株。
图7显示的是CPIP反向控制下的报告基因GUS转基因水稻在干旱、高盐(200mM/L NaCl)胁迫下叶片中GUS表达量(A)和GUS活性分析(B)。ck1干旱处理野生型植株；(a)干旱处理转化植株；ck2NaCl处理野生型植株；(b)NaCl处理转化植株。
具体实施例方式
实施例1、启动子CPIP分离和鉴定通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农业科学院提供的商业品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高12倍以上)的cDNA，经序列分析确定该cDNA为一完整的全长cDNA编码一个糜蛋白酶抑制子基因，在GenBank数据库中登录号为AY878695；为方便分析，把该基因命名为OsCPI1。用OsCPI1的DNA序列搜寻水稻基因组序列，在离该基因约1118碱基对的位置存在一个序列相似性达82％的同源基因(命名为OsCPI2)，其转录方向与OsCPI1相反。在KOME数据库(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中找到一个与该OsCPI2序列100％匹配的全长cDNA编号为AK062495。
在已知OsCPI1和OsCPI2是两个转录方向相反且只间隔1118bp的基因的基础上，下一步就是分离可能控制这两个基因的共同启动子。具体步骤如下根据OsCPI1全长cDNA序列在GeneBank中找到了对应的粳稻“日本晴”的基因组序列(GenBank登录号为AP002866)并选取该基因的转录起始位点上游2Kb的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物CPIP-F(GGATCCGCTTGCTGTCTGATGAACTC)和CPIP-R(GGATCCAAACAATCGAGAAGATCCAA)斜体下划线表示添加的限制性酶切位点BamHI。首先利用引物CPIP-F、CPIP-R以日本晴基因组DNA(CTAB法抽提，参照Zhang等报道的方法genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)为模板进行扩增，反应条件是94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2mim，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳挖胶回收后连入pGEM-T Easy载体上，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪，Applied Biosystem，测序在国家植物基因中心[武汉]完成)，结果证实所扩增序列为预期的后动子CPIP序列，其包含多个旱、ABA逆境应答顺式作用元件(如图1)。
实施例2、检测水稻内源基因OsCPI1和OsCPI2的诱导表达以水稻品种“珍汕97”(一个中国广泛推广栽培的水稻品种)为材料，在3叶期分别进行干旱、高盐胁迫以及脱落酸(ABA)处理。干旱处理是将水稻幼苗根部水分吸干暴露于空气中于0h，30min，2h，4h，6h取样，高盐胁迫是将土壤中种植的幼苗种灌浇200mM NaCl溶液中并在0h，3h，1h，3d后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100μM ABA溶液中并在0h，30min，3h，6h，24h和72h后取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，Invitrogen)后进行RNA转膜(参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)，并以OsCPI1、OsCPI2分别为探针做Northern杂交。结果表明，OsCPI1、OsCPI2均能被干旱、高盐和ABA诱导表达(如图3)。
实施例3、启动子CPIP干旱诱导活性鉴定本发明的实施方案就是构建启动子CPIP的GUS基因表达载体并转化到水稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物研究所商业品种)中定量地检测启动子CPIP的干旱诱导表达活性。具体操作如下首先将实施例1中分离的启动子CPIP的PCR产物连入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，转化大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)并蓝白斑筛选阳性克隆。因为设计引物时在加入了BamHI酶切位点，通过单酶切连接将产物连入表达载体pCAMBIA1391Z(来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)的多克隆位点获得报告基因表达载体pCAMBIA1391Z-CPIP-GUS(推定其正向、反向均有可能实现)。通过酶切验证阳性克隆确定片段连入载体中后，再通过pCAMBIA1391Z载体上的通用引物M13F与所设计引物CPIP-F(序列同实施例1)做PCR扩增反应，确定启动子CPIP连入载体中的表达载体正、反方向性(详见说明书附图4)。将正、反两方向报告基因表达载体分别通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA，1994，Plant Journal 6271-282)基础上进行优化。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)硝酸钾(KNO3) 28.3克磷酸二氢钾(KH2PO4) 4.0克硫酸铵((NH4)2SO4) 4.63克硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.85克氯化钙(CaCl2·2H2O) 1.66克将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。
2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制碘化钾(KI) 0.08克硼酸(H3BO3)0.16克硫酸锰(MnSO4·4H2O) 0.44克硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.15克将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)烟酸(Nicotinic acid) 0.1克维生素B1(Thiamine HCl) 0.1克维生素B6(Pyridoxine HCl)0.1克甘氨酸(Glycine) 0.2克肌醇(Inositol) 10克加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)硝酸铵(NH4NO3) 16.5克硝酸钾 19.0克磷酸二氢钾 1.7克硫酸镁 3.7克氯化钙 4.4克将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)硫酸锰(MnSO4·4H2O) 2.23克硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.86克硼酸(H3BO3) 0.62克碘化钾(KI) 0.083克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.025克硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.0025克氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.0025克将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。
8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基
N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)100毫升N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升2，4-D贮存液(取上述制备好的)2.5毫升脯氨酸(Proline) 0.3克CH 0.6克蔗糖30克Phytagel3克加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
2)继代培养基N6max母液(10X)100毫升N6mix母液(100X) 10毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 10毫升维生素贮存液(100X)10毫升2，4-D贮存液 2.0毫升脯氨酸0.5克CH0.6克蔗糖 30克Phytagel 3克加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3)预培养基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X) 1.25毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5毫升维生素贮存液(100X)2.5毫升2，4-D贮存液 0.75毫升CH0.15克蔗糖 5克琼脂粉1.75克加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
4)共培养基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X) 1.25毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5毫升维生素贮存液(100X)2.5毫升2，4-D贮存液 0.75毫升CH0.2克蔗糖 5克琼脂粉1.75克加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。
5)悬浮培养基N6max母液(10X)5毫升N6mix母液(100X) 0.5毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 0.5毫升维生素贮存液(100X)1毫升2，4-D贮存液 0.2毫升CH0.08克蔗糖 2克加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6)选择培养基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X) 2.5毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5毫升维生素贮存液(100X)2.5毫升2，4-D贮存液 0.625毫升CH0.15克蔗糖 7.5克琼脂粉1.75克加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7)预分化培养基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X) 2.5毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5毫升维生素贮存液(100X)2.5毫升6-BA贮存液0.5毫升KT贮存液 0.5毫升
NAA贮存液50微升IAA贮存液50微升CH 0.15克蔗糖 7.5克琼脂粉 1.75克加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
8)分化培养基N6max母液(10X)100毫升N6mix母液(100X) 10毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 10毫升维生素贮存液(100X)10毫升6-BA贮存液2毫升KT贮存液 2毫升NAA贮存液 0.2毫升IAA贮存液 0.2毫升CH1克蔗糖 30克Phytagel 3克加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
9)生根培养基MSmax母液(10X)50毫升MSmix母液(100X) 5毫升Fe2+EDTA贮存液(100X) 5毫升维生素贮存液(100X)5毫升蔗糖 20克Phytagel 3克加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤3.1愈伤诱导(1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；(2)用灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
3.2愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.3预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.4农杆菌培养1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
3.5农杆菌侵染1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；2)调节农杆菌的悬浮液至OD600.8-1.0；3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
3.6愈伤洗涤和选择培养1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。
3.7分化1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
3.8生根1)剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
3.9移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
申请人采用构建的pCAMBIA1391Z-CPIP载体(图4)转化水稻。对产生的抗性植株进行干旱、高盐胁迫，通过检测胁迫后的植株中GUS蛋白活性来评价启动子CPIP受逆境胁迫诱导强度。其中高盐处理是将培养水稻抗性植株的水培液中加入200mM NaCl；干旱处理及取样方法参照实施例2进行。水培培养液各元素浓度N40ppm；P10ppm；K40ppm；Ca40ppm；Mg40ppm；Mn0.5ppm；Mo0.05ppm；B0.2ppm；Zn0.01ppm；Cu0.01ppm；Fe2ppm。
将对照与胁迫后植株各时间点所取样品在液氮中磨成粉末，分成两管。一管抽提RNA(Trizol试剂，Invitrogen)，转膜后以GUS基因为探针进行Northern杂交(方法同实施例2)来分析逆境胁迫后启动子CPIP控制的报告基因的表达情况。对应另一管样品通过GUS提取缓冲液(50mM Na2HPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na2EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提蛋白质，从样品蛋白质提取物中取10μl进行GUS活性的定量分析。具体操作如下将10μl样品蛋白质提取物+0.4mlGUS提取缓冲液+10μl 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl-β-D-glucuronide)在37℃水浴20min后，加入1.6ml反应终止液(0.2M Na2CO3)；DyNA Quant 200荧光计调零后，将50nM MU的灭光吸收值定为500作为参比，测出这2ml反应液反应所生成4-MU(4-methylumbelifferyl)的相对荧光吸收值，；然后对各样品的总蛋白质通过Bradford法(参见A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding.1976，Anal Biochem，72248-254)进行浓度测量以便对各样品的GUS活性相对值进行比较分析。综合以上数据得出各个样品的GUS活性的绝对值(pmol MU/min/mg protein)。
通过在p1391Z-CPIP转化植株中GUS的Northern杂交和GUS蛋白活性测定发现，启动子CPIP正、反两方向均具备受干旱和高盐诱导表达活性。在p1391Z-CPIP正向转化植株中，启动子在干旱胁迫下呈现梯度上升趋势(附图5)，高盐胁迫6小时后，启动子正向控制的GUS活性是胁迫前的三倍(附图6)。同时，启动子CPIP反向控制下的GUS表达量也受到干旱、高盐强烈诱导，转化植株的GUS蛋白活性在干旱胁迫下比胁迫前升高达到四倍，盐胁迫后诱导量上升将近六倍(如附图7所示)。
序列表<110>华中农业大学<120>逆境特异诱导双向表达活性的水稻启动子CPIP的鉴定和利用<130>
<141>2006-01-13<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1893<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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1.一种被干旱或盐诱导并具有双向诱导表达活性的启动子CPIP，它的核苷酸序列如SEQID NO1所示。
2.权利要求1所述的启动子CPIP，它是SEQ ID NO1所示1-1893位碱基所示的序列。
3.权利要求1或2所述的启动子CPIP的全部或部分序列构建的植物表达载体。
4.权利要求3所述的植物表达载体为启动子CPIP的全部序列。
5.权利要求4所述的植物表达载体，该载体是pCAMBIA1391Z-CPIP。
6.权利要求1或2所述的启动子CPIP在培育抗逆植物中的应用。
7.权利要求6的应用，其中包括在培育耐旱或抗盐植物中的应用。
8.权利要求6或7的应用，其中包括在培育耐旱或抗盐水稻中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。从水稻(Oryza Sativa L.)中分离克隆并鉴定了一种被干旱或盐诱导并具有双向诱导表达活性的启动子CPIP，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，能同时控制两个糜蛋白酶抑制子基因。由启动子CPIP在正反方向控制的糜蛋白酶抑制子基因都能特异性地对干旱、盐胁迫和对脱落酸(ABA)起应答反应，所述的启动子区域含有多个逆境应答顺式作用元件。将启动子CPIP以正反两个方向分别控制GUS报告基因转化水稻，GUS转基因在干旱、盐胁迫时都能强烈地诱导表达。本发明还公开了利用该启动子构建逆境特异诱导的遗传转化载体以及通过农杆菌介导方法培育耐盐、抗旱等抗逆植物的方法。
文档编号C12N15/82GK1807629SQ20061001815
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月13日 优先权日2006年1月13日
发明者熊立仲, 黄越敏 申请人:华中农业大学