专利名称：耐氯菌株v430的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐氯菌株V430的基因，它是腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430的16S rDNA基因。其中，腐生葡萄球菌V430已由中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏日期是2005年12月9日，保藏号是CCTCC NO.M205145。通过经典表型鉴定和16S rDNA核苷酸序列分析相结合的方法，对耐氯菌株V430进行了生理生化和16S rDNA分子水平的鉴定，由此确定它为腐生葡萄球菌。
背景技术：
自然界中，存在着一些可以在含有高浓度甚至是极端高浓度氯离子的环境中正常生长的微生物。经过研究发现，这些微生物并非都可以应用于含高浓度氯离子废水(氯离子浓度为5000-80000mg/L)的处理，只有对其经过严格的筛选和驯化后得到的耐氯微生物才能做到。耐氯微生物既可耐受高浓度氯离子环境，又可降解废水中高浓度的有机物。筛选耐氯微生物的首选取样点就是所要处理的废水中，因为在废水中存在着一定数量的微生物，这些微生物对废水环境有较好的适应能力。初筛选出来的耐氯微生物经过驯化后，即可作为耐氯微生物菌株应用到废水处理实践中。
微生物的分类方法常用的有经典分类方法和分子生物学分类法。经典分类方法主要指依据形态特征(Morphological characteristics)、培养特征(Cultural characteristics)及生理生化特征(Physiological characteristics)等分类的方法。分子生物学分类法，又称分子分类方法，是指在分子水平上对生物个体的核酸及蛋白质进行研究，并据此对生物个体进行分类的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分类方法采用。
目前，16S rDNA序列分析的方法主要有两种一种是16S rDNA提纯后用反转录酶和保守引物进行测序，另一种是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，然后将PCR产物回收后直接测序。
耐氯菌由于具有耐氯特性，其形态、胞壁、细胞内蛋白、脂肪酸等大分子组成在有盐存在的情况下会发生不同程度的改变，在菌株鉴定过程中，仅从形态上很难判断它们的归属，而从生理特征和化学特征上鉴定又十分费时费力，对于大量的分离菌株更是如此。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过16S rDNA序列分析方法，快速对耐氯菌株V430进行分子水平的鉴定，确定其为腐生葡萄球菌。该菌株是新发现的能够在高浓度氯离子环境下生存的耐氯菌株，它有助于降解废水中的有机物。
本发明所采用的技术方案如下
耐氯菌株V430的基因，其特征征在于为腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的16S rDNA基因，其菌株的16S rDNA全序列如下GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423上述16S rDNA序列全长1423个核苷酸。
采用BLAST分析法，将腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与腐生葡萄球菌的同源性为98.0-99.0％。
一种获取耐氯菌株V430的基因的方法，其采用了提取细菌核DNA、16S rDNA基因的PCR扩增、PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析步骤，其特征在于(1)在提取细菌核DNA的过程中，采用了如下的缓冲液，TE缓冲液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE缓冲液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0，(2)在16S rDNA基因的PCR扩增过程中，采用了如下的扩增条件和扩增的引物PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min，PCR扩增的引物是P1正向引物为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，(3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水，(4)16S rDNA的全序列测定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR扩增30个循环，其条件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应；然后，在AppliedBiosystem 373ADNA测序仪上测序；然后采用BLAST软件，将测得的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为腐生葡萄球菌株的基因全序列，在PCR测序时，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
提供腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的16S rDNA基因。本发明基因序列，通过提取细菌核DNA，16S rDNA基因的PCR扩增，PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析而获得。本发明具有快速、简便的优点。
图1是本发明腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列2-1a是菌株V430菌株电镜图片图2-1b是菌株V430菌株电镜图片图2-1c是菌株V430菌株电镜图片图2-2是菌株V430在液体不同氯离子浓度的SC培养基上生长情况2-3是菌株V430 PCR扩增琼脂糖电泳图(1核DNA，2扩增产物，MMarker)图2-4a是菌株V430在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率2-4b是菌株V430在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率2-4c是菌株V430在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率2-4d是菌株V430在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率图具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
本发明提供的腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的基因，其16S rDNA全序列如图1所示。
采用BLAST分析法，将腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与腐生葡萄球菌的同源性为98.0-99.0％，由此可以从分子水平确定本菌株是腐生葡萄球菌。同时，结合经典分类方法所获得的形态及生理生化特征，最终确定本菌株是腐生葡萄球菌。
本发明采用提取细菌核DNA、16S rDNA基因的PCR扩增、PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析步骤，来获取CCTCC NO.M205145菌株的16S rDNA基因全序列。
上述步骤具体如下(1)细菌核DNA的提取1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养过夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管内，8,000rpm室温离心5min，彻底除去上清。
2)加STE溶液1.5ml洗涤一次，离心弃上清，再加入0.6mlTE溶液，重悬细菌。
3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min4)加65μl10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小时，至溶液变清。
5)加入等积体酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白层为止。
6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc(pH5.2)。
7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，在用70％的乙醇洗涤一次，自然凉干，并将DNA溶于100μl TE溶液中。
8)加入终浓度为50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存备用。
(2)16S rDNA基因的PCR扩增在50μL反应体积中加入1μL模板DNA，0.1μg；0.5μLP1和P2，终浓度为0.5μM；1μLdNTP，每种NTP0.2mM；0.5μLTaq聚合酶，2U；5μL 10×PCR缓冲液。
PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。
PCR扩增的引物是P1正向引物为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。
(3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。
(4)16S rDNA的全序列测定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR扩增30个循环，其条件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应；然后，在AppliedBiosystem 373ADNA测序仪上测序；然后采用BLAST软件，将测得的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为腐生葡萄球菌株的基因全序列。
在PCR测序时，使用如下的正反向引物
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图2-3所示。
耐氯菌株V430的筛选方法及应用如下一、一株耐氯菌株V430的筛选方法(一)、材料准备1、菌源和实验废水(1)菌源处理皂素废水的生化系统中的活性污泥；(2)实验废水(即混合皂素废水)本实验废水取自湖北省十堰市方坤置业有限公司皂素生产废水；经内电解和CaO调配后，具体指标为pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl-＝8000-30000mg/L，NH4-N 140-300mg/L。
2、培养基分离(完全)培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml。
筛选培养基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素废水(COD浓度为1000mg/L)，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
扩大培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml；CaCl2加入量为12.6g-140g；当CaCl2加入量为12.6g时，SC培养基内[Cl-]＝10000mg/L。
斜面培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；磷酸二氢钾2g；氯化铵1g；琼脂20g；蒸馏水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培养基分别于121℃高压灭菌30min后备用。
3、实验仪器和设备国华SHA-B恒温振荡器，SHH150G光照生物培养箱，卧式压力蒸汽灭菌器，WMX-1型微波密封消解COD速测仪，722S分光光度计，光学显微镜，pH计，超净工作台，鼓风干燥箱，超薄切片机，日立H-7000FA投射显微镜，PTC200型PCR仪，电泳仪及电泳槽，凝胶紫外观测仪等。
(二)、菌株的分离与筛选1、菌胶团的破碎取2g皂素废水处理系统中的厌氧活性污泥，加入事先灭菌好的装有100ml无菌水的250ml的三角瓶内，并加入重量为无菌水0.01％的焦磷酸钠，摇床振荡，将菌胶团打碎，得泥水混合物，备用。
2、耐氯离子优势菌种的分离利用无菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分离培养基4.5ml，35℃厌氧恒温培养5-7天，待试管培养基变混浊，说明细菌已经生长，然后平板稀释涂布，挑取在菌落特征上有明显差异的单菌，直至获得单一菌株，并于斜面培养基上斜面保存。
3、耐氯离子优势菌种的筛选挑取上述分离出的单菌落，分别接种于筛选培养基内，35℃厌氧恒温培养5-7天，观察菌悬液的混浊情况，变混浊的即为筛选出的耐高氯离子的菌株。经过筛选，最后得到一株编号为菌株V430的菌株，即耐氯菌株V430。耐氯菌株V430在加入不同浓度氯离子的液体SC培养基上生长情况如图2-2所示(同时辅以[Cl-]＝3000mg/L时的OD600nm为对照值)。
二、耐氯菌株V430的菌落形态、生理和生化特征见表1。细胞形态见图2-1a、图2-1b、图2-1c。
表1菌株V430的菌落形态特征以及主要的生理特征
表中符号说明“+”90％以上的菌株为阳性，“-”90％以上的菌株为阴性。
三、菌株V430为新的菌株将菌株V430的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较发现，细菌V430与腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)多个菌株的同源性高达98-99％以上。综合菌株V430的生理生化以及分子鉴定结果，可确定细菌V430为腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，菌株V430命名为腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430(即耐氯菌株V430)，查阅有关资料，尚无腐生葡萄球菌属有关高浓度氯离子条件下难降解有机废水以及对其耐氯能力研究的报道。腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430为新的菌株，已于2005年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC NO.M205145。
本发明分离、筛选出的菌株V430，具有较好降解高浓度氯离子难降解皂素废水的功能。这就拓宽了人们对腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含高浓度氯离子皂素废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。
四、耐氯菌株V430的应用挑取腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430单菌落，于扩大培养基中培养24h，取皂素混合废水([Cl-]＝8000-20000/L，COD＝8000-10000mg/L)50ml分别加入250ml的锥形瓶中，分别加入菌株的菌悬液1ml，35℃、pH值＝7.5，厌氧反应5天，计算菌株对废水的COD的去除情况，降解因素实验除了所考察的因素外，其余均同以上条件。菌株V430去除COD的效率好，为50-60％；结果见图2-4a、图2-4b、图2-4c、图2-4d。
所述的扩大培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；CaCl218.0g/L，pH＝7.5。
1)为了考察菌株在不同氯离子浓度下，对COD的去除效果，在废水中加CaCl2调节氯离子浓度分别为9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株V430去除效果结果如图1-4a。
从图2-4a可以看出，当[Cl-]＝9864.2mg/L时，反应时间为3d，菌株V430对COD的去除率仅为39.31％，但是随着废水中氯离子浓度的升高，菌株V430对COD的去除率增加，当废水中氯离子浓度达到2.5万mg/L时，菌株V430对COD的去除率可达64.38％，并且菌株V430对COD的去除率随着废水中氯离子浓度的继续增加而变化不大，当废水中氯离子浓度高达3万mg/L时，菌株V430对COD的去除率仍保持在60％。
2)为了考察菌株在不同COD浓度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，对COD的去除效果，在废水中加CaCl2调节氯离子浓度分别为20000mg/L。耐氯菌株V430去除效果结果如图2-4b。通过实验可知当废水中[Cl-]＝20000mg/L、COD浓度达到1万mg/L时，菌株V430对COD的去除率较好，可达62.37％。
3)从图2-4c和2-4d可以看出，菌株V430对COD的去除率随pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH为7.5-8时，达到62％。离心处理后的废水，发现pH为7-8时，湿菌体量明显高于pH为9、10、11时，可见在pH在中性时，有利于菌株的生长；当接种量在1-4ml之间变化时，菌株V430对COD的去除率无明显变化，基本为60％，当接种量为1ml时，其去除率最好。这是因为菌株的生长需要一定的营养物质，当菌悬液为1ml时，其需要的物质容易得到满足。
<110>中国地质大学(武汉)<120>耐氯菌株V430的基因<160>1423<210>1<211>1423bp<212>DNA<213>腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320
TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 142权利要求
1.耐氯菌株V430的基因，其特征征在于为腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的16S r DNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423上述16S r DNA序列全长1423个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的耐氯菌株V430的基因，其特征在于采用BLAST分析法，将腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S r DNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与腐生葡萄球菌的同源性为98.0-99.0％。
3.一种获取权利要求1或2所述耐氯菌株V430的基因的方法，其采用了提取细菌核DNA、16S rDNA基因的PCR扩增、PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析步骤，其特征在于(1)在提取细菌核DNA的过程中，采用了如下的缓冲液，TE缓冲液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE缓冲液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0，(2)在16S rDNA基因的PCR扩增过程中，采用了如下的扩增条件和扩增的引物PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min，PCR扩增的引物是P1正向引物为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，(3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水，(4)16S rDNA的全序列测定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR扩增30个循环，其条件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应；然后，在AppliedBiosystem 373 A DNA测序仪上测序；然后采用BLAST软件，将测得的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为腐生葡萄球菌株的基因全序列，在PCR测序时，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACA ATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
全文摘要
本发明涉及耐氯菌株V430的基因，它是腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430的16S rDNA基因，本发明基因序列，通过提取细菌核DNA，16S rDNA基因的PCR扩增，PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析而获得。本发明具有快速、简便的优点。
文档编号C12N1/20GK1900283SQ20061001813
公开日2007年1月24日 申请日期2006年1月10日 优先权日2006年1月10日
发明者信欣, 王焰新, 鲍建国, 刘慧 , 李平, 杨雪芬 申请人:中国地质大学(武汉)