亚洲玉米螟中肠apn启动子及活性分析的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，它可以作为启动子调控基因的 表达。具体涉及一种来源于亚洲玉米螟氨肽酶基因APN(GenebankNO.EU137839)，并在细 胞中高度表达的诱导型启动子序列。
【背景技术】
[0002] 亚洲玉米螟是我国玉米的重要害虫，亦是Bt玉米的重要靶标昆虫。Bt毒素与昆虫 中肠上皮细胞受体的结合是决定其杀虫毒力的关键，受体的变异与昆虫对Bt毒素产生抗 性相关。众所周知，鳞翅目昆虫中氨肽酶（aminopeptidase，APN))是苏云金芽孢杆菌杀虫 蛋白Cry的作用靶标之一。这些酶蛋白家族至少有八个不同的成员同时在鳞翅目幼虫中肠 的表达。鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜上氨肽酶是Bt毒素的主要受体蛋白。APN属于锌金属肽 酶，N-末端具有剪切信号肽、C-末端含有一个糖基化磷脂肌醇（GPI)锚信号序列、锌结合位 点HEXXH、谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN。鳞翅目昆虫APN的保守结构区如锌结合位 点、GAMEN、毒素结合区等的氨基酸改变就可能引起其与毒素亲和性的改变。已有研宄结果 表明，氨肽酶是Cry1A类Bt蛋白的主要受体，它的变异可以导致昆虫对Bt产生抗性。亚洲 玉米螟氨肽酶APN氨基酸发生突变可能会引起该氨肽酶上毒素结合部位空间结构的变化， 继而影响受体与毒素的结合亲和性，从而导致亚洲玉米螟对CrylAb产生抗性。这可能是亚 洲玉米螟对Bt产生耐受性的重要生理机能。亚洲玉米螟中肠中ANP丰度极高，显示出亚洲 玉米螟氨肽酶APN基因启动子极可能具有较高活性，迄今为止，未有从亚洲玉米螟中分离 出的APN高活性启动子。因此，对于新的高活性的并具有组织特异性的亚洲玉米螟相关启 动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作 的转录因子的研宄具有重要意义，也可为深入研宄害虫对Bt抗性机制及新型抗虫新品种 的研制奠定基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供一种亚洲玉米螟APN启动子序列，该启动子序列能够诱 导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于亚洲玉米螟APN基因。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种用于真核细胞转染的亚洲玉米螟APN启动子真 核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因APN的启动子序列和5'非翻译区。
[0005] 本发明的第三个目的是提供一种所述真核细胞表达载体的表达，该载体的表达能 反映启动子活性的高低。
[0006] 为实现上述目的，本发明克隆了亚洲玉米螟APN基因的启动子区，并构建了真核 表达载体，所述载体包含带有APN基因的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在 Sf9细胞中表达，并检测到该启动子的高水平活性。
[0007] 本发明提供一种获得的亚洲玉米螟APN启动子序列，所述启动子序列如SEQID NO: 1所示，其中SEQIDNO:1的-lbp至-913bp区（见序列表）为亚洲玉米螟APN启动 子DNA序列，在真核细胞中高表达，本发明所述的启动子高水平活性。
[0008] 获得的亚洲玉米螟APN启动子序列源自玉米螟氨肽酶基因APN。
[0009] SEQIDNO: 1的+lbp至+102bp区（见序列表）为亚洲玉米螟蚜APN基因的5'非 翻译区的DNA序列，本发明所述的亚洲玉米螟APN基因的5'非翻译区能在Sf9细胞中，通 过增强目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。
[0010] 为实现另一个目的，本发明提供一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述 真核细胞表达载体包含亚洲玉米螟APN启动子序列。
[0011] 上述用于Sf9细胞转染的真核表达载体，是指能够在细胞中瞬时、高水平表达外 源基因的载体。例如PGL3载体、pGL4载体。
[0012] 一种用真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含亚洲玉米螟APN启动子 序列。
[0013] 关于本发明所述的用于真核细胞的表达载体（PGL3)、亚洲玉米螟APN基因的启动 子和5'非翻译区，在表达载体中位于外源基因（Luc+)的前面。本发明提供通过插入本发 明所述的亚洲玉米螟APN基因的启动子和5'非翻译区至含有Luc+报告基因的载体中而构 建的pGL3-〇fAPN(-913/+202)。但是，所述Luc+报告基因是外源基因，并预期可以用任意其 它有用的外源基因来代替。
[0014] 本发明提供来自亚洲玉米螟APN的启动子和5'非翻译区，根据本发明的启动子和 5'非翻译区，使得能够在真核细胞中进行高水平的表达。
[0015] 本发明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表达，还可应用于获得低丰度基 因研宄，使其获得高水平、稳定表达，对于目的基因功能研宄具有积极意义。
【附图说明】
[0016] 图1为亚洲玉米螟基因组电泳图
[0017] 图 2 为GenomewalkerPCR电泳图
[0018] 图3为APN启动子连T载酶切鉴定电泳图
[0019] 图4为APN启动子连pGL3PCR鉴定电泳图
[0020] 图5为APN启动子连pGL3酶切鉴定电泳图
[0021] 图6为pGL3-0fAPN(-913/+202)转染Sf9细胞后启动子活性检测示意图 图7为pGL3-0fAPN(-913/+202)表达载体示意图
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实 施本发明。尽管已经结合本发明的优选的【具体实施方式】来对本发明进行了描述，但是以下 描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。
[0023] 实施例1:亚洲玉米螟APN启动子的克隆
[0024] 依据亚洲玉米螟氨肽酶基因APN的mRNA序列（GenbankNo.EU137839)设计染色 体步移引物GSP1 (5-ACCGTATGAGGTAITTCAGTATCTCCCAA-3)和GSP2 (5-CGTCAGCGAAGAITGTGT TTCTGTATG-3)。提取玉米螟基因组DNA(图 1)，并用平切酶Afel、EcoRV-HF、PvuII、SmaI、 PmeI、StuI、BstZ17I进行消化，纯化DNA并连接接头引物。按照设计的特异性引物进行PCR 扩增，并按照Genomewalker(Clontech)PCR方法进行扩增。扩增得到目的片段，经1%琼 脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1115bp的条带（图2)，并进行回收。回收片段与pGEM-T 载体连接得到重组质粒，提取质粒并进行酶切验证（图3)，并测序。
[0025] 亚洲玉米螟APN启动子（启动子序列包含相对于SEQIDNO: 1的转录起始位点 的-lbp至-913bp区的DNA核苷酸序列），在亚洲玉米螟APN的5'区序列中得到鉴定。
[0026] 在本发明带功能元件标记的启动子序列表中，转录起始位点的碱基用+1示出， ATG为箭头所指的灰背景色部分。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子 分析网站http: //www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html
[0027] 实施例2 :亚洲玉米螟APN启动子表达载体pGL3-0fAPN(-913/+202)的构建
[0028] 将在实施例1中所克隆的亚洲玉米螟APN启动子和5'非翻译区（见序列表）插 入到PGL3载体中，从而构建pGL3-〇fAPN(-393/+268)载体。
[0029] 更具体地说，是利用引物（5-ACGCGTCCITTGTCCAGCAGTGGACG-3， 5-CTCGAGCGTCAGCGAAGATTGTGTTTC-3)扩增并将该启动子序列克隆到pGL3载体Mlul和 Xhol位点上，构建成pGL3-0fAPN(-913/+202)，用于驱动Luc+的表达，经PCR鉴定（图4) 和酶切鉴定（图5)获得启动子与载体的重组质粒。
[0030] 实施例3 :鉴定本发明所述的亚洲玉米螟APN启动子的活性
[0031] Sf9 细胞接种于 24 孔板中（4X105cells/ 孔），用CellfectinII试剂 (Invitrogen;2yL/ 每孔）瞬时共转染pGL3-0fAPN(-913/+202)建体（2yg/ 孔）和对照 报告基因质粒phRL-TK(Promega;0. 2yg/孔），48小时后，收获细胞，将所得裂解物用于测 量萤光素酶活性（Promega)。如图6所示，pGL3-0fAPN913/+202)所转染细胞具有很高荧光 素酶活性。
[0032] 实用性
[0033] 如上所述，本发明提供亚洲玉米螟APN基因启动子和5'非翻译区。
[0034] 本发明提供分别将亚洲玉米螟APN基因启动子和5'非翻译区插入至pGL3而获得 的真核细胞表达载体。
[0035] 经使用所述的真核细胞表达载体进行鉴定，本发明所述的亚洲玉米螟APN基因启 动子和5'非翻译区能够启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高真核基因的高效表 达，应用于获得低丰度基因研宄使其获得高水平、稳定表达。
[0036] SEQIDNO. 1的序列（带功能元件标记）
[0037] (i)序列特征：(A)长度：_lbp至 _913bp;+lbp至 +202bp; (B)类型：核苷酸；（C) 链性：单链。
[0038] (ii)分子类型：核苷酸
[0039](iii)序列描述：SEQIDNO. 1
【主权项】
1. 一种获得的亚洲玉米螟APN启动子序列，其特征在于所述启动子序列如SEQID NO: 1所示，其中SEQIDNO:1的-Ibp至-913bp区为亚洲玉米螟APN启动子DNA序列，SEQ IDNO: 1的+Ibp至+102bp区为亚洲玉米螟APN基因的5'非翻译区的DNA序列。
2. -种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，其特征在于所述真核细胞表达载体包含 权利要求1所述的亚洲玉米螟APN启动子序列。
【专利摘要】亚洲玉米螟中肠APN启动子及活性分析。亚洲玉米螟APN启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供了一种获得的亚洲玉米螟APN启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO：1的-1bp至-913bp区为丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子DNA序列，SEQ ID NO:1的+1bp至+102bp区为亚洲玉米螟氨肽酶基因APN的5’非翻译区的DNA序列；一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体包含亚洲玉米螟APN启动子序列；一种用真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含亚洲玉米螟APN启动子序列；本发明可用于真核基因的高效表达，应用于获得低丰度基因研究，使其获得高水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。
【IPC分类】C12N15-79, C12N15-113
【公开号】CN104818275
【申请号】CN201510184118
【发明人】尚庆利, 潘怡欧, 毕锐, 杨晨, 彭天飞
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月18日