专利名称：基于RNAi技术防治害虫的新方法
技术领域：
本发明属于生物技术和农药学领域；更具体地，本发明涉及基于RNAi技术防治害虫的新方法。
背景技术：
亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis Guenee)和棉铃虫(Helicoverpa armigeraHubner)是重要世界性农业害虫，亚洲玉米螟主要危害玉米、高粱、向日葵等重要的粮食经济作物，棉铃虫主要危害棉花和蔬菜等20多科200余种重要农作物。小菜蛾常年危害面积占蔬菜种植总面积的10%左右(2010蔬菜种植面积3333万hm2，小菜蛾发生面积达253万hm2 ；2009菜种植面积3000万hm2,小菜蛾发生面积达270万hm2),造成的损失在20 30%左右，如果防治不及时或者措施不合理可能造成绝收。目前对亚洲玉米螟、棉铃虫和小菜蛾的 防治，仍然是以化学防治为主，但是其对生态环境及粮食安全生产造成了巨大的损害。化学防治诸多危害已经使得人们不得不寻求更好的害虫治理办法，生物防治虽然可以起到防治作用，但是由于其见效期慢，效果不明显，受环境影响较大而得不到大众认可。RNAi现象自从1991年发现以来迅速发展，研究表明，通过特异基因的RNAi，可以达到定向干涉物种的靶基因，出现某些生理现象，达到研究基因功能的目的，同时，这种现象有着极高的特异性，即同源基因对不同物种起的干涉效果并不明显，因此是一种理想的害虫防治体系。目前，利用RNAi技术进行害虫防治已有报道，Baum等(2007)证明v-ATPase对玉米根萤叶甲(Western corn rootworm WCR Diabrotica virgifera virgifera LeConte)有致死效果，可以用于田间防治；同年，mao等通过将P450的dsRNA导入棉花中，可以导致棉铃虫(cotton bo I lworm Helicoverpa armigera)死亡；Tian(2009)证实通过饲喂的方法可以导致甜菜夜蛾(Spodoptera exigua(Hubner))的死亡,一系列的现有技术都表明，RNAi技术作为一种新型的害虫防治方法是可行的，但是，之前的研究也表明，基于RNAi技术的害虫防治还有很多问题需要解决，如1)如何快速高通量的发掘靶标基因；2)如何简便的应用于田间生产；3)抗性问题；4)安全性问题等等。因此，将RNAi技术应用于害虫防治领域，还需要解决上述问题。首先需要获得足够多的、有效的靶标基因，这样，大量的靶标基因通过不同的组合方式，不同的时期使用不同的基因进行防治，可有效地避免害虫抗性的出现。因此，利用RNAi技术的害虫防治集中在靶标基因的获得以及如何方便、有效地应用于田间这两个急需解决的问题，本发明旨在为解决这些问题提供途径。此外，本发明还提供了利用同一基因的不同片段，可以获得昆虫种类特异型和种间广谱型的杀虫制剂和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RNAi技术防治害虫的新方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组(a) SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸 序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，该多肽是SEQ ID N0:2氨基酸序列的多肽。 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸选自下组的一种(I)SEQ ID NO: I所示序列的多核苷酸；(2) SEQ ID NO: I中第41-2308位的序列的多核苷酸；(3)与(I)或⑵限定的序列在严格条件下杂交的且编码的蛋白与⑴或⑵的多核苷酸编码的蛋白功能相同的多核苷酸；(4)与(I)或⑵限定的序列在具有80%以上(较佳地90%以上；更佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)的序列相同性且编码的蛋白与⑴或(2)的多核苷酸编码的蛋白功能相同的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞(较佳地，为非生殖性或繁殖性的细胞)，含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸片段，所述多核苷酸片段的序列与前面所述的多核苷酸序列具有10%以上(较佳地15%以上；更佳地20% ;更佳地25% ;更佳地30%)的序列相同性。在另一优选例中，该多核苷酸片段选自下组的一种(i)SEQ ID NO: USEQ ID NO: 3-5,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 20-21 任一所示序列
的多核苷酸；(ii)与(i)限定的序列在严格条件下杂交的任一多核苷酸或互补序列，其中包含所述的任一条核苷酸的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长；(iii)与(i)限定的序列具有至少70%(优选至少75%、80%、85%、90%，更优选至少95%、96%、97%、98%、99%)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列，其中包含所述的任一条核苷酸的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长；(iv)包含(i)限定的任一所示序列之至少17-21个连续核苷酸的序列或互补序列，其中包含所述的任一条核苷酸的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长;(V)与⑴或(ii)或(iii)或(iv)限定的序列在严格条件下杂交的且编码的蛋白结构域与(i)或(ii)或(iii)的多核苷酸片段编码的蛋白结构域功能相同的多核苷酸片段；(vi)与⑴或(ii)或(iii)或(iv)限定的序列在具有80%以上(较佳地90%以上；更佳地95% ;更佳地98% ;更佳地99%)的序列相同性且编码的蛋白结构域与⑴或(ii)或(iii)的多核苷酸片段编码的蛋白结构域功能相同的多核苷酸片段。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸片段中的一种、二种或多种。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸片段中的一种、二种或多种。在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸或多核苷酸片段的用途，用于作为制备特异性干扰有害生物基因表达或抑制有害生物生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的有害生物基因选自贮藏蛋白蛋白基因；或用于作为制备杀昆虫(如鳞翅目昆虫)的制剂的靶标。在另一优选例中，所述的贮藏蛋白基因选自亚洲玉米螟贮藏蛋白基因或棉铃虫贮藏蛋白基因或小菜蛾贮藏蛋白基因；所述的鳞翅目昆虫选自亚洲玉米螟或棉铃虫或小菜蛾；在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于作为筛选或制备杀昆虫的制剂的靶标。在另一优选例中，所述的制剂选自(但不限于)核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子。在另一优选例中，所述的核酸抑制物选自dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA ;或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。在本发明的另一方面，提供一种核酸抑制物，选自(I)以所述的多核苷酸或多核苷酸片段，或它们的转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA ;其中所述的任一 dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长；或(2)以有害生物基因作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中所述的任一 dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长，所述的有害生物基因选自减蛋白基因；或(3)能表达或形成(I)、(2)所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。在另一优选例中，所述的核酸抑制物是所述的多核苷酸表达产生的dsRNA，其中所述dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长。在另一优选例中，所述的核酸抑制物是dsRNA，其具有如下结构
权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组 (a)SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO:2任一所示氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳地1_15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；如3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组 (a)编码如权利要求I所述多肽的多核苷酸； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.—种分离的多核苷酸,其特征在于，它包含一核苷酸序列，该多核苷酸选自下组的一种(a)SEQ ID NO:USEQ ID NO: 3-5,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 20-21 任一所示序列的多核苷酸； (b)与(a)限定的序列在严格条件下杂交的任一多核苷酸或互补序列，其中包含所述的任一条核苷酸的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长； (c)与(a)限定的序列具有至少70%以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列，其中包含所述的任一条核苷酸的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长； (d)包含(a)限定的任一所示序列之至少17-21个连续核苷酸的序列或互补序列，其中包含所述的任一条核苷酸的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2或3所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。
6.权利要求2或3任一所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰有害生物基因表达或抑制有害生物生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的有害生物基因选自贮藏蛋白基因。
7.—种核酸抑制物,选自 (a)以权利要求2或3任一所述的多核苷酸作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中所述核酸抑制物被害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长；或 (b)以有害生物基因作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中所述核酸抑制物被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长，所述的有害生物基因选自减蛋白基因；或 (c)能表达或形成(a)、(b)所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
8.如权利要求7所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的核酸抑制物是权利要求2或3所述的多核苷酸表达产生的dsRNA，其中所述的dsRNA被有害生物摄取后，会抑制所述有害生物的生长。
9.如权利要求8所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的dsRNA，其具有如下结构
10.如权利要求7所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的核酸抑制物是构建物，所述构建物含有以下结构 Seq正向Ueq反向； 其中， Seqi^是权利要求2或3任一所述的多核苷酸或它们的序列片段,或包含与选自权利要求2或3中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列； Seqfi^1为与Seq1^1基本上互补的序列； X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqg不互补。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求7-10任一所述的核酸抑制物。
12.权利要求7-10任一所述的核酸抑制物或权利要求5或11所述的宿主细胞的用途，用于制备防治有害生物的制剂。
13.一种防治有害生物的制剂，其包含 安全有效量选自以下的物质权利要求7-10任一所述的核酸抑制物或权利要求5或11所述的宿主细胞；以及； 农药学上可接受的载体。
14.权利要求12或13中任一项的制剂，其还包含至少一种选自以下的杀虫剂化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
15.一种防治有害生物的方法，其特征在于，干扰有害生物基因表达，所述的有害生物基因选自减蛋白基因。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求7-10任一所述的核酸抑制物或权利要求5或11所述的宿主细胞喂食和/或喷洒有害生物。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括在植物体内表达特异性干扰有害生物基因表达的干扰分子；所述的有害生物基因选自减蛋白基因。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求7-10任一所述的核酸抑制物导入到植物中。
19.一种植物或其种子，其特征在于，所述植物由权利要求2或3所述的多核苷酸转化获得。
20.如权利要求19所述的植物，其特征在于，所述多核苷酸在植物细胞中表达为dsRNAο
21.如权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求7或8所述的核酸抑制物，或权利要求6或12所述的用途，或权利要求13所述的制剂，或权利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述有害生物是选自昆虫、螨、真菌、酵母、霉菌、细菌、线虫、杂草和寄生虫以及腐生植物。
22.如权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求7或8所述的核酸抑制物，或权利要求6或12所述的用途，或权利要求13所述的制剂，或权利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述的有害生物是昆虫，包括但不限于鳞翅目昆虫、鞘翅目昆虫、半翅目昆虫、以及双翅目昆虫。
23.如权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求7或8所述的核酸抑制物，或权利要求6或12所述的用途，或权利要求13所述的制剂，或权利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述的昆虫选自鳞翅目昆虫，优选为玉米螟或棉铃虫或小菜蛾。
全文摘要
本发明涉及基于RNAi技术防治害虫的新方法。揭示了一个对于防治鳞翅目昆虫有用的靶标基因及其编码的蛋白，基于该靶标基因的核酸序列制备核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主，可有效地杀灭鳞翅目昆虫。本发明还提供了利用同一基因的不同片段，获得昆虫种类特异型和种间广谱型的杀虫制剂和方法。
文档编号C12N15/113GK102796187SQ20121016797
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月25日 优先权日2011年5月27日
发明者苗雪霞, 张 浩, 李海超, 王玉冰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院