专利名称：一种全人源抗IgE单克隆抗体、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术：
超敏反应是指机体受某种抗原物质刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应，常表现为免疫反应性增高，多在机体再次接触相同抗原时发生。超敏反应与免疫应答本质上都是机体对某些抗原物质的特异性免疫应答，但前者主要表现为组织损伤和(或)生理功能紊乱，后者主要表现为生理性防御效应。超敏反应的分类方法很多，但目前大多采用Gell和Coombs (1963)的分类，即根据超敏反应发生的机制和临床特点分为I IV四个型①速发型超敏反应(I型)；②细胞毒型超敏反应(II型)；③免疫复合物型超敏反应(III型)；④迟发型超敏反应(IV型)。I、 II、III型由抗体介导，可经血清被动转移给其它动物；IV型由T细胞介导，可经细胞转移。 超敏反应所致免疫损伤的发生机制十分复杂，临床实践所见往往为混合型，仅以某一型损伤为主。I型超敏反应I型超敏反应又称过敏反应(anaphylaxis)或速发型超敏反应 (immediatehypersensitivity)。其特点是主要由特异性IgE抗体所介导；反应发生迅速、 恢复也较快；反应发生后，通常引起效应器官功能紊乱，而不发生组织细胞损伤；具有明显个体差异及遗传倾向。参与I型超敏反应的主要成分和细胞引起I型超敏反应的抗原物质很多，常见的吸入性变应原主要有植物花粉、尘螨、真菌、人或动物皮屑、羽毛和昆虫成份等；食物变应原主要有牛奶、鸡蛋、鱼、虾、蟹、贝等；药物或其他化学物质如青霉素、普鲁卡因、有机碘、免疫血清、化纤和塑料等，它们通过吸入、食入、注射或接触使机体致敏。引起I型超敏反应的抗体主要是IgE。IgE的重要生物学特性是具有同种组织细胞亲嗜性，通过其Fc片段与自身或同种动物肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的相应受体结合，而使机体处于致敏状态。参与I型超敏反应的主要细胞是肥大细胞和嗜碱性粒细胞， 其中的肥大细胞广泛分布于皮肤粘膜下层及其血管周围的疏松结缔组织中；嗜碱性粒细胞主要存在于血液中，有时可到达炎症部位。这两种细胞的表面有大量高亲和性IgE受体 (Fe ε RI,即I型高亲和力受体)，胞质内含有大量嗜碱性颗粒。细胞表面Fc ε RI与IgE的 Fc片段结合后进入致敏状态。当致敏细胞以一定的方式再次接触相同变应原时，即可激发细胞脱颗粒，释放生物活性介质，产生相应的临床症状。I型超敏反应的发生过程与机制I型超敏反应的发生过程可大致分为三个阶段，即致敏阶段、发敏阶段和效应阶段。其发生基本过程如下1.致敏阶段变应原初次进入机体时，可刺激B细胞增殖分化，并产生IgE抗体。IgE以其Fc片段与靶细胞(组织中的肥大细胞或血液中的嗜碱性粒细胞)表面的Fc ε RI 结合，成为致敏靶细胞，使机体呈致敏状态。通常致敏状态可维持数月至数年。2.发敏阶段相同变应原再次进入致敏机体，通过与致敏靶细胞上两个以上的 IgE分子结合，即可能介导桥联反应，即由双价或多价变应原(过敏原)分子和两个以上的 IgE分子靠近而发生的构型改变。继而导致Fc ε RI聚集，介导细胞脱颗粒释放组胺等物质。3.效应阶段。生物活性介质释放后作用于效应器官，可导致局部或全身性超敏反应的发生。常见的I型超敏反应性疾病在不同动物种属或个体，其易受活性介质攻击的组织器官各异，反应程度和部位也视再次接触变应原的量和进入机体的途经不同而有差异。因此，超敏反应的临床表现在不同种属动物和个体间差异很大。I型超敏反应可表现为全身性和局部性超敏反应。急性全身性超敏反应又称过敏性休克，是发生最为迅速和最为严重的一种超敏反应，如药物过敏性休克和血清过敏性休克等；这类超敏反应性疾病多发生于再次接触变应原后数分钟内，主要表现为烦燥不安、呼吸困难、恶心呕吐、脉博细速、四肢厥冷、血压下降， 以至意识障碍和昏迷、抽搐，严重时可因休克而死亡。局部性超敏反应性疾病较急性全身性超敏反应更为常见，其发生的部位与变应原进入机体的途径有关，如呼吸道超敏反应、消化道超敏反应和皮肤超敏反应等均属于这类反应性疾病。研究表明，IgE介导的呼吸道超敏反应是引起过敏性休克最主要的机制之一。因此，阻断IgE—IgE受体之间的相互作用，就有可能对这类疾病起到减缓病情的作用。抗IgE 单克隆抗体可以抑制IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和力IgE受体(Fe ε RI)结合，从而限制了介导过敏反应的物质的释放。这类抗体还可使嗜碱性粒细胞表面的Fc ε RI 减少，从而达到治疗I型过敏性反应的目的。诺华(Novartis)与Tanox公司联合开发了一种抗IgE人源化抗体药物，商品名 Xolair。该药用于成人及青少年中至重度持续性哮喘，但该药对其他过敏状态尚无安全性及有效性的数据。Xolair是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化，且存在着亲和力不高的问题。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗 IgE 抗体 2E19。更具体地，本发明公开了全人源抗IgE抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 8所示；本发明公开的上述全人源抗IgE抗体，重链氨基酸序列为SEQ ID NO 10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 12所示；本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗IgE抗体；本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗IgE抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :5所示，编码全人源抗IgE抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO 7所示；
本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗IgE抗体重链的核苷酸序列为 SEQ ID NO 9所示，编码全人源抗IgE抗体轻链的核苷酸序列为SEQ IDNO 11所示；本发明还公开了一种表达载体，含有上述的核苷酸序列，为pcDNA3. 1/ZE0(+)或 pcDNA3. 1 (+)；本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为CHO-Kl细胞；本发明进一步公开了上述全人源抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗IgE单链抗体；全人源抗IgE完整抗体分子真核表达载体的构建； 全人源抗IgE完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源抗IgE完整抗体分子的纯化。本发明最后公开了上述的全人源抗体在制备治疗超敏反应性疾病药物中的用途， 其中超敏反应性疾病为I型超敏反应性疾病，包括呼吸道超敏反应、消化道超敏反应和皮肤超敏反应，其中呼吸道超敏反应更具体的为过敏性哮喘。本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明与 Xolair(Omalizumab)比较起来，本发明得到的抗体具有更高的抗体亲和力；并且其可以显著抑制IgE与细胞表面Fc ε RI结合导致的脱颗粒，其抑制程度显著优于Xolair。同时，本发明得到的抗体不与结合于细胞表面Fc ε RI的IgE结合，不会导致体内已致敏靶细胞的 IgE交联及脱颗粒，因此，本发明抗体用于制备治疗抗过敏药物是安全的。
图1.抗IgE抗体2Ε19抑制IgE与可溶性Fc ε RI的结合实验结果；图2.抗IgE抗体2Ε19抑制IgE与细胞表面Fc ε RI的结合实验结果；图3.抗IgE抗体2Ε19抑制与结合于细胞表面Fc ε RI的IgE的结合实验结果；图4.抗IgE抗体2Ε19抑制IgE与细胞表面Fc ε RI的结合所引起脱颗粒的功能
学实验结果。
具体实施例方式以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例抗体的制备(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂anvitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22 :197-207)和文献(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)报道的序列分别设计引物采用 RT-PCR 反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2分别显示了重链恒定区(Ch)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :4分别显示了轻链恒定区(CJ的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/CH 和 pGEM-T/Q。(2) cDNA 的制备收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用iTrizol试剂anvitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出 cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。(3)引物设计参考文献(Immunotechnology，1998，3 :271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)基因的 VHBack，VaFor, VJack 和 \For 引物。VHBack，VaFor, VLBack 和 VLFor 的序列见 Immunotechnology，1998,3 :271_278。其中在 V11Back 引物的 5，端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在V11For引物的5’端加上序 ^lJ gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc,在 VlBack 弓|物的 5，端力口上序列 tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct,在 VLFor 弓|物的 5，端力口上含有 Not I 位点的序列 atg egg ccg C。(4)噬菌体抗体库的构建及筛选采用(2) 4^々cDNAfP (3)中的弓|物，利用 recombinant Phage antibody system 试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phage antibodysystem试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“重组人IgE抗体Fc段”按参考文献(Protein Engineering 8 ；2 (193-199) 1995)，，的方法制备。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人IgE单链抗体 2E19ScFv，测序后获得其基因序列。SEQID NO :5和SEQ ID NO :6分别显示了 2E19kFv重链可变区Vh的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8分别显示了 2E19kFv 轻链可变区\的核苷酸序列和氨基酸序列。(5)全人源抗体在真核细胞中的表达以2E19&FV基因和pGEM_T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG CTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物， 回收目的条带并克隆到PGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段 2E19VhCh,与用 HindIII 和 EcoR I 酶切的质粒 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen 公司)进行连接， 构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (2E19VhCh)。以2E 19kFv基因和pGEM-T/Q截体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟，得到PCR产物，其5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用 HindIII 和 EcoR I 酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段2E19\q，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1/ZE0(+) anvitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (2E19VLCL)。于3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90% -95%融合时进行转染取质粒101^(质粒？(^嫩3.1(+) 0Ε19νΗ(:Η)4μβ，质粒 pcDNA3. 1/ZE0(+) (2E 19VLCL)6y g)禾口 20 μ 1 Lipofectamine2000Reagent (Invitrogen 公司产品)按LipofectamindOOOReagent试剂盒说明书进行转染。转染进行Mh后细胞换含 600 μ g/ml G418 (Invitrogen 公司产品)禾口 250 μ g/ml Zeocin (Invitrogen 公司产品)的 DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc) (KPL公司)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭浊，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myelomalgGl, κ (Sigma)，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ) ((SouthernBiotechnology Associates 公司)进行结合反应，37°C温育 lh，加入 TMB 显色液于37°C作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A45tl值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用I^rotein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体2E19。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQID NO :9和SEQ ID N0:10分别显示了全人源抗体2E19的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :11和SEQ ID N0:12分别显示了全人源抗体2E19的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。实验例实验例1.抗IgE抗体2E19的亲和力检测运用Biacore TlOO 系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)通过表面等离子体激元共振(SPR)检测抗IgE抗体的亲和力常数。将重组人IgE抗体Fc段通过氨基共价结合与CM5 生物传感芯片(Biacore)上，将①全人源抗体2E19 ；②全人源抗体Xolair (Omalizumab， 市售产品国外上市)；③阴性对照抗体Trastuzumab (市售产品)(以PBS/0. 05 % TWEEN-20 (ICI Americas)(去污剂)配溶液，配成不同的浓度(2倍比浓度稀释)，以50 μ 1/ min的流速通过芯片。每次检查之后，用5μ 1 50mM盐酸水溶液以3μ 1/min的流速洗涤，从而将残留的抗体从固定化的配体上洗脱下来。用BIAevalution软件(TlOOevalution 2.0 版，Biacore)，通过非线性回归法分析结合曲线。结果如表1所示，全人源抗体2E19的KD 值为0. 21nM,显著低于全人源抗体Omalizumab，说明全人源抗体2E19对IgE抗体的亲和力高于Omalizumab，实验结果见表1表1亲和力试验结果
抗体Kon (M-1S-Vio5)Koff (IO5S"1)Kd (ηΜ)2Ε192.244.70.21Xolair1.085.50.51TrastuzumabNDNDND实验例2.抗IgE抗体2E19抑制IgE与可溶性Fc ε RI的结合实验人IgE可与其受体Fc ε RI特异结合。辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgE与Fc ε RI 结合的量效曲线应为“S”形，即随着HRP-IgE浓度的增加，显色程度也逐渐增加，直至达到饱和；抗IgE抗体可与IgE的受体结合部位特异结合，并抑制IgE与相应受体Fc ε RI的结合。若反应体系中存在抗IgE抗体对HRP-IgE的竞争，在HRP-IgE浓度一定的条件下，随着加入的抗IgE浓度的增加，Fc ε RI结合的HRP-IgE量逐渐减少，因此量效曲线呈反“S”形； 在包被受体和HRP-IgE相同的条件下，IC50值越小，则说明加入的抗IgE抗体与HRP-IgE竞争的能力越强，即抗体的活性越好。
重组人Fc ε RI (R&D)，用PBS稀释至5 μ g/ml，加入酶标板，100 μ 1/孔，37°C包被2 小时。弃去孔中液体，用含0. 1% Tween20的PBS(PBST)洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。 用PBS将牛血清白蛋白稀释至3%，加入酶标板，加满孔，4°C封闭过夜。弃去孔中液体，用 PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。用PBS将HRP-IgE (IgE为细胞CRL-8033分泌表达， 用Pierce公司HRP标记试剂盒标记获得)稀释至6 μ g/ml，用稀释好的HRP-IgE将全人源抗 IgE 单克隆抗体 2E19、Xolair(Novartis)和阴性对照 Trastuzumab(Genentech)稀释至 100 μ g/ml,并连续2倍比稀释。将稀释好的HRP-IgE将全人源抗IgE单克隆抗体2E19、 Xolair和阴性对照"Trastuzumab加入酶标板中，100 μ 1/孔，设置复孔。37°C反应45分钟。 弃去孔中液体，用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。新鲜配制的TMB显色底物(A液与 B液等体积混合，晶美生物)，100 μ 1/孔加入酶标板，室温避光反应5-10分钟。加入终止液，100 μ 1/孔。酶标仪检测A450nm，630nm为参考波长。结果见表2和图1。表权利要求
1.一种全人源抗IgE单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:8所示。
2.权利要求1所述的全人源抗IgE单克隆抗体，其特征在于，重链氨基酸序列为SEQID NO: 10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID N0:12所示。
3.编码权利要求1所述的全人源抗IgE单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :5所示，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :7所示。
4.编码权利要求2所述的全人源抗IgE单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链的核苷酸序列为SEQ ID NO 9所示，轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO 11所示。
5.含有权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体，为pcDNA3.1/ZE0⑴或 pcDNA3. 1 (+)。
6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞，为CHO-Kl细胞。
7.权利要求1或2所述的全人源抗IgE单克隆抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗IgE单链抗体、全人源抗IgE完整抗体分子真核表达载体的构建、全人源抗IgE完整抗体分子在CHO细胞中的表达和全人源抗IgE完整抗体分子的纯化四个步骤。
8.权利要求1或2所述的全人源抗IgE单克隆抗体在制备治疗超敏反应性疾病药物中的用途，其中超敏反应性疾病为I型超敏反应性疾病。
9.权利要求8所述的用途，其中I型超敏反应性疾病包括呼吸道超敏反应、消化道超敏反应和皮肤超敏反应。
10.权利要求9所述的用途，其中呼吸道超敏反应为过敏性哮喘。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗IgE单克隆抗体、其制备方法及用途。本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗IgE抗体2E19，其重链可变区氨基酸序列为SEQID NO6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO8所示。本发明还公开了2E19抗体的制备方法以及编码2E19抗体的核苷酸序列、含该核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的2E19抗体具有更高的抗体亲和力，可显著抑制IgE与细胞表面Fc RI结合导致的脱颗粒，并且不与结合于细胞表面FcεRI的IgE结合。本发明的2E19抗体可用于制备治疗超敏反应性疾病药物，尤其是治疗过敏性哮喘。
文档编号A61P11/06GK102167745SQ20101012524
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月25日 优先权日2010年2月25日
发明者王淑蕙, 聂丽, 郭怀祖 申请人:百迈博药业有限公司