一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗的制作方法

专利名称：一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于涉及生物制药领域。具体而言，本发明涉及一种嗜水气单胞菌口服疫 苗。更具体地说，本发明涉及微囊抗原传递系统及基于此开发的嗜水气单胞菌微囊口服疫 苗，该疫苗可用于预防嗜水气单胞菌病引起的出血性败血症。也可将该微囊抗原传递系统 应用于鱼类其它病原的口服疫苗的开发。
背景技术：
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)可引起鱼类、两栖类和爬行类动物爆 发出血性败血症，导致淡水鱼皮肤出血(出血性败血症)和大量死亡，给规模化淡水鱼养殖 业带来了巨大经济损失。应用抗生素等传统疗法易诱发细菌耐药，药物残留及环境生态破 坏等一系列问题。目前所开发的嗜水气单胞菌疫苗(全菌疫苗、基因工程疫苗)均为注射免疫或浸 泡免疫。虽然与注射免疫、浸泡免疫相比，口服免疫效果较差，但鱼口服免疫具有使用方便、 安全好、鱼群应激小、适于规模化及重复免疫等特点，有望成为最有前景的鱼类免疫途径。 由于鱼类胃酸性环境及肠内消化酶的破坏，传统疫苗到达肠粘膜之前被大量降解，即使有 少量的抗原到达肠粘膜也无法形成持续性的免疫刺激，很难诱发高效的免疫应答，而通过 增加免疫剂量或免疫次数来提高免疫效果又大大提高了免疫成本，免疫效果较差。近年来， 国内外许多学者先后利用各种聚合物微囊传递系统开展口服疫苗研究。2006年A. P. Rodrigues等人利用植物油乳化法研制嗜水气单胞菌海藻酸钠口服 疫苗，但所制备微球的粒径较大，平均粒径约为50 ym，不符合理想微球的粒径要求(10 ym 左右)，可能会影响抗原提呈细胞对微球的摄取，动物免疫试验效果未见报道。海藻酸钠(C6H708Na)n是由a -L-甘露糖醛酸(M单元)与0 _D_古罗糖醛酸(G单 元)依靠1，4_糖苷键连接而组成的线性共聚物。海藻酸钠粉末遇水变湿，可缓慢的完全水 化并溶解。海藻酸盐可通过其古罗糖酸的钠离子与二价阳离子(Ca2+、Ba2+)交换而瞬时凝 胶化成球。壳聚糖是通过甲壳素脱乙酰化制备的天然高分子直链多糖。由于壳聚糖分子链 上有大量的伯氨基，海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，壳聚糖和海藻酸钠可以通过正、负 电荷吸引形成聚电解质膜。微囊抗原传递系统应具有保护抗原的免疫原性及促进抗原提呈 细胞对抗原的摄取的作用。海藻酸钙微球对酸性环境具有抵抗性，而壳聚糖对碱性环境具 有抵抗性。两者形成的微囊对抗原的保护性较好，但如何调整微囊的粒径，使其更易被抗原 提呈细胞所捕获，以及如何控制微囊对抗原的缓释等问题成为本研究的焦点与难点。

发明内容
技术问题本发明的目的在于开发一种在鱼类消化系统中相对稳定，粒径适中，易被巨噬细 胞捕获，具有缓释性和抗原保护性，且生物相容性好的微囊抗原传递系统。并将该微囊抗原 传递系统应用于嗜水气单胞菌，开发出嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，以克服灭活疫苗直接口服免疫效果差的缺陷。以鲫鱼为模型动物，验证了该口服疫苗的免疫效应。该疫苗可用 于鱼类嗜水气单胞菌所引起的出血性败血症的免疫预防。技术方案一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，其中包括海藻酸钙_壳聚糖控释微囊以及包封 于所述微囊中的灭活嗜水气单胞菌。包括1. 1疫苗株的筛选本发明中所使用的疫苗株为本实验室分离并保存的嗜水气单胞菌J-1株。J-1株， 属嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO. 3220。1.2灭活全菌菌液的制备将嗜水气单胞菌J-1株复壮后于28°C下扩大培养，经0.4%的福尔马林灭活后，用 PH7. 2的PBS液洗涤细菌，将细菌浓度调整为1. OX 101(lCfu/mL。1. 3嗜水气单胞菌海藻酸钙_壳聚糖微囊(Ah-ACMS) 口服疫苗的制备在均质勻浆机的搅动下，将一定量的海藻酸钠，上述灭活菌液及一定量的生理盐 水混合，配成海藻酸钠_抗原乳浊液(海藻酸钠浓度为2. 0% W/V)。该乳浊液经喷雾干燥 机雾化后直接喷入经磁力搅拌机搅动的含5% CaCl2的PBS溶液中，形成海藻酸钙微囊，经 离心，收集海藻酸钙微囊。在均质勻浆机的搅动下，将所收集海藻酸钙微囊，分散到0. 2%的 壳聚糖溶液中。离心后，收集海藻酸钙-壳聚糖微囊。再将收集的微囊，分散到8%的甘露 醇溶液中，混均，冷冻干燥后，封盖包装。其中所述的海藻酸钙_壳聚糖控释微囊包裹灭活 嗜水气单胞菌的包封率(96. 52士0. 17) %，载菌量(2. 41 士0. 32) X 108cfu/mg。其中所述的 海藻酸钙_壳聚糖控释微囊的粒径为11. 01 y m。2. 1含有嗜水气单胞菌微囊口服疫苗的鱼用饵料的制备将所制备的嗜水气单胞菌微囊口服疫苗与一定量的经去水浸泡软化过的商品化 鱼用饲料粉末混合后，压制成条，晾干，制成颗粒。2. 2嗜水气单胞菌微囊口服疫苗的用法免疫途径口服免疫。对鱼群禁食24h后，将一定量的含有嗜水气单胞菌微囊口服 疫苗的鱼饲料颗粒投入水中，供鱼群自由采食。免疫剂量为每克体重的鱼投放微囊口服疫 苗0.2mg(即每克体重的鱼免疫细菌5.0X107CFU)。首免10天后，进行二免，用法及剂量 同前。有益效果1.壁材来源广泛本研究所使用的壁材为天然高分子材料，其来源广泛，价格低 廉且具有免疫增强作用，已被FDA批准用于药物的添加剂或辅料，安全，无毒性。2.制作工艺简单本研究所采用的改良喷雾-离子交联技术，制作工艺简单，成 本较低，有利用工业化生产。制备工艺所用试剂安全，低毒，制备过程中未产生有毒物质。3.微囊性状较理想所制备微囊圆整，平均粒径较小(11. 010士0. 145 u m)，粒径 分布较均勻；抗原包被率约(96. 52 士 0. 17) 载药量为(2. 41 士 0. 32) X 108cfu/mg ；微囊在 模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性；微囊中细菌抗原性保持良好，安全性 与储存稳定性较好。
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4.储存及运输方便本疫苗在常温下(25°C)保存9个月以上而保持良好的抗原 性。节约了冰冻冷藏与运输的成本，便于推广。5.操作方便，免疫效果较好 口服免疫对动物的应激小，操作方便，人力成本低， 便于规模化推广。该疫苗无异味，适口性良好，鱼群易采食，免疫效果较好。6.应用前景广阔所开发的微囊抗原传递系统对可抵抗胃肠中酸碱环境的刺激， 对抗原的保护较好，且具有缓释作用，可对机体形成脉冲式刺激，可推广应用于鱼类其它病 原的口服疫苗的开发，加快鱼类口服疫苗的研究进程。


图 lAh-ACMS 的形态(X 400 倍)图 2Ah_ACMS 的形态(X 200 倍)图3空白的ACMS的形态(X 400倍)
图4Ah_ACMS微囊口服疫苗粒径分布曲线图5不同pH下微囊释菌时间与积累释放百分率曲线(12h)图6不同pH下微囊释菌时间与积累释放百分率曲线(120h)图7各组鲫鱼血清凝集抗体随时间的动态变化图8头肾巨噬细胞吞噬活性比较
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例 仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所 有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用 的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常采用常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York :Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。(一 )嗜水气单胞菌海藻酸钠-壳聚糖微囊(Ah-ACMS) 口服疫苗的制备1. 1疫苗株的选择本发明中所使用的疫苗株为嗜水气单胞菌J-1株(Ah J)，系从江苏发病鱼分离而 得。属嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC N0. 3220。该菌为革兰阴性短杆菌，有时亦可呈双球状或丝状。在普通营养琼脂上即可生长， 25°C培养48h菌落直径可达2 3mm，表面光滑。在血平板上可产生3溶血圈。在麦康凯 培养基上生长良好，在弧菌选择培养基TCBS或在6% NaCl中不生长，对弧菌抑制菌0/129 不敏感，多数不发酵乳糖，氧化酶阳性。此外关键的生化指标为葡萄糖产气，发酵甘露醇、 蔗糖，利用阿拉伯糖，水解七叶苷/水杨苷，鸟氨酸脱羧酶阴性。如上述6项指标符合，则可 判定为嗜水气单胞菌。气单胞菌有广泛的致病性，感染包括冷血动物在内的多种动物如鱼 类、禽类及哺乳类，引致败血症或皮肤溃疡等局部感染，是水生动物尤其是鱼类最常见的致 病菌，在水温高的夏季可造成暴发流行。人类感染运动性气单胞菌引致急性胃肠炎等，目前 在国外已将本菌纳入腹泻病原菌的常规检测范围，是食品卫生检验的对象。
1.2灭活疫苗的制备将经感染鲫鱼复壮的Ah J:接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于28°C， 150rpm,摇振培养24h。染色镜检后，加入终浓度为0. 4%的福尔马林，于28°C下作用3h后， 4°C下作用24h。然后取少量灭活后的菌液接种LB肉汤，于28°C，摇振培养24h，以检验灭 活是否彻底。将完全灭活的菌液于8000rpm离心lOmin后，用pH 7. 2的PBS液洗涤细菌三 次。将细菌终浓度调节为l.OXKTcfu/mLdt保存备用。1. 3嗜水气单胞菌海藻酸钠_壳聚糖微囊(Ah-ACMS) 口服疫苗的制备根据表1正交设计方案，设立9个水平，对影响微囊口服疫苗特性的细菌浓度、 海藻酸钠浓度、喷雾速度及搅拌速度等主要技术参数进行正交筛选，根据粒径、载菌量、 生产效率及微囊的缓释性等特性，确立了如下最优制备工艺取一定量的上述细菌悬液， 8000rpm离心lOmin后，用pH7. 2的PBS液重悬，调整细菌浓度为5. 0X 109cfu/mL。称取一定 量的海藻酸钠(SA)，加入到上述菌液中，利用均质勻浆机15000rpm，作用5min，使海藻酸钠 完全溶解并形成海藻酸钠_细菌乳浊液(SA浓度为2. 0% W/V)。将喷雾干燥机参数设置如 下喷嘴直径0. 5mm ；进风温度25°C ；出风温度25°C ；气流3bar ；喷雾速度7mL/min ；通 针20次/min。用500mL的烧杯盛放10倍于上述海藻酸钠溶液体积的含5% CaCl2的PBS 溶液，将其置于磁力搅拌机上，调整转速为800rpm。启动喷雾干燥机，将海藻酸钠-细菌乳 浊液以7mL/min的速度直接喷雾于上述含5% CaCl2的PBS溶液中。喷雾结束后，继续搅拌 20min，以防海藻酸钙微囊(SA-MS)间黏连。lOOOrpm离心5min，用灭菌的PBS液洗涤微囊3 次，收集海藻酸钙微囊。将所收集海藻酸钙微囊，分散到0.2%的壳聚糖溶液(壳聚糖溶液 与上述的海藻酸钠溶液体积比为1 1)中，均质勻浆机1 lOOOrpm，作用5min。lOOOrpm离 心5min，然后用灭菌的PBS液洗涤嗜水气单胞菌海藻酸钙-壳聚糖微囊(Ah-ACMS) 3次，收 集微囊，即得本发明所述嗜水气单胞菌微囊口服疫苗。将上述嗜水气单胞菌海藻酸钙_壳 聚糖微囊，分散到8 %的甘露醇溶液中，混勻后，于_40°C冰箱冷冻，再冷冻干燥15h，封盖包 装。表lAh-ACMS制备工艺参数之正交设计结果 1. 4含有嗜水气单胞菌微囊口服疫苗的鱼用饲料的制备用水浸润商品化鱼用饲料粉末，使其搅拌后呈糊状。将1. 3中所制备的嗜水气单 胞菌海藻酸钠-壳聚糖微囊口服疫苗加入到饲料糊中，搅拌均勻。按每天投喂鱼体重的 的饲料计算加入微囊口服量(鱼免疫时应采食5. OX 107cfu/g/天的菌量)。压制成条，晾 干，制成颗粒，常温保存，避免潮湿。( 二)嗜水气单胞菌微囊口服疫苗的体外评价本实施例中对实施例1中制备的嗜水气单胞菌海藻酸钙-壳聚糖微囊口服疫苗的 微囊形态、直径大小与分布、包被效率与载菌量、体外模拟释放特征、抗原稳定性、安全性及 储存稳定性等主要特征分别进行了测评。2. 1形态学观察分别取冻干前后的Ah-ACMS少许，分散于pH 7. 2的PBS液中，然后利用Nikon eclipseTSlOO型倒置显微镜于X200倍，X400倍下观察粒径形态，并利用Nikon DS-L数 码显微成像系统采集图像。成像结果见图1-图3。从图1可以看出，微囊基本呈圆形，粒径相对均一，表面较粗糙，有明显的褶皱，微 囊表面可见许多黑色小点，为未被完全包被的细菌。2. 2粒径平均大小与分布按1. 3中优化后的制备工艺制备微囊，按2. 1中的方法采集微囊图象(X400)，随 机选取800-1000个微球，利用捷达JEDA 801D形态学图象分析系统测量其直径大小，利用 SPSS 11. 5统计学软件对直径分布情况进行统计分析。Ah-ACMS微囊口服疫苗粒径分布曲 线见图4。从图4可以看出微囊粒径平均值为11. 010士0. 145 iim。粒径分布较集中，70% 的微囊分布于5-14 ym，83%的微囊粒径小于15 ym，基本符合理想微囊传递系统的粒径标准。2. 3包被率与载药量测定按1. 3中优化后的制备工艺分别制备含有灭活全菌与不含细菌的SA-MS悬液各 100mL。500rpm离心5min，分别收集上清。上清液经直径为15cm的中速定性滤纸(双圈牌， 型号102)过滤，分别收集两份滤液，以不含细菌的SA-MS滤液为空白对照，经紫外分光光 度计(Bio-Rad Smart Spec TM 3000)测定含有灭活全菌的SA-MS滤液在600nm的吸光值。 以确定滤液中未包被的细菌量(cfu)。将等量的Ah-ACMS干燥后称重(mg)。按照下式分别 计算包封率(％ )和载菌量(cfu/mg)。
7 按此方案制备的Ah-ACMS，包封率约(96. 52士0. 17) %，包封率高，抗原损失少。载 菌量高，约(2.41±0.32)X 108cfU/mg。具有理想载药微囊高包封率，高载药量的特性。2. 4体外模拟释放试验用去离子水配制pH = 2. 0PBS，pH = 7. 0PBS 及 pH = 10Tris-Hcl 缓冲液各 500mL。 分别取适量的空白海藻酸钠-壳聚糖微囊(ACMS (不含细菌)和Ah-ACMS (含细菌)悬浊液 (约含0. 2g微囊)，离心，收集微囊，分别重悬于20mL上述三种缓冲液中，磁力加热搅拌机 搅拌，加热，使溶液温度维持在25°C左右。每间隔一定的时间，将溶液于500rpm离心5min。 将微囊重新分散于20mL的新鲜的相应缓冲液中。离心所得上清经中速定性滤纸(双圈牌， 型号102)过滤，收集滤液，lOOOOrpm离心lOmin，浓缩滤液至lmL。以空白ACMS滤液为空 白对照，利用紫外分光光度计测定已释放细菌量。绘制不同PH下微囊释菌时间与积累释放 百分率曲线，见图5和图6。由图5可知，微囊在酸性和中性条件下的释放曲线相似，释放过程较缓慢，前12小 时，释放率小于10%，微囊形态变化不明显，未发生明显溶胀，即所制备的微囊能够胃内酸 性环境的降解及中性溶液的溶胀作用。而在碱性条件(pH= 10)下，0-4h微囊对细菌的缓 释作用不明显，这可能与外层壳聚糖对碱液的抵抗有关。4-12h，微囊的释放作用明显加快， 且微囊膨胀，粒径增大，说明所制备Ah-ACMS在碱性条件下不稳定。由图6可知，微囊在前 24小时内，有较明显的突释现象。作用120h后，pH= 10时，有72%的细菌释放，而中性条 件下仅有33%左右，说明该微囊具有较好的缓释作用。2. 5疫苗抗原稳定性分析收集从冻干Ah-ACM中释放的细菌取冻干后的Ah-ACMS约0. 2g，于20mL 3%的柠 檬酸三钠溶液(pH= 10，NaoH调节)中，磁力加热搅拌机搅拌，加热，37°C作用5h。经中速定 性滤纸过滤后，lOOOOrpm离心10min，pH = 7的PBS溶液重悬细菌至10mL(浓度约108cfu/ mL)。SDS-PAGE 取灭活前、灭活后(福尔马林灭活，按照1. 2中所述方法)、冻干微囊所 释放的菌液各lmL，lOOOOrpm离心lmin，收集菌体。加入100 u L SDS-PAGE上样缓冲液重 悬，煮沸lOmin，12000rpm离心3min，上清用于SDS-PAGE。配制含12%的丙烯酰胺的凝胶。 80V稳压电泳30min后，120V电泳2h左右，至溴酚蓝前沿迁移至胶下缘时结束电泳。从活 的Ah J:，灭活Ah丄及Ah-ACMS中释放的Ah 的菌体蛋白质电泳结果可知，试验处理前后 蛋白条带基本无差异。Western blot 电泳结束后，先将胶取出，用去离子水清洗一次。切割与待转印胶 等大的滤纸和PVDF膜，并将PVDF膜在甲醇中浸泡5min。滤纸用转印缓冲液湿润后，按照 (+)滤纸-膜-胶-滤纸(_)的顺序依次搭好，放入转印仪中(在放置各层时一定要排除气 泡)，采用半干转移法将其转移至PVDF膜上。转印结束后，PVDF膜用5%脱脂乳4°C封闭过夜。一抗为用灭活的J-1株Ah菌体蛋白制备的兔抗血清(1 2000倍稀释)。二抗为辣根 过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1 2000倍稀释)，以二氨基联苯胺(DAB)显色。Western blot检测结果可知，从Ah-ACMS中释放的细菌能够与兔抗Ah血清发生免 疫反应，且条带清晰。说明微囊制备工艺较温和，未对菌体蛋白的抗原性造成明显破坏。2. 6安全性评价试验选取10只6周龄昆明系健康小鼠，雄雌各半。按正常免疫剂量的10倍(Ah-ACMS 0. 05g/只，含细菌lCTcfu)经口用药，连续灌胃一周。正常饲养，观察一周内小鼠中毒症状、 死亡情况及剖检观察肝脏、肾脏的病变情况。观察发现，按正常免疫剂量的10倍(Ah-ACMS约0. 05g/只)经口灌胃一周后，小 鼠表现活泼，无中毒或死亡情况发生，剖检发现试验小鼠肝肾均无肿大或坏死。表明在微囊 制备过程中，未产生具有毒性的物质，两者作为抗原载体安全、可靠。2. 7储存稳定性试验将制备的Ah-ACMS疫苗，分装于5mL西林瓶中，冻干后加盖密封，分别于_20°C， 4°C，25°C下保存。并于第0，3，6，9月末取样检测，对微囊疫苗的外观、溶解性、粒径大小、抗 原性、缓释性等主要指标进行测定。以从Ah-ACMS中释放的Ah与兔抗Ah阳性血清的凝集 反应性及Ah全菌蛋白的Western blot结果来评定疫苗的在不同时间点的抗原稳定性。以 50 %细菌释放所用时间评价微囊的缓释性。，结果见表2。表2Ah_ACMS储存稳定性试验 从表2可知，Ah-ACMS疫苗冻干制剂在不同的检验时间点，外观均为白色疏松粉末，在水中溶解性良好，无明显沉淀。在不同的温度条件下，微囊的粒径虽有不同程度的膨 胀，但差异不显著(P > 0. 05)，平均粒径均小于13 u m,基本符合理想微囊口服疫苗的粒径 要求。所释放细菌均可与兔抗Ah阳性血清发生凝集反应，western blot条带清晰，表明细 菌蛋白仍具有良好的免疫原性。随着保存期的增长，50%细菌释放所需要的时间减少，微囊 的突释性增强，但仍有良好的缓释效果。所开发的Ah-ACMS疫苗在不同温度条件下至少可 稳定储存9个月，常温下性质稳定，摆脱了对冷藏链的依赖，降低了储存与运输成本。实施例3Ah_ACMS 口服疫苗的的免疫保护效果以120_150g的银鲫作为模型动物，饲养于300L的玻璃缸中，以曝气后的自来水饲 养银鲫，利用充氧泵不断充氧。定时投喂商品化的颗粒饲料，换水及清理固体代谢物。鲫鱼 经一周驯化，进食正常后，开始试验。按照以下方案来验证本发明所述Ah-ACMS 口服疫苗对 鲫鱼的免疫效应。3.1免疫程序试验鱼共分六组，每组40条，免疫前禁食24h，按照表3方案进行免疫。口服对照 组每次按鱼体重的分别于8:00点，12:00点，16:00点投喂含有疫苗的饲料颗粒；Ah 口 服及注射对照组采用Ah灭活疫苗，注射组通过腹腔注射免疫；空白对照组投喂普通商品化 鱼饲料。在试验过程中，密切监视鲫鱼的采食状况。水温约为18-25°C。表3试验分组与免疫程序 3. 2血清凝集抗体效价按照表3中的时间点，从尾静脉采集血液样本。于4°C放置过夜，凝固后，3000rpm， 离心5min，分离血清，冻存于-20°C，待检。利用改良的玻板凝集试验测定。简述如下取 50 uL免疫组(或对照组)血清用50 y L PBS溶液(pH 7. 2)倍比稀释，然后加入50 y L热 灭活的嗜水气单胞菌悬液(浓度约为109cfu/mL)，混合均勻后，置于湿盒中，室温下过夜，于 显微镜下(X40倍)观察细菌凝集情况。抗体的效价以能够引起细菌液发生凝集的最大血 清稀释倍数表示。结果见图7。初次免疫后第二周开始，各组相继出现血清凝集抗体，微囊口服组(组I、II、III) 与全菌注射组(组V)的凝集抗体水平明显高于空白对照组(组VI)与全菌口服组(组IV) (P < 0. 05, n = 3)。组V首免后14d开始出现凝集抗体，28_35d抗体达到峰值，凝集抗体 明显高于其他各组，而42d时抗体出现下降趋势；组I、II在14-35d缓慢上升，在35d左右达到高峰，42d时略有下降。而组III42d时，凝集抗体仍有上升趋势。组IV与组VI的凝集 抗体一直处于低水平状态，体液免疫水平低。3. 3巨噬细胞吞噬活性3. 3. 1头肾巨噬细胞的分离第三次免疫后两周，参照Braim-Nesje等人的方法，从鲫鱼头肾中分离巨噬细胞。无菌操作打开腹腔，剪取头肾。用冷的Hank’ s液洗2-3次，用无菌注射器柱芯于200目 不锈钢网细胞筛上研磨，收集过滤的单细胞悬液，1500rpm离心15min，Hank’ s液洗涤细 胞两次，弃上清，细胞沉淀用L-15培养液(内含100IU/mL青链霉素，10%胎牛血清，IOIU/ mL肝素)重悬。单细胞悬液利用不连续的梯度离心法(Percoll gradient, Sigma.密度 1. 08-1. 07)，40C，400g,离心40min。收集巨噬细胞层，利用L-15培养液洗涤两次，弃上清， 利用L-15培养液(含10%胎牛血清)重悬细胞，利用细胞计数板计数。用台盼蓝液检测细 胞活力。调整细胞浓度为1. 0 X IO6个/mL。3. 3. 2巨噬细胞杀细菌活性检测无菌生理盐水调节新培养的嗜水气单胞菌(Ah J1)的浓度至1.0X107cfu/mL，取 菌液IOOyL与IOOyL的巨噬细胞悬液(LOXlO6ceIls)于96孔细胞培养板中混勻，然后 加入50 μ L的新鲜的鲫鱼血清，混勻后，在28°C水浴下孵育2小时，其间偶尔晃动一下。2 小时后，取0. 2mL上述混合液与0. SmL无菌生理盐水混勻，以释放未被巨噬细胞吞噬的活的 嗜水气单胞菌。将菌液经倍比稀释后，取200 μ L平铺LB固体培养板，28°C下培养过夜，统
计菌落数目，按下式计算巨噬细胞吞噬率。
巨噬细胞巨噬细胞作用后Ah活菌浓度
吞噬率(％)原混合液中Ah总浓度(8X105cfu/mL)第三次免疫后两周各组的吞噬活性比较见图8。经方差分析，组I、II、III、V间巨 噬细胞对活的Ah菌液的杀伤能力有显著的差别(P < 0. 05)，显著高于组VI和组IV，组III 的巨噬细胞吞噬能力最强，达(45. 25士 1. 98) %。但组IV巨噬细胞对细菌的杀伤能力与空 白对照组(组VI)间没有显著差异(P > 0. 05)。3. 4鲫鱼的半数致死量的测定将LB液体培养基培养获得2. 4X IO9CfuAiL的Ah J1菌液，按10倍比依次稀释 KT1-KT4倍，取各稀释度的细菌悬液分别腹腔接种10尾鲫鱼，每尾0. 5mL。同时设空白对照 组，腹腔注射PBS，0. 5mL/尾。记录各组死亡数，利用Reed-Mueneh法计算Ah J1菌对鲫鱼 的半数致死量为1. 26 X IO6Cfu/尾3. 5相对保护率的测定免疫过后两周，从各组分别取30尾鲫鱼，腹腔注射约50 X LD5tl (即6. 3 X IO7Cfu/ 尾)。攻毒后连续观察7天，逐日记录死亡情况。从死亡鱼内脏器官分离病原菌，并对病原 菌进行鉴定。计算各组相对保护率(RPS)。
免疫鲫鱼的死亡率
空白对照组鲫鱼的死亡率攻毒后24_56h出现死亡高峰，在攻毒5天后不再出现死亡。所有死亡鲫鱼Ah检测均呈阳性。各组相对保护率见下表4。ACMS高剂量组、ACMS低剂量组、ACMS佐剂组、Ah 注射对照组的相对保护率分别为39. 3 %，32. 1 %，50. O %，82. 1 %。佐剂显著增强了微囊口 服疫苗的免疫效果，使口服疫苗对鲫鱼的保护效率提高了 17. 9%。表4各组鲫鱼对Ah J1株攻击的死亡率与相对保护率 本发明所利用改良喷雾-离子交联技术制备嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，工艺简 单，制备条件温和，最大程度的保护抗原活性。微囊口服疫苗是通过吞噬细胞等抗原提呈细 胞的吞噬作用而具有靶向作用的，微囊的大小对体内微囊的吞噬有直接的影响。本发明的 一个最大的难点是通过适当的制备工艺将微囊粒径控制在可被抗原提呈细胞捕获的范围 内。一般认为，哺乳动物的微囊口服疫苗的粒径以小于10 μ m且高抗原承载量与稳定性为 理想，但Romalde等人报道，其利用喷雾干燥法制备的直径约30 μ m的海藻酸钠格氏乳球菌 微囊口服免疫鳟鱼取得了良好免疫效果。本发明所制备的微囊的大小在10. 009-15. 068 μ m 之间，最佳制备工艺所得微囊的粒径为11. 010士0. 145 μ m。由于鱼类口服免疫后，抗原的捕 获与提呈等过程尚不清楚，基本可认为所制备疫苗符合试验要求。所制备的Ah-ACMS只有在鱼胃内酸性环境下稳定，而在肠道内缓慢释放，才能不 断刺激肠道内的免疫细胞，取得满意的免疫反应。据Rodrigues报道，罗非鱼在饮食后，其 胃内的PH约为2.0，而其肠道内的pH约为10.0，而食物在鱼类体内的平均停留时间约为 12h。所制备的微囊对酸性(pH = 2)和中性(pH = 7)条件抵抗力较强，在碱性(pH = 10) 条件下，表现出突释性。可以预测该传递系统在鱼类消化性统中应同时具有抗原保护和缓 释的作用。综上所述，本发明以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，利用改良喷雾与离子交联技术 制备了生物相容性好，性质稳定的嗜水气单胞菌微囊口服疫苗。(1)通过对影响微囊粒 径的细菌浓度、海藻酸钠浓度、喷雾速度及搅拌速度等主要技术参数进行正交筛选，确 定了最优的生产制备参数；(2)按照优化的工艺所制备的微囊，外形圆整，平均粒径为 11. 010士0. 145 μ m，粒径大小较均勻，符合吞噬细胞等抗原提呈细胞吞噬微囊所需的粒径 要求。抗原包被率高达(96. 52士0. 17)%，抗原损失少；载药量约为(2.41士0. 32) X IO8Cfu/ mg，微囊载菌量较高，易刺激机体产生免疫应答，符合理想微囊标准；(3)所制备微囊在模 拟胃肠条件下稳定，其细菌释放具有酸碱依赖性，突释性与缓释作用明显，可持续的释放 抗原，不断诱导机体产生免疫应答；(4)制备条件温和，生产工艺简单，且成本低，安全性良 好，易于产业化；在影响鱼类疫苗效果的多种因素中，免疫途径对疫苗保护效率显著影响。实际上， 疫苗接种途径可显著影响疫苗抗原成分到达鱼类免疫效应部位的效率。业已证明嗜水气单胞菌灭活疫苗肌肉注射可取得较好的免疫效果，而浸泡免疫效果次之。为把具有免疫原 性的抗原送至能够刺激鱼产生免疫应答的后肠，本研究开发了海藻酸钙-壳聚糖微囊抗原 传递系统。所开发微囊疫苗对Ah感染可提供一定的免疫保护(相对保护39.3%)，佐剂 IMS1312使得微囊疫苗的相对保护率由32. 升到50. 0%，说明该口服佐剂可增强微囊 口服疫苗的免疫原性。灭活全菌直接拌料口服对活菌的攻击不能提供保护(相对保护率 为-3.6% )，可能是细菌在到达鲫鱼肠道后段前其抗原表位大部分已被破坏或降解，抗原 摄取量少。而所开发微囊传递系统可抵抗胃酸及蛋白酶对抗原的破坏，此外，微囊的靶向 性、缓释性及壁材(海藻酸钠、壳聚糖)的免疫增强性均可使其免疫原性得以保护。
权利要求
一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，其中包括海藻酸钙-壳聚糖控释微囊以及包封于所述微囊中的灭活嗜水气单胞菌。
2.如权利要求1所述的嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，其中所述的海藻酸钙-壳聚糖控 释微囊包裹灭活嗜水气单胞菌的包封率(96. 52士0. 17) %，载菌量(2. 41 士0. 32) X 108cfu/ mg0
3.如权利要求1或2所述的嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，其中所述的海藻酸钙_壳聚 糖控释微囊的粒径为ll.Olym。
4.如权利要求1或2所述的嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，其中所述的嗜水气单胞菌为 J-1株，属嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，该菌株已于2009年8月6日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC N0. 3220。
全文摘要
本发明涉及一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗。其属于生物制药领域。以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，嗜水气单胞菌灭活全菌作芯材，利用改良的喷雾及离子交联技术制备嗜水气单胞菌微囊口服疫苗。利用该嗜水气单胞菌海藻酸钙-壳聚糖微囊口服疫苗分别免疫小鼠和鲫鱼，能够显著提高两者的巨噬细胞吞噬活性、脾脏淋巴细胞转化率及IFN-γ，IL-4等细胞因子的表达量。其对鲫鱼的相对保护率为39.3％。微囊在模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性；微囊中细菌抗原性保持良好，疫苗安全性与储存稳定性较好。
文档编号A61K39/106GK101862308SQ20101012506
公开日2010年10月20日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者姚火春, 曲向阳, 陆承平 申请人:南京农业大学