预防和治疗血管新生的小分子多肽及其应用的制作方法

专利名称：：预防和治疗血管新生的小分子多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种新型的、预防和治疗血管新生的小分子多肽，称之为AU6。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术：
：血管新生即在己有的血管系统中长出新生毛细血管的过程，是胚胎发育、伤口愈合、组织再生和修复所必需的生理变化，但同时也是多种全身和局部疾病的病理基础，前者包括新生血管性眼病、肿瘤新生血管、风湿性关节炎、银屑病等。血管新生涉及一个复杂的多步骤过程，包括血管内皮细胞的增殖、迁移、侵蚀及管腔形成等。血管新生受到促血管因子和抑血管因子平衡的严格调控，这种平衡被打破可启动血管生成的细胞信号，从而导致病理性新生血管发生。血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是这--复杂的血管新生级联反应的中心诱导介质，并且特异性作用于血管内皮细胞。人类VEGF基因由8个外显子和7个内含子组成，长约14kb。由于RNA剪切方式的不同，VEGF家族至少包含4个成员，分别为VEGFm、VEGF165、VEGF，禾卩VEGF2()6，其中VEGF165是最主要的异构体。新生血管性眼病是一类具有广泛破坏性的、可累及整个眼球的致盲性眼疾，发病率高，包括老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、角膜感染和新生血管性青光眼等。继发于眼部新生血管的出血、渗出和纤维化等病变还严重影响了患病个体的视觉质量和生活质量。然而，目前该类疾病治疗的方法仍然十分有限，效果欠理想，安全性尚有待进一步认定。。在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和4脉络膜新生血管。第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)，它由纤溶酶原Kringle结构域1-4(plasminogenKrmglel-4)组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
发明内容本发明的目的是提供一种适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽-AU6多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]—[Xaa7](I)式中，Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；Xaal是选自下组的氨基酸Tyr或Phe;Xaa2是选自下组的氨基酸Arg或Lys;Xaa3是选自下组的氨基酸Gly或Ala;Xaa4是选自下组的氨基酸Lys或Arg;Xaa5是选自下组的氨基酸Lys或Arg;Xaa6是选自下组的氨基酸Ala、Val、Leu、或Ile;Xaa7是无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。在另一优选例中，XaaO和Xaa7为无。在另一优选例中，Xaa2为Arg，Xaa4为Lys和Xaa5为Lys。在另一优选例中，所述多肽选自下组(a)具有YRGKKA(SEQIDNO:l)所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQIDN0:l所示氨基酸序列经过l-2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜，包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。在另一优选例中，所述的对象是人。在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了AU6多肽对鸡胚尿囊膜血管新生的影响。A.PBS组尿囊膜血管新生情况。B.50pgAU6干预组尿囊膜血管新生情况。C.各组鸡胚尿囊膜微血管数，n=9-15，"p<0.01vsPBS组。图2显示了AU6多肽对VEGF诱导小鼠角膜血管新生的影响。A.VEGF诱导角膜新生血管情况。B.2.0pgAU6干预后角膜新生血管情况。C.各组角膜新生血管最长血管长度、累及钟点数和面积，n=10,**p<0.01vs对照组。图3显示了AU6多肽对缺氧诱导小鼠视网膜血管新生的影响。A.给氧组视网膜血管造影铺片。B.lOpgAU6处理组视网膜血管造影铺片。C.各组突破视网膜内界膜血管内皮细胞核数，n=10，*p<0.05，**p<0.01vs给氧组。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一种具有抑制血管新生功能的，分子量小于lkD(如仅约720D)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，选定了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经鸡胚尿囊膜血管模型、VEGF诱导小鼠角膜新生血管模型和缺氧诱导小鼠视网膜新生血管模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽，即AU6。本发明的小肽AU6的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。活性多肽在本发明中，术语"本发明多肽"、"AU6多肽"、"AU6小肽"、"短肽AU6"或"肽AU6"可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽AU6氨基酸序列(SEQIDNO:l)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQIDNO:l序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)1-5个(通常为l-4个，较佳地l-3个，更佳地l-2个，最佳地l个)氨基酸的缺失、插入以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。本发明还包括AU6多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)AU6多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6ffis等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地l个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。一类特别优选的衍生多肽的序列如SEQIDNO:3所示。表I最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Lys;ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGin(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis(H)Asn;Gin;Lys;ArgArglie(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeu8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>发明还提供AU6多肽的类似物。这些类似物与天然AU6多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的"前体药物"的形式。编码序列本发明还涉及编码AU6多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列是TACCGGGGCAAGAAGGCA(SEQIDNO:2)。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDNO:l序列的蛋白质，但与SEQIDNO:2中相应编码区序列有差别的核酸序列。本发明的AU6核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或AU6多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。另一方面，本发明还包括对AU6DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。制备方法
技术领域：
：本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲垸(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链縮合完成后，用含对甲苯酚(5-l(T/。)的氟化氢(HF),在(TC下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或l，l，3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。在一优选例中，本发明多肽AU6，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-2(TC贮存。另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的AU6多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码AU6多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。药物组合物和施用方法另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N丄1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)眼表、眼周、眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂、眼用凝胶和眼药这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。例如，眼药水的配制可这样进行将短肽AU6或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽AU6或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽AU6或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯垸酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽AU6或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt。/。，较佳地l-5wty。，每日可2-6次给药，每次l-5滴。工业应用性含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对血管新生有显著的抑制活性。经在体动物试验证实，本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生，而且可以抑制VEGF诱导的小鼠角膜新生血管和缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管。本发明的主要优点包括(a)本发明多肽的分子量小，可透过眼组织屏障；(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病，如肿瘤新生血管等。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l多肽的合成采用市售的SYMPHONY多肽合成仪合成序列为SEQIDNO:1的AU6多肽。步骤如下l.根据软件计算配制所需要的保护氨基酸溶液，和縮合试剂，切割试剂，在仪器相应的瓶里加入足量的DMF、DCM2.在反应器中加入100^imo1FMOC-Ala-Wang-Resin，3.在收集切割液的管道上放入15mg的离心管。4.编辑程序，一般树脂的溶涨时间是30min，脱保护时间是5min、15min两次、縮合时间是30分钟，切割程序是2h。5.开机按照程序合成。6.最后将切割液用乙醚沉淀，离心，吹干，用HPLC纯化。制得120mg多肽AU6，为白色粉末(水溶性好)，纯度>95%。密封，-20度保存备用。实施例2AU6对鸡胚尿囊膜血管新生的作用1.材料与方法1.1材料Whatman滤纸购自美国SIGMA公司。1.2模型制作及干预试验将生后l-2d的鸡种蛋随机分成3组，依次为对照组、10pgAU6干预组、50pgAU6干预组，每组9-15只。用自来水洗净种蛋表面，在0.2。/。的新洁尔灭溶液中浸泡5-10min，钝端朝上，于条件为温度37。C，湿度60%-70%的培养箱中培养，每天至少翻转2次，以24h为一天，孵化5天。无菌条件下，用镊子在其钝端(气室端)打开一个约lcm、2cm2的小孔，依次揭开卵壳膜与气室,露出长有血管的尿囊膜。以5mm直径的Whatman滤纸用作样品载体，每一滤纸吸收含Opg、10pg或50ngKVll的PBS溶液5ul，晾干后放入尿囊膜的中央。用塑料胶带封好小窗。继续在上述同样条件下孵化2天。1.3计数尿囊膜微血管数打开胶带，观察尿囊膜上新发生的微血管,在体视显微镜下计量各组种蛋滤纸周围5mm内的微血管(直径不大于10微米)数1.4统计分析实验数据以^士s表示。采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分别比较各组鸡胚尿囊膜微血管数。以PO.05为差异有统计学意义。2.结果种蛋鸡胚尿囊膜上滤纸片周围5mm范围内，PBS对照组受精鸡胚尿囊膜的血管，从其大血管逐级分支，形成多条微血管，AU6处理组的微血管数明显少于正常组。未发现AU6对鸡胚的毒性作用(图1A、1B和1C)。14AU6对VEGF诱导的小鼠角膜新生血管的作用1.材料和方法1.1实验动物和材料健康雄性C57Bl/6小鼠，56周龄，体重约20g，购自中国科学院实验动物中心；硫糖铝(sucroseoctasulfate-aluminumcomplex),购自美国SIGMA-Aldrich公司；PolyHEMA(poly(2-hydroxyethylmethacylate))，购自美国Aldrich公司；人重组VEGF,65购自美国SIGMA公司。1.2模型制作及干预试验将12%PolyHEMA乙醇溶液与含有硫糖铝粉末的生理盐水溶液等体积混合后，制成体积为0.35mmX0.35mmX0.20mm的空白缓释颗粒，并在上述颗粒中加入160ngVEGF和不同剂量(0ing、1.0pg、2.(Hxg)的小肽，-20'C贮存备用。上述操作均在无菌条件下进行。将30只C57B1/6小鼠(30只眼)随机分为对照组(VEGF组)、VEGF+1.0pgAU6组、VEGF+2.0pigAU6组，每组10只眼。无菌条件下，用23G注射针头在实验眼角膜基质层间行钝性分离，形成1个0.5mmX0.5mm小袋。将包含160ngVEGF和不等剂量小肽的颗粒植入各组鼠眼角膜的小袋内，并使之距角巩缘0.60.8mm。术毕，0.5%金霉素眼膏涂眼以预防感染和减少刺激。术后7d摄片观察角膜新生血管长入情况，并行组织病理学检查。1.3角膜新生血管的定量测定术后7d测量自角巩缘长出的角膜新生血管长度。以连续弯曲度小、朝向缓释颗粒生长的最长血管为准，计算新生血管面积(Area)。公式Area(mm2)二0.5XitXVL(mm)XCNX0.4(mm)，其中VL为最长新生血管从角巩缘长入角膜的长度，CN为新生血管累及角膜的圆周钟点数。1.4角膜新生血管的定性观察各组动物于术后7d以过量麻醉处死，无菌条件下取眼球，10%中性甲醛固定，行组织病理学检查。标本以石蜡包埋，3pm切片，HE染色，光镜下观察。1.5统计学分析实验数据以？士s表示。采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分别比较各组小鼠角膜最长新生血管长度、钟点数和面积。以P0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1角膜新生血管的定量测定观察角膜基质层内移植有C57Bl/6小鼠角15膜血管新生进展，发现术后3d，自角巩缘处长出新生血管，至术后7d达到高峰。术后7d，AU6干预组较对照组在角膜新生血管的最大血管长度、血管累及钟点数和血管面积上均明显减少(图2A、2B和2C)。2.2角膜组织病理学检查术后7d，HE染色切片观察可见对照组角膜组织水肿，上皮和内皮层完整，基质板层排列疏松，其间有较多毛细血管管腔。AU6干预组角膜组织无明显水肿，上皮和内皮层完整，基质板层排列尚整齐，可见个别毛细血管管腔。未发现AU6对角膜各层组织的毒性作用。实施例4AU6对缺氧诱导的视网膜新生血管的作用1.材料与方法1.1材料和主要设备健康新生C57Bl/6小鼠，雌雄不限，7d龄，体重约4g，购自中国科学院实验动物中心；FITC-dextran(分子量为2H0勺购自美国SIGMA公司。1.2模型制作和干预实验将10窝新生鼠随机分成5组，依次为给氧组、给氧+PBS组、给氧+AU65pig、给氧+AU610pg组和对照组，每组10-11只小鼠。生后7d，除对照组外，将余各组小鼠和其同笼母鼠一起置于密闭的干燥箱中。干燥箱中通入湿润纯氧，维持氧箱内的氧体积浓度为75%±5%，每3-6h用测氧仪监测一次。对照组正常空气饲养。于生后12d，无菌条件下，对给氧+PBS组、给氧十AU6(5pg、IO貼)组小鼠行玻璃体腔注射分别含有O、5pg、10貼AU6的PBS溶液0.5ul。1.3FITC-dextran视网膜血管造影铺片于生后17d，对各组小鼠行左心室灌注50mg/mlFITC-dextran溶液后，立即取眼球，固定于4'C多聚甲醛溶液中5-24h后，分离视网膜并铺片，荧光显微镜下观察视网膜血管形态变化。1.4视网膜新生血管的定量测定各组动物于生后17d以过量麻醉处死，取眼球，10%中性甲醛固定，行组织病理学检査。标本以石蜡包埋，61^m连续切片，切片方向为矢状位，即通过角膜，并与视神经平行，HE染色。每眼随机抽取5个切面(有视神经断面的切面除外)，光镜下计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。1.5统计学分析实验数据以^is表示。采用非配对t检验法比较给氧组与对照组，采用采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分别AU6处理组与给氧组的突破视网膜内界膜的细胞核数目。以PO.05为差异有统计学意义。2.结果2.1FITC-dextran视网膜血管造影铺片正常对照组小鼠视网膜未见无灌注区和新生血管簇，模型处理组视网膜铺片可见大片区灌注区和多处新生血管簇，AU6处理组视网膜铺片示无灌注区縮小，新生血管簇减少(图3A和3B)。2.2视网膜新生血管的定量测定正常对照组小鼠视网膜切片仅见极少量有突破内界膜的血管内皮细胞核，模型处理组视网膜切片显示突破内界膜的血管内皮细胞核数明显多于正常组，AU6处理组视网膜切片可见突破内界膜的血管内皮细胞核数较模型处理组明显减少。未发现AU6对视网膜各层组织的毒性作用(图3C)。实施例6眼药水的制备利用常规技术，混合以下组分，制得1%眼药水，其配方如下AU6肽10mg羟丙基甲基纤维素0.03g无菌水加至10ml调节渗透压至3000sm，酸碱度(pH)至6.8-7.1。经3位志愿者试用一周，每日2次，每次2滴/眼。结果表明该眼药水可抑制眼部的新生新生。讨论本发明多肽AU6具有显著的抑制血管新生的活性，这表现在AU6可抑制鸡胚尿囊膜的血管新生；AU6可抑制VEGF诱导的小鼠角膜的血管新生；AU6可抑制缺氧诱导的小鼠视网膜血管新生。就序列而言，SEQIDNO:1所示的AU6的氨基酸序列正好与apo(a)KV中一段含6个氨基酸残基的片段相同。Kringle结构域是一种由约80个氨基酸组成的保守结构，包含3对二硫键，形成双环状构象，是行使生物学功能的独立折叠单元。Kringle结构域存在于包括生长因子、蛋白酶和凝血因子等多种不同功能的蛋白质。Kringle结构域在蛋白质-蛋白质特异性交互作用及其调控中发挥着重要的作用。研究表明，许多Kringle结构域能够阻断血管新生，如angiostatin、plasminogenkringle5等。在包含Kringle结构域的蛋白质中，载脂蛋白(a)[叩olipoprotein(a)，叩o(a)]是一种分子量为400-800KDa不等的糖蛋白，以二硫键与叩oB-100相接构成脂蛋白(a)。研究表明，叩o(a)转基因小鼠体内LL/2肿瘤因微血管密度减少而消减证实apo(a)能够在体内抑制血管新生。apo(a)与纤溶酶原高度同源，其中包含几个随机重复的与纤溶酶原Kringle4(K4)类似的Kringle区域(KringleIV，KIV)，依次命名为KIV-I至KIV-IO，后面带有一个与纤溶酶原K5同源的KringleV(KV)结构域以及蛋白酶样区。本发明多肽AU6正好与apo(a)KV中一段含6个氨基酸残基的片段相同，一个方面提示了该短肽序列在抑制血管新生方面的重要性，另一方面也提示叩o(a)与纤溶酶原基因可能是由同一个前体衍化而来，其中一部分有潜在生物学活性的保守序列在维持蛋白质功能上具有关键作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。18序列表<110〉上海市第一人民医院<120>预防和治疗血管新生的小分子多肽及其应用<130>077548〈160〉3<170〉Patentlnversion3.4<210〉1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<222>(1)..(6)<223>血管新生抑制肽AU6<400>1TyrArgGlyLysLysAla15<210>2<211>18<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>AU6多肽的编码序列<400>2taccggggcaagaaggca<210〉3<211>6<212〉PRT<213>人工序列<220><221>misc—feature〈223〉AU6衍生多肽<220><221>raise—feature<222>(1)..(1)〈223〉Xaa-Y或F<220〉<221>misc—feature〈222〉(2)..(2)〈223〉Xaa:喊K<220〉<221〉tnisc—feature<222〉(3)..(3)<223>Xaa:G或A〈220><221〉misc—feature〈222〉(4)..(4)<223〉Xaa:K或R<220〉<221>misc—feature〈222〉(5)..(5)<223>Xaa:K或R<220><221>misc—feature<222>(6)..(6)<223〉Xaa=A,V,L,或I<柳〉3X胆XaaXaaXaaXaaXaa1520权利要求1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7](I)式中，Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；Xaa1是选自下组的氨基酸Tyr或Phe；Xaa2是选自下组的氨基酸Arg或Lys；Xaa3是选自下组的氨基酸Gly或Ala；Xaa4是选自下组的氨基酸Lys或Arg；Xaa5是选自下组的氨基酸Lys或Arg；Xaa6是选自下组的氨基酸Ala、Val、Leu、或Ile；Xaa7是无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和Xaa7为无。3.如权利要求l所述的多肽，其特征在于，Xaa2为Arg，Xaa4为Lys和Xaa5为Lys。4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组(a)具有YRGKKA(SEQIDNO:1)所示氨基酸序列的多肽;(b)将SEQIDN0:1所示氨基酸序列经过1-2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。5.—种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求l所述的多肽。6.—种药物组合物，其特征在于，它含有(a)权利要求l所述多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。8.如权利要求l所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。10.—种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。全文摘要本发明涉及一种预防和治疗血管新生的小分子多肽。本发明还涉及所述小分子多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。文档编号C12N15/11GK101503458SQ20081003354公开日2009年8月12日申请日期2008年2月4日优先权日2008年2月4日发明者迅许,卉赵申请人:上海市第一人民医院