基因表达或活性增强性元件的制作方法
【专利说明】基因表达或活性增强性元件
[0001] 本申请要求2013年7月5日提交的申请号EP 13175398.0的优先权，所述专利申请 通过引用方式完整并入本文作为参考。本发明设及转基因核酸、表达盒、载体、植物细胞、植 物器官和植物。本发明还设及用于增加、尤其在植物细胞或植物器官中增加祀基因表达或 活性的方法，并且还设及重组核酸和表达盒增加祀基因表达或活性的用途或用于制备载 体、植物细胞、植物器官或植物的用途。另外，本发明设及用于实现、尤其在植物细胞或植物 器官中与运种植物细胞、植物器官或植物中有功能的启动子有效连接时实现祀基因的增加 表达或活性的增强子。本发明在此参考生产多不饱和脂肪酸(PUFA)的技术领域来描述，但 不限于运个技术领域。
[0002] 为了在植物细胞中产生所需分子例如PUFA，经常需要表达相对于植物细胞为异源 的祀基因，或需要过量表达天然存在于所述植物细胞中的祀基因。
[0003] W0 02/102970公开了从亚麻获得的两个Conlinin基因 （Conlinin 1和2)及它们的 相应启动子区，它们可W用来改善种子性状、调节种子油的脂肪酸组成和种子胆藏蛋白的 氨基酸组成，及在植物种子中产生生物活性化合物。该文献还提到基于利用运些启动子指 导目的基因的种子特异性表达的方法，所述目的基因例如可能参与脂质生物合成，例如酷 基载体蛋白、饱和酶、去饱和酶和延伸酶。
[0004] W0 01/16340公开了允许异源基因在亚麻和其他植物中种子特异性表达的方法。 与脂肪酸代谢如酷基载体蛋白、饱和酶、去饱和酶和延伸酶等相关的启动子特别有意义。 [000引启动子功能在于启动DNA转录成mRNA。通常，转录的mRNA包含翻译区，也称作基因 序列，及其上游的非翻译区。通常认为运种非翻译区对基因序列的翻译或mRNA的稳定性不 造成任何重大影响。因此，在启动子TATA框和起始密码子之间的区域通常情况下作为非重 要部分处理。例如，WOO 1/16340公开了一种推定的conlinin启动子，但是该文献中公开的 GUS表达构建体(本文作为SEQ ID NO.311复制)仅在推定的启动子序列的3M则缩短。
[0006] 开发改进型农艺性状持续需要找到能改善祀基因在目的细胞中表达或活性的增 强子遗传元件。具体而言，产生修饰的种子油脂肪酸组成的油巧作物是一项要求鉴定其他 增强性元件的需求;优选地，进一步需要改善脂肪酸生物合成基因表达的启动子。
[0007] 现在已经出乎意料地发现，某些核酸可W在祀基因或报道基因与启动子有效连接 时改善该基因的表达或活性。
[0008] 应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法学、方案、细胞系、植物物种或属、 构建体和试剂。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限 制本发明，本发明将仅受所附权利要求书限制。
[0009] 必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数 形式"一个"、"一种"和"该"包括复数称谓。因此，例如，对"一种载体"的称谓是对一种或多 种载体的称谓并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。术语"约"在本文中用来指大 约、大致、左右和在……范围内。当术语"约"与一个数字范围联合使用时，它通过扩展界限 值高于和低于所述数值而修饰该范围。通常而言，术语"约"在本文中用来通过20%、优选地 10%之上或之下（更高或更低)变异而修饰高于和低于所述值的数值。如本文中所用，词汇 "或"意指特定列出的任一成员并且还包括该列出的成员的任意组合。
[0010] 为了克服、减少或缓和前述缺点和/或为了进一步实现前述目的和/或改善前述的 优点，本发明提供一种重组核酸，其包含祀基因和邮邻于该祀基因的非翻译区，其中非翻译 区包含至少18个连续核巧酸的增强子，其中至少14个核巧酸是腺巧或胞巧。
[0011] 从另一方面描述本发明时，本发明提供一种重组核酸，其包含植物启动子和邮邻 于该启动子的非翻译区，其中非翻译区包含至少18个连续核巧酸的增强子，其中至少14个 核巧酸是腺巧或胞巧。
[0012] 根据本发明，还提供了一种增强子，其包含
[0013] a)CCAAT框，其包含沈Q ID NO. 100、优选地包含与沈Q ID NO. 101具有至少90%同 一性的序列并包含SEQ ID NO. 100,并且更优选地包含SEQ ID NO. 101，和/或
[0014] 6)0〇門/]^81曰结合位点，其包含沈9 10顯.102、优选地包含与569 10^.103具 有至少90%同一性的序列并包含沈Q ID NO. 102,并且更优选地包含沈Q ID NO. 103。
[0015] 根据本发明，还提供了一种表达盒，其包含本发明的重组核酸并且如果尚未包含 于该重组核酸中，则包含植物启动子，其中该启动子包含
[0016] TATA框，其优选地包含沈Q ID NO. 108、更优选地包含与沈Q ID NO. 107具有至少 90%同一性的序列并包含沈Q ID NO. 108,并且更优选地包含沈Q ID NO. 107,和
[0017] CPRF因子结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 114、更优选地包含与SEQ ID NO. 113具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 114,并且更优选地包含SEQ ID NO.113,和
[0018] TCP I类转录因子结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 116、更优选地包含与SEQ ID NO. 115具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 116,并且更优选地包含SEQ ID NO.115,和
[0019] bZIP蛋白G框结合因子1结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 118、更优选地包含与 沈Q ID NO. 117具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 118,并且更优选地包含沈Q ID NO.117。
[0020] 本发明也提供一种包含本发明表达盒的载体。
[0021] 另外，本发明提供包含本发明的重组核酸的或本发明的表达盒的植物、植物器官 或植物细胞。
[0022] 本发明还教授一种增加祀基因表达或活性的方法，所述方法包括步骤
[0023] i)在祀基因上游提供非翻译区和植物启动子W获得根据权利要求9至11中任一项 所述的表达盒，和
[0024] i i)向植物细胞引入表达盒W允许祀基因表达。
[0025] 根据本发明，如本文所述的本发明增强子或本发明的表达盒可W用于
[0026] -增加祀基因表达或活性，
[0027] -产生根据权利要求15所述的载体，或用于
[0028] -产生根据权利要求16所述的植物、植物器官或植物细胞。
[0029] 下文更详细地描述本发明。除非另外特别声明，否则，"定义"章中的各定义适用于 本文本各处。
[0030] 发明详述
[0031] 看待本发明的一种方式是如下理解本发明：根据本发明，提供了一种重组核酸，所 述核酸包含祀基因和邮邻于祀基因的非翻译区。根据本发明，非翻译区包含至少18个连续 核巧酸的增强子，其中至少14个核巧酸是腺巧或胞巧。
[0032] 发明人已经发现，核酸的特定区段-下文将描述其优选实施方案-作为增强子在宿 主细胞、尤其植物细胞中发挥作用，即，可W通过报道基因与该增强子有效连接增加祀基因 或报道基因产物的活性。增强子和祀基因因此是功能性连接的，即增强子影响或修饰祀基 因的转录或翻译。借助本发明增强子增加活性可W通过宿主细胞增加 mRNA的产生来实现， 或可W通过增加 mRNA翻译速率(例如通过改善核糖体与该mRNA的结合或通过保护该mRNA免 受降解)来实现。然而，本发明不限于运些机制中的任一者。
[0033] 增强子优选地相对于祀基因和/或驱动祀基因表达的启动子为异源。因此，W下序 列不是本发明的部分:特别包含于W0 0116340、W0 2002102970、W0 2009130291中的沈Q ID NO.311至323。
[0034] 祀基因可W是需要在植物中增加其活性的任何基因。通过比较不与增强子功能性 连接情况下相同类型细胞(例如种子细胞，根细胞等）中表达的祀基因的活性，确定增加作 用。有用祀基因的例子是脂肪酸去饱和酶基因和脂肪酸延伸酶基因，尤其dl2dl5Des(Ac_ GA)(参见WO 2007042510)、dl2Des(Ce_GA)(参见US 2003172398)、dl2Des(Co_GA2)(参见WO 200185968)、dl2Des(Fg)(参见WO 2007133425)、dl2Des(Ps_GA)(参见WO 2006100241)、 dl2Des(Tp_GA)(参见WO 2006069710)、d6Des(01_febit)(参见WO 2008040787)、d抓es(0I_ febit)2(参见WO 2008040787)、d6Des(0t_febit)(参见WO 2008040787)、d6Des(0t_GA)(参 见 WO 2005083093)、d6Des(0t_GA2)(参见 WO 2005083093)、d6Des(Pir)(参见 WO 2002026946)、d抓es(Pir_GAI)(参见WO 2002026946)、d抓es(Plu)(参见WO 2007051577)、 d6Elo(化_GA)(参见WO 2001059128)、d6Elo(化_GA2)(参见WO 2001059128)、d6Elo(化_ GA3)(参见WO 2001059128)、d6Elo(Tp_GA)(参见WO 2005012316)和d6Elo(Tp_GA2)(参见WO 2005012316)。
[0035] 增强子包含于邮邻于祀基因的非翻译区内或形成所述非翻译区。对于本发明，如 果除了属于祀基因的区域之外的未翻译区域位于包含增强子或由增强子组成的非翻译区 和祀基因之间，则非翻译区视为邮邻于祀基因。因此，例如，在祀基因包含几个外显子的情 况下，当非翻译区如此位于第一外显子上游，从而未翻译区域位于包含或作为增强子的非 翻译区和第一外显子之间时，非翻译区视为与祀基因邮邻存在。为了本发明，外显子按5/至 3/方向计数，从而第一外显子是包含祀基因起始密码子的一个外显子。
[0036] 应当指出，除本发明的增强子之外，非翻译区还可W包含其他功能单位，包括转录 或翻译增强序列。无论非翻译区是否包含运类其他功能单位，出于本发明目的，未翻译区域 与祀基因在前述条件下邮邻存在，即，未翻译的区域位于非翻译区和祀基因之间。优选但不 要求本发明的增强子本身邮邻于祀基因的翻译起始密码子。
[0037] 非翻译区可W在细胞中转录或可W在细胞中不转录。特别地，非翻译区可W包含 被转录但不翻译的翻译增强序列或mRNA稳定性增强序列。
[0038] 非翻译区和增强子优选地位于祀基因上游。如果将祀基因的核碱基从1开始对第 一个所翻译密码子的5 '最末端核碱基(通常，DNA序列的密码子"ATG"的"A"与祀基因 mRNA的 "AUG"相对应)编号并且按3'方向递增数字，则增强子的核碱基将按负数字命名，因为非翻 译区优选地位于祀基因的5'方向。
[0039] 特别优选非翻译区按5/至3/方向包含本发明的增强子和一个或多个其他功能单 位、尤其一个或多个肥ΕΝΑ或RENA，如在例如W0 2013038294中所述那样。
[0040] Kozak序列优选地位于非翻译区和祀基因的交界处。优选地，Kozak序列包含核巧 酸序列"ATGG"，其中"ATG"是祀基因的起始密码子。Kozak序列促进祀基因的翻译。技术人员 可W根据意图使用的细胞并且还根据祀基因的表达需要来改编Kozak序列的正合核巧酸序 列。例如，技术人员可W产生序列"NNATGNN"的全部256种变体，其中"N"指任何核碱基"A、C、 G或r，并且克隆运些变体于他意图使用的细胞中。通过分析祀基因的活性，他将找到对于 其需要而言最佳的Kozak序列。如果第二氨基酸对祀基因发挥功能重要，可W显著减少变体 数目，因为在运种情况下"ATG"起始密码子后（即，按3 '方向）的至少第一个核巧酸限于一种 或两种备选物。优选的Kozak序列是乂CATGG"，因为运个序列还由限制性酶化〇1或Bspl9I识 另IJ，由此促进克隆与非翻译区邮邻的祀基因。出于本发明目的，将前面的乂C'核碱基视为属 于非翻译区。
[0041] 本发明的增强子包含至少18个连续核巧酸或由其组成。该增强子因此不被任何其 他元件中断，无论所述其他元件是功能性元件或无功能元件。如下文所描述，增强子及还有 非翻译区可W实质上长于18个核巧酸，并且优选地，增强子由如下文描述的57个或58个连 续核巧酸组成。
[0042] 本发明的增强子具有几种有益特征。其一是，与其他表达诱导序列如例如W0 2011023537、W0 2011023539、W0 2011023800或W0 2013/005152中所述的肥ΕΝΑ相比，该增 强子序列短。该增强子因此还可W轻易并入受到严重尺寸限制的运类构建体中，例如原因 在于待并入相应构建体的基因的个数和/或大小。
[0043] 另外，已经显示该增强子对庞大数目的不同祀基因、尤其对序列高度不同的饱和 酶基因和延伸酶基因有活性。因此，本发明提供用于植物中的通用型增强子。
[0044] 另外，本发明的增强子不仅在拟南芥中有功能，还在其他植物、尤其如下文描述的 作物植物中、尤其在十字花科（Brassicaceae)的植物细胞中有作用、甚至在芸苔属 (8'曰3 3；[。日）的植物细胞中更有作用^及甚至尤其在欧洲油菜（13^3 3；[。3]1日9113)、甘蓝 (Brassica oleracea)、埃塞俄比亚芥（Brassica ca;rina1:a)、黑芥（Brassica nigra)、芥菜 (Brassica juncea)和宪青(Brassica rapa)的细胞中更有作用。
[0045] 本发明增强子的另一个优点是，它可用于增加在种子特异性启动子控制下表达的 祀基因的表达或活性。特别地，本发明的增强子可W与Conlinin型启动子组合W实现种子 特异性表达，如W0 2002102970中所述。但是，本发明的增强子也可W与其他启动子组合W 增加祀基因的表达或活性。
[0046] 本发明的非翻译区或增强子优选地包含根据SEQ ID N0.84、85、86、87、88或89的 任何核巧酸序列。特别优选非翻译区或增强子包含一个或多个前述序列的两个拷贝。根据 SEQ ID ^.84、85、86、87、88或89的核巧酸序列可^在非翻译区或增强子中^重叠形式存 在。例如，两个胞巧后接五个腺巧核碱基的核巧酸序列将同时地体现根据SEQ ID NO: 85、86 和87的序列。
[0047] 特别优选该增强子包含根据SEQ ID NO.84的核巧酸序列。运个序列包含植物启动 子中存在的植物CCAAT框的核屯、基序SEQ ID NO. 100。因此，根据SEQ ID NO.84的序列的存 在特别合适实现与运个序列结合的转录因子的作用。特别优选该增强子或非翻译区包含由 DNA螺旋中大约5个转角分隔的两个SEQ ID NO.84拷贝，即，包含该增强子或非翻译区的DNA 序列优选地包含由52、53、54、55、56、57或58个核巧酸分隔的两个SEQ ID NO.84范例，所述 52、53、54、55、56、57或58个核巧酸从SEQ ID NO. 84的第一范例的第1个核巧酸（即5 '最末 端)按5'方向计数至SEQ ID NO.84的第二范例前方的最末核巧酸，优选地它们由54、55或56 个核巧酸和最优选地由55个核巧酸分隔。例如，在根据SEQ ID NO. 143的核巧酸序列中，非 翻译区的SEQ ID NO.84范例由55个核巧酸分隔。
[0048] 还特别优选增强子如此与启动子功能性连接，从而增强子可W在细胞中转录。下 文更详细地描述本发明的运个方面。在运种情况下，特别优选增强子包含至少一个SEQ ID NO. 84拷贝或范例。
[0049] 根据本发明，增强子优选地包含18个连续核巧酸或由其组成，其中至少15个、优选 地至少17个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多1个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。 运类增强子的优选实施方案在沈Q ID NO. 20至SEQ ID NO.45中描述。运些序列当中，优选 根据沈0 1〇^.20、22、25、28、34、35和36的序列，因为它们包含560 1〇^.84范例。特别优 选是根据SEQ ID NO. 25的序列，因为运个序列包含SEQ ID NO. 84、100和101的全部并且因 此十分类似于植物CCAAT框。
[0050] 还优选的是增强子包含21个连续核巧酸或由其组成，其中至少15个、优选地至少 16个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多2个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。相应的 优选序列由560 1〇顯.95及由560 1〇^.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中 任一者的最后21个核巧酸给出。
[0051] 还优选的是增强子包含22个连续核巧酸或由其组成，其中至少16个、优选地至少 17个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多2个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。运种序 列的优选范例由SEQ ID N0.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后 22个核巧酸给出。
[0052] 还优选的是增强子包含24个连续核巧酸或由其组成，其中至少18个、优选地至少 19个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多3个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。运种序 列的优选范例由SEQ ID N0.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后 24个核巧酸给出。
[0053] 还优选的是增强子包含36个连续核巧酸或由其组成，其中至少27个、优选地至少 28个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多6个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。运种序 列的优选范例由560 1〇顯.96及由560 1〇^.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后36个核巧酸给出。
[0054] 还优选的是增强子包含57个连续核巧酸或由其组成，其中至少42个、优选地至少 45个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多8个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。运类增 强子的优选例子由沈0 1〇側.46至83的任一者给出及由沈0 1〇側.46、161-170、221-230、 276-285和301-310中任一者的最后57个核巧酸给出。
[0055] 还优选的是增强子包含83个连续核巧酸或由其组成，其中至少62个、优选地至少 65个核巧酸是腺巧或胞巧，并且最优选地最多8个核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。运种序 列的优选范例由沈Q ID N0.161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后83个核 巧酸给出。运种序列的其他优选范例由SEQ ID NO. 140和任一SEQ ID NO.46至83组合的最 后（即从3'末端起计数)83个核巧酸给出，其中SEQ ID NO. 140的序列与任一SEQ ID NO.46 至83的5/末端紧邻融合。
[0056] 对于每个群组，SEQ ID N0.161-170、221-230、276-285和301-310的序列按递降优 选顺序排序。例如，SEQ ID NO.161比沈Q ID NO.162更优选，并且沈Q ID NO.221比沈Q ID NO. 230更优选。然而，运些群组按递增优选顺序如此排序，从而SEQ ID NO. 221比SEQ ID NO. 161 或沈Q ID NO. 170更优选。
[0057] 在本申请中公开的序列当中，SEQ ID N0.161-170、221-230、276-285和301-310的 序列是特殊的，因为运些序列经检验不影响根据SEQ ID NO.1的序列的主要已知或预测的 顺式调节元件。检验过的顺式调节元件包含下文更详细提到的那些，即TATA框、CPRF因子结 合位点、TCP I类转录因子结合位点、bZIP蛋白G框结合因子1结合位点、Ry基序、谷醇溶蛋白 框、如赋予光诱导性的GAPDH启动子中的顺式元件、SBF-1结合位点和向日葵同源域亮氨酸 拉链蛋白化化-4结合位点。已经展示运种方法在GUS报道基因测定法中提供种子特异性P-PvARC5、p-VfSBP和p-Bn化pin启动子的功能性变体并且运种方法在通过引用方式并入本文 的W0 2012077020中更详细地描述。
[0058] 因此根据本发明，如果增强子包含根据W下的任一序列
[0059] a)沈Q ID NO.20至沈Q ID NO.45的任一者，或根据W下的任一序列
[0060] b)SEQ ID N0.46-83、161-170、221-230、276-285或301-310中任一者的最后 18、 21、22、24、36或57个核巧酸，或
[0061] C)沈Q ID N0.90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103或 137的任一 者，或
[0062] d)其中插入1个额外碱基的根据b)或C)的序列，
[0063] 则它是优选的。
[0064] 应当理解，优选地，无论A、C、G和T核巧酸的数目是多少，如果某增强子由SEQ ID NO. 137组成或包含SEQ ID NO. 137,则该增强子视为本发明的增强子。
[0065] 看待本发明的另一种方式是如下理解本发明：根据本发明提供了一种重组核酸， 所述核酸包含植物启动子和邮邻于该启动子的非翻译区，其中非翻译区包含本发明的增强 子。如上文描述，增强子由至少18个连续核巧酸组成或包含至少18个连续核巧酸，其中至少 14个核巧酸是腺巧或胞巧。优选的增强子和非翻译区域尤其在上文更详细地描述。如上文 所述，增强子优选地相对于启动子是异源的。
[0066] 根据本发明，只要未翻译的区域存在于启动子的最3'端TATA框和非翻译区或增强 子的5/末端之间，则非翻译区或增强子与启动子邮邻。优选地，增强