专利名称：Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列的制作方法
AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列本发明属于生物技术发明领域。具体涉及AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵 列，将制备好的携带外源基因和基因调控元件的重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞 培养支持物(如96孔板)上，在无菌条件下制成可以长期存放的重组AAV病毒阵列。将活 细胞悬液加入布置了重组AAV病毒阵列的细胞培养孔板中(如96孔板)，预先包被的重组 AAV病毒能够有效地感染所加入的细胞，并将重组AAV病毒携带的外源基因(如报告基因) 和/或基因元件带入细胞中发挥作用。背景将外源基因和/或基因元件导入细胞、使其在细胞中表达或阻断其它基因的表 达，是分子生物学中常用的技术方法，称之为转导(transduction)。这个过程往往需要 载体(vector)和导入系统(delivery system)来介导。基因载体通常分为病毒载体和 非病毒载体两类。非病毒载体通常是借助人工制备或合成的材料如脂质体、壳聚糖、多 聚阳离子化合物等将DNA质粒“包裹”成复合物导入细胞中，这个过程通常被称为“转 染” (transfection)。而病毒载体则借助病毒天然的感染能力将“搭载”的外源基因和元件 序列导入细胞中，这个过程和病毒感染过程相似，也被称为“感染”。无论是转染方式还是感染方式，通常的基因导入方法都是先将细胞铺入培养板 中、再加入DNA复合物或病毒进行“转染”或“感染”；与常规方法在操作顺序上有所不同的 是，本发明所述的转导方法是先将所使用的重组病毒预先包被在孔板中，之后再加入细胞 来实现感染，因此这样的方法可称作“反向感染”(reverse infection)。为了便于区别，我 们把常规方法进行的转导方法称为“正向转染”或“正向感染”。实际上，“微阵列” (Microarray)技术已经广泛用于生物技术领域。其中最为常见 的是DNA Array (基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化稳定性和独特的碱基配对结构， 而成为理想阵列材料。比如将多种合成的寡核苷酸(单链DNA)作为探针有序地排列固定 在表面经过处理的玻片上制成“微阵列”(芯片)，而将待检测的样品提取核酸，用地高辛标 记的随机引物进行扩增和标记后与芯片上的探针杂交，最后显色获得杂交信号。根据信号 所在的探针位置来判断样品中有与该探针序列互补的序列。除了 DNA外，多肽和蛋白(包 括抗体)也被成功地用来制成阵列，用于蛋白检测。阵列(Array)技术的优势是具备高通 量的特点，即一次检测能同时获得样品与多个探针作用的信息。传统的Southern杂交、 Northern杂交和Western杂交都是将样品经过电泳分离后转印到膜上，而用标记的探针来 进行检测。如果把这样的操顺序称为“正向”方式，那么，阵列技术是将已知信息的物质(探 针)排布成点阵，而加入被检测的对象进行检测就可称为“反向”方式。microRNA(miRNA)是长度在18 25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。 miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。它由基因组DNA编码，在RNA聚合 酶II的作用下被转录。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)靶向到达mRNA，进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究表明， miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。有研究人员发现线虫体 内的异时性基因lin-4编码的小RNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基因的表达。尽 管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的 确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA具有肿瘤抑制因 子及癌基因的作用。那些在癌症发生发展中发挥作用的miRNA被称作oncogenic miRNA, 即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异包括缺失突变、扩 增突变、点突变及DNA异常甲基化等。下表罗列出部分microRNA的表达与人类多种恶性肿 瘤的发生、发展、诊断、预后的关系
权利要求
本发明所述的AAV病毒反向感染技术，其技术特征是将重组AAV病毒预先包被在细胞培养支持物上，在加入活细胞悬液时，所包被的AAV病毒能有效感染加入的细胞(反向感染)，既使病毒在支持物上被晾干后仍保持其感染细胞的能力。
2.依据权利要求1，被预先包在细胞培养支持物上的重组AAV病毒，是被预先设计分布 成为AAV病毒阵列，其特征在于将一种或多种重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培 养支持物上、晾干制备成可存放的重组AAV病毒阵列产品，所包被的重组AAV病毒在存放过 程中仍保持感染细胞的能力。
3.依据权利要求2，本发明所述的AAV病毒阵列，在使用中，将使后加入的待检测的活 细胞被预先所包被的重组AAV病毒反向感染，发生反向感染之后，被重组AAV病毒带入细胞 中的基因和基因元件将在细胞中产生的导入基因和基因元件的表达和调控作用；
4.依据权利要求2，本发明所述的AAV病毒阵列，其技术特征在于将定量的重组AAV病 毒无菌条件下包被在细胞培养支持物上，如96孔板和/或384孔板等，加入待检测的细胞， 细胞可以被预包被的AAV病毒有效地感染，并且被AAV载体携带的基因和基因元件可进入 细胞并表达和表现生物学功能；
5.依据权利要求2，本发明所述的AAV病毒阵列，是一种可长期保存的产品，其技术特 征是将一种或多种重组AAV病毒有序地排列在细胞培养支持物上，如96孔板，384孔板，晾 干后无菌封口，4°C存放。
6.依据权利要求1和2，本发明所述的重组AAV病毒，其特征在于基因组携带了报告基 因，此报告基因为绿色荧光蛋白基因；
7.依据权利要求1和2，本发明所述的重组AAV病毒，其特征在于基因组携带了报告基 因，此报告基因为荧光索酶基因；
8.依据权利要求1和2，本发明所述的重组AAV病毒的基因组中的特征在于，在绿色荧 光蛋白基因或荧光素酶基因的3’非编码区携带了 miRNA靶序列，miRNA靶序列的插入位置 是荧光索酶编码区之后，PolyA加尾信号之前；
9.依据权利要求3，本发明所述的AAV病毒阵列，其特征在于由多种携带了不同miRNA 靶序列的重组AAV病毒组成，命名为AAV病毒-miRNA靶序列阵列，其用途是同时检测活细 胞中多种miRNA的表达活性及其表达活性的动态变化。
全文摘要
发明提出了一种用携带外源基因和基因调控元件的重组腺相关病毒(AAV)反向感染细胞的技术方法及用于制备AAV病毒阵列。其特征在于将制备好的携带外源基因和基因元件的重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培养支持物(如96孔板)上并晾干，无菌条件下制成易于长期存放的重组AAV病毒阵列。使用时将细胞悬液(可来自悬浮细胞或贴壁细胞)加入重组AAV病毒阵列的孔中，培养12～48hr，细胞被重组AAV病毒感染，重组AAV病毒将携带的外源基因和基因元件带入细胞中发挥作用。该技术可用于细胞内基因表达调控的检测和筛选。
文档编号C12N15/861GK101967496SQ200910009059
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月16日 优先权日2009年2月16日
发明者吴小兵, 田文洪, 董小岩, 谭淑萍 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所;北京五加和分子医学研究所有限公司