03] 将上述反应体系放入PCR仪，并按W下程序进行反应。 阳104] 反应程序： 阳 10引 95°C，5min; 阳 106] 80 °C , 5min ； 阳 107] 70 °C , 5min ； 阳 108] 60 °C , 5min ； 阳 109] 50 °C , 5min ；
[0110] 自然降至室溫。 阳111] 2.构建sgRNA表达载体 阳11引 （1)利用BsmB I限制性内切酶酶切目标载体lentiCRISPR v2质粒（其序列如序 列表中沈Q ID NO :50所示）。
[0113] 按照W下反应体系进行配制：
[0114] LentiCRISPR v2 质粒：1 μ g
[0115] 10 X 酶切 buffer :2 μ L 阳116] BsmB I限制性内切酶：2 μ L
[0117] 补充d地2〇至总体积20 μ L
[0118] 将酶切反应体系置于37°C反应4h。
[0119] (2)电泳分离并纯化载体片段
[0120] 酶切结束后，将酶切混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，选择载体片段（约 12化）进行切割，并通过DNA凝胶回收柱进行回收。 阳121] (3)将合成的双链DNA片段与载体主片段进行连接并转化大肠杆菌 阳12引将复性得到的双链DNA片段与回收得到的载体片段进行连接反应，按照W下反应 体系进行配制：
[0123] LentiCRISPR v2 载体片段：100ng
[0124] 双链 DM 片段：200ng
[0125] T4 连接酶：1μΙ
[0126] Τ4 连接反应 buf f er : 1 μ L 阳127] 补充(1地2〇至总体积10 μ L
[0128] 将连接混合物置于25 °C反应化。
[0129] 反应结束后将连接混合物转化大肠杆菌D册α菌株：向连接混合物中加入100 μ L 大肠杆菌D册α感受态细胞，冰上解育30min ;将混合物放入42°C水浴，热激90s后放入冰 上冷却；向混合物加入100 μ L LB培养基，37°C摇床培养20min ;将混合物涂Amp LB平板， 37°C培养1地。
[0130] (4)鉴定正确的转化克隆 阳131] 从Amp LB平板上挑选若干菌落进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定。挑选可能 正确的克隆进行测序，验证插入序列是否正确。对于正确的lentiCRISPR V2-SALL1载体克 隆进行保种。
[0132] 实施例Ξ、获得表达SA化IsgRNA的假型慢病毒
[0133] 1.材料准备
[0134] 扩增并抽提包装质粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG(购自Invitrogen，其图谱分别如 图2、图3和图4所示）；扩增并抽提载体质粒lentiCRISPR V2-SA化1 ;培养包装细胞系 肥K293T细胞（购自ATCC) ;DMEM培养基、化ti-MEM培养基和胎牛血清FBS (购自Gibco); Lipofectamine2000(购自 Invitrogen);肥K293T 细胞培养于含 5% C〇2的 37°C培养环境 中，培养基为含10 % FBS的DMEM培养基。
[0135] 2.转染和病毒包装 阳136] 第一天：将包装细胞系肥K293T传代至10cm dish,约30%融合度；
[0137] 第二天：在肥K293T达到80 %融合度时按照下列配方进行转染： 阳13引配制混合物1，包含：
[0139] lentiCRISPR V2-SAIX1 :6 μ g
[0140] pLPl :6 μ g
[0141] pLP2 :6 μ g
[0142] pLP/VSVG:3y 邑
[0143] 0pti-MEM:500 yL。
[0144] 配制混合物2,包含：
[0145] Lipofectamine 2000:30 μ L
[0146] Opti-MEM :500 μ L。
[0147] 静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
[0148] 将肥K293T培养基换为无血清DMEM培养基，加入转染混合物，37°C培养化后换为 20 % FBS的DMEM培养基，继续培养。
[0149] 3.病毒收集与保存
[0150] 第Ξ天：转染4化后收集含病毒的肥K293T培养基上清，用0. 45 μ m滤头过滤后， 分装，放置-80 °C保存。
[015U 实施例四、感染目的细胞并检测祀序列的敲除效果
[0152] 1.材料准备 阳153] 培养目的细胞系猪髓动脉血管内皮细胞PIEC(购自中国科学院细胞库）；DMEM 培养基和胎牛血清FBS (购自Gibco);不同祀序列（序列3和序列4)的lentiCRISPR V2-SA化1假型慢病毒；PIEC细胞培养于含5 % C〇2的37°C培养环境中，培养基为含10% FBS 的DMBl培养基。 阳154] 2.慢病毒感染目的细胞 阳1巧]第一天：将目的细胞传代至6孔板，约20%融合密度。每一种病毒需要一个6孔， 同时需要效率对照一个6孔。 阳156] 第二天：待目的细胞约40%融合密度时加入1血lentiCRISPR V2-SALL1假型慢 病毒上清及ImL DMEM培养基。效率对照不需要添加慢病毒。 阳157] 第Ξ天：感染24h后去除含病毒培养基，换成正常培养基，加入嚷岭霉素至终浓度 2 μ g/mU没有感染病毒的效率对照样品也同时加入嚷岭霉素作为对照，培养4她。
[0158] 3.细胞感染效率检测和培养
[0159] 第五天：未感染的效率对照细胞在嚷岭霉素的作用下应该全部调亡（>95% )。根 据感染慢病毒细胞的调亡情况判断细胞的感染效率，通常可W达到90% W上的感染效率 (调亡率<10% )。必要时可W将病毒上清进行浓缩或梯度稀释后进行感染W达到合适的感 染效率。
[0160] 经过嚷岭霉素筛选后，未感染的细胞发生调亡。将目的细胞重新传代并换为普通 培养基培养4她。 阳161] 4.检测SA化1基因敲除效果 阳162] (1)设计上下游引物W扩增SALL1基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
[0163] GAGCCCCTCTATGATTAATCGCAATGCA(SEQ ID NO ：55)
[0164] GTGGGTCCAAGTGTGCGTGAGTG(SEQ ID NO :56)。
[01化]目的扩增片段包含sgRNA祀序列，大小为37化p。祀序列至片段两端的位置不少于 lOObp。
[0166] 似收集部分目的细胞，使用promega基因组DM试剂盒抽提基因组DM。同时抽 提野生型目的细胞的基因组DNA。
[0167] (3) W基因组DNA为模板扩增包含祀序列的SALL1基因片段（包括感染的突变样 品和野生型样品）。 阳168] 扩增反应体系（20 μ L)如下： 阳169] 上游引物（ΙΟμΜ) :1 μL 阳170] 下游引物（ΙΟμΜ) :1 μL
[0171] 2XPCR Mix :10μΙ 阳17引 基因组DNA:100ng
[0173] W上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。 阳174] 反应程序： 阳 175] 95 °C , 3min 阳 176] 95°C , 30s 阳 177] 58°C , 20s 阳 17引 72°C，20s 阳 179] 72 °C , 3min ；
[0180] 其中第二步至第四步重复35个循环。 阳1W] (4)电泳检测PCR产物并回收纯化 阳1扣](5)将纯化后的DNA片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子（包括突变样品 和野生型样品）。 阳183] 反应体系如下所示：
[0184] 基因组PCR片段：200ng 阳化5] 5 X 反应 buf f er : 2 μ L 阳186] 反应体系共9 μ L
[0187] W上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。 阳188] 反应程序： 阳化 9] 95°C，5min; 阳 190] 80 °C , 5min ；
[0191] 70°C , 5min ； 阳19引 6(TC，5min; 阳 19引 50°C , 5min ; 阳194]自然降至室溫。 阳1巧](6)用化uiser酶切割复性后的杂交DNA (包括突变样品和野生型样品）向经过变 性、复性的反应混合物加入1 μL化uiser酶，45°C解育20min。
[0196] (7)电泳检测酶切产物，检测祀序列介导的SALL1基因敲除效果。
[0197] 将经过酶切的DNA片段用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，100V，25min。确定目的 片段的切割情况，判断祀序列的基因敲除效果。 阳198] 对突变DNA的切割识别基于W下原理：经过感染的细胞会表达sgRNA和化s9。基 因组DNA如果被sgRNA介导的化s9蛋白祀向切割，经过修复后会在切割位点附近引入突变 (野生型变为突变型）。由于野生型和突变型序列在该位置不匹配，w此为模板扩增出的野 生型DNA与突变型DNA经过变复性形成的杂交分子会就产生局部的环形（loop)结构。而