专利名称：一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法。同时还涉及一种广谱抗植物病毒的转基因植物的用途，具体地说，本发明涉及苏云金芽胞杆菌中群体感应信号分子降解蛋白编码基因aiiA通过农杆菌转化烟草，获得广谱抗植物病毒的转基因烟草，对不同种类的重要的植物病毒如烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒等都有较好的抗病毒效果。本发明的技术方法将可广泛应用于经济作物的病毒病防治。
背景技术：
自然界中，很多植物都会受到病毒侵染而引起病毒病。植物病毒虽是严格的细胞内寄生物，但专化性并不强，往往一种病毒可寄生在不同种、属甚至不同科的植物上，常常发生复合侵染。几乎每种农作物和经济作物都受到几种甚至十几种病毒的危害而减产或绝产。植物病毒病是一种全球性的病害，每年全世界由植物病毒病造成的农作物损失难以计数。我国是个农业大国，随着生态条件的改变和植物种质资源的引进，病毒种类有逐渐增多，危害逐渐加重的趋势。病毒在植物细胞内绝对寄生，其复制所需的能量、物质、场所完全由寄主细胞提供，加之植物没有完整的免疫代谢系统，这使得植物病毒病的防治非常困难。对于植物病毒病害的防治大多使用的是综合措施，但这些传统的方法都存在局限性。如对于一些虫传病毒可用农药来杀死传染病毒的昆虫，但这种方法所用化学农药易造成环境污染，而且对病毒感染植物后的病害药效不显著。对于适用于无性繁殖的农作物可以组织脱毒法获得无病毒病的种植材料，但缺点是成本高、工作量大，特别是由于田间的再侵染，维持无毒的有效期不长。近年来植物抗病毒基因工程的诞生为人们防治病毒病带来了希望。2000年Dong等从一株芽胞杆菌菌株MOB 1中克隆到了编码降解群体感应 (Quorum sensing)信号分子 N-酉先基高丝氨酸内酉旨(N-acyl—homoserine lactones, AHLs) 的蛋白基因aiiA。之后用根癌农杆菌法把该基因转化烟草、马铃薯后，增强了马铃薯、烟草对大白菜软腐病菌(Erwinia carotovora SCG1)的抗性。此外还发现AiiA蛋白不仅能提高转基因植物对病原细菌的抗病能力，还可以提高动物的免疫力。但关于该基因在抗植物病毒方面的功能还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法，方法易行，操作简便，增强对不同植物病毒的广谱抗性，获得的转基因植物可以增强对不同植物病毒的抗性，将可广泛应用于经济作物的病毒病防治。本发明的另一个目的是在于提供了一种广谱抗植物病毒的转基因植物在烟草中的应用，该发明的主要优点是对重要的植物病毒都有广谱的抗病效果，可以应用于主要作物的转基因抗病毒。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法，其步骤是a.转化载体的构建将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，本单位袁志明研究员惠赠，请见遗传资源表)的aiiA基因用限制性内切酶酶切后连接到植物双元转化载体pA8上(购自CAMBIA公司的pCAMBIA 1305. 1载体，简称为pA8载体，请见遗传资源表)，通过冻融法将连接好的植物双元转化载体pA8-aiiA转入农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(美国普渡大学S. Gelvin教授惠赠，请见遗传资源表)中。b.植物遗传转化通过叶盘转化方法(参考Horsch et al. , 1985)分别转化珊硒烟草(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)和本生烟草(N. benthamiana)，在含有潮霉素的MS培养基(MS+1. Omg/ L BA+0. lmg/L NAA+30mg/L Hygromycin+lOOmg/LTimentin)上筛选获得转化苗，通过生根培养基(MS+0. lmg/LNAA+30mg/LHygromycin+100mg/L Timentin)获得完整的再生植物，包括转化空载体的PA8再生植物以及转化pA8-aiiA的再生植物。本发明发现将苏云金芽孢杆菌的aiiA基因通过农杆菌转入烟草中表达，可获得广谱抗植物病毒的转基因烟草。一种广谱抗植物病毒的转基因植物在烟草中的应用，其应用过程如下当再生烟草植株长有4-5片叶时，选择PCR和RT-PCR检测都呈阳性的大小一致的转基因植株的叶片作为材料。通过摩擦接种的方法接种不同植物病毒，观察接种部位的过敏反应病斑大小以及荧光面积大小和强弱，比较发病情况。本发明涉及的转基因植物可表现出对植物病毒的广谱抗性。可能对不同病原体 (病毒、细菌、真菌等)具有广谱抗性，将可广泛应用于经济作物的病毒病防治。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果植物病毒的防治目前没有有效的方法，现有技术只是针对某一种植物病毒而进行的，往往只是起到一定的预防效果，发生植物病毒感染后则很难控制。现有转基因技术也只是针对某一种特定的植物病毒。本发明获得的转基因植物具有广谱抗植物病毒的效果，对目前严重危害作物的主要病毒都表现出较理想的抗病效果。
图1为转aiiA基因烟草的PCR和RT-PCR检测结果图。对获得的再生烟草植株进行PCR和RT-PCR检测，上排为PCR检测结果，下排为 RT-PCR检测结果，M为DNA分子量标记，1-8为获得的不同再生株系，-为阴性对照。图2为转aiiA基因烟草对烟草花叶病毒TMV的抗性结果图。检测转基因烟草对TMV病毒的抗性，A图为转化空载体对照的pA8珊硒烟草，B图为转化pA8-aiiA的珊硒烟草。转化pA8-aiiA基因的烟草形成的过敏反应病斑比转化空载体对照的PA8烟草要小且少些。C图为转化空载体对照的pA8本生烟草，D为转化pA8-aiiA 的本生烟草。E图为在紫外光灯下检测GFP标记的TMV，其中上面是转化pA8-aiiA的本生烟草，下为转化空载体对照的pA8本生烟草。转基因本生烟草GFP荧光强度明显低于转化空载体对照。
图3为转aiiA基因烟草对马铃薯X病毒PVX的抗性结果图。检测转基因烟草对PVX病毒的抗性，A图为转化空载体对照的pA8烟草，B图为转化pA8-aiiA的烟草。转化pA8-aiiA基因的烟草形成的纹状过敏反应病斑比转化空载体对照的PA8烟草要细且弱些。图4为转aiiA基因烟草对马铃薯Y病毒PVY的抗性结果图。检测转基因烟草对PVY病毒的抗性，A图为转化空载体对照的pA8烟草叶片，B图为转化pA8-aiiA的烟草叶片。转化pA8-aiiA基因的烟草形成的过敏反应病斑比转化空载体对照的PA8烟草药弱且少些。图5为转aiiA基因烟草对PPV病毒的抗性结果图。检测转基因本生烟草PPV病毒的抗性。A图为转化pA8的本生烟草，B图为转化 pA8-aiiA的本生烟草，C为在紫外光灯下检测GFP标记的PPV。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1 一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法，其步骤是.转化载体的构建与植物转化转化载体的构建(.转化载体的构建与植物转化)根据苏云金芽孢杆菌 (B.thuringiensis，本单位袁志明研究员惠赠，请见遗传资源表)的aiiA基因序列设计引物，在引物的5’端分别加上Bgl II和BstE II酶切位点和保护碱基，提取苏云金芽孢杆菌 (本实验室自行分离获得)的总DNA，通过PCR技术克隆出aiiA基因(Wang等，Science in China Series C =Life Sciences, 2007, 50 (3) :385-39)，双酶切后连接到用 Bgl II 和 BstE II双酶切后的表达载体pA8 (购自CAMBIA公司的pCAMBIA 1305. 1载体，简称为pA8载体) 上，命名为pA8-aiiA质粒。将空载体pA8和构建好的pA8K_aiiA质粒分别通过冻融法转入农杆菌(A. tumefaciens)菌株EHA105 (本实验室保存，美国普渡大学S. Gelvin教授惠赠， 请见遗传资源表)中。B、植物转化将上述的转化农杆菌(A. tumefaciens EHA105)分别过夜培养，离心，菌体用液体 MS1/10培养基悬浮。将珊硒烟草(N. tabacum cv. Xanthi)和本生烟草(N. benthamiana) 烟草叶片切成0. 5cmX0. 5cm的小块，一部分放入带有pA8质粒菌液中浸泡15分钟，一部分放入带有pA8-aiiA质粒的菌液中浸泡15分钟，一部分放入液体MS培养基浸泡15分钟，用滤纸吸干多余的菌液或液体后，放在MS培养基上共培养三天，然后转到筛选培养基 (MS+1. Omg/L BA+0. lmg/L NAA+30mg/L Hygromycin+100mg/L Timentin)上，同时，把用液体MS培养基浸泡的叶片一部分转到正常培养基(MS+1. Omg/L BA+0. lmg/L NAA)上，一部分转移到筛选培养基上作为转化叶片的对照，26°C、Wh光照培养进行初步筛选，每两周更换一次培养基。再生的小苗转至生根培养基(MS+0. lmg/LNAA+30mg/L Hygromycin+100mg/L Timentin)生根。结果表明转化后的叶盘在选择培养基上生长3_4周后会形成愈伤组织并分化出芽，直接分化出的芽转入生根培养基可以生根并继续生长，形成再生植株。
实施例2 —种广谱抗植物病毒的转基因植物在烟草中的应用，其应用过程如下转化烟草对不同植物病毒的抗性当再生烟草植株长有4-5片叶时，选择PCR和RT-PCR检测都呈阳性(图1)的大小一致的转基因植株作为供试植株。将不同植物病毒毒原加入适量缓冲液(K2HPO4 lg/100mL, Na2SO3 0. lg/100mL)和适量石英砂一起研磨成勻浆，用毛笔蘸取病毒汁液通过摩擦接种的方法在植株叶表面接种不同植物病毒，包括烟草花叶病毒(TMV)，马铃薯X和Y病毒(PVX和 PVY)，GFP 标记的 TMV 病毒(简称 GFP-TMV)和 Plum pox potyvirus 病毒(简称 GFP-PPV) (其中TMV，PVX，PVY病毒由申请人所在单位-中国科学院武汉病毒研究所普通病毒保藏中心提供，GFP-TMV和GFP-PPV由中国科学院微生物研究所郭惠珊研究员惠赠，请见遗传资源表)。接种后用清水洗去接种叶片上的残留汁液，将接种后的烟草放在温室中培养，7-14天内观察接种部位的形成的过敏反应病斑大小强弱以及荧光面积差异，比较感病情况。下面结合不同病毒对转化烟草对不同植物病毒的抗性检测进行说明1.转化烟草对烟草花叶病毒的抗病毒效果。将上述转化的珊硒烟草和本生烟草获得的种子发芽，栽种在灭菌后的沙中。当转化烟草植株长至4-5片叶时，通过PCR和RT-PCR检测，确证转化获得成功(图1)。选择大小一致的转基因植株作为供试植株用于抗植物病毒效果。将烟草花叶病毒加入适量缓冲液 (K2HP04lg/100mL, Na2SO3O. lg/100mL)和适量石英砂一起研磨成勻浆，用毛笔蘸取病毒汁液通过摩擦接种的方法在植株叶表面接种烟草花叶病毒(TMV)，以及GFP标记的TMV病毒。接种后用清水洗去接种叶片上的残留汁液，将接种后的烟草放在温室中培养，7-14天内观察接种部位的形成的过敏反应病斑大小强弱以及荧光面积差异，比较抗病毒效果，结果见图 2。从图中可以看出转化pA8-aiiA基因的珊硒烟草比转化空载体对照的pA8烟草对烟草花叶病毒的抗性明显要强，病斑小且少，感病症状要轻得多。转化pA8-aiiA基因的本生烟草比转化空载体对照的pA8本生烟草对TMV病毒的抗性也明显要强，形成的绿色荧光的面积要少得多。2.转化烟草对马铃薯X病毒的抗病毒效果。采用上述同样的方法检测转化的珊硒烟草对马铃薯X的抗病毒效果，结果见图3。 转化pA8-aiiA基因的烟草形成的纹状过敏反应病斑比转化空载体对照的pA8烟草要细且弱些。3.转化烟草对马铃薯Y病毒的抗病毒效果。采用上述同样的方法检测转化的珊硒烟草对马铃薯Y的抗病毒效果，结果见图4。 转化pA8-aiiA基因的烟草形成的过敏反应病斑比转化空载体对照的pA8烟草弱且少。4.转化烟草对Plum pox potyvirus (PPV)病毒的抗病毒效果。采用上述同样的方法检测转化pA8-aiiA基因的本生烟草对GFP-PPV的抗病毒效果，结果见图5。转化pA8-aiiA基因的本生烟草比转化空载体对照的pA8本生烟草对PPV 病毒的抗性明显要强，形成的绿色荧光的面积要少得多。
权利要求
1.一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法，其步骤是a.转化载体的构建将苏云金芽孢杆菌的ai以基因用限制性内切酶酶切后连接到植物双元转化载体pA8 上，通过冻融法将连接好的植物双元转化载体pA8-ai以转入农杆菌菌株EHA105中；b.植物遗传转化通过叶盘转化方法分别转化珊硒烟草和本生烟草，在含有潮霉素的MS培养基上筛选获得转化苗，通过生根培养基MS获得完整的再生植物，包括转化空载体的pA8再生植物以及转化m-aiiA的再生植物；所述的 MS 培养基为MS + 1.0 mg/L BA + 0. 1 mg/L NAA + 30 mg/L Hygromycin + 100 mg/L Timentin ；所述的生根培养基为 MS + 0.1 mg/L NAA + 30 mg/L Hygromycin + 100 mg/L Timentin0
2.权利要求1所述的一种广谱抗植物病毒的转基因植物在烟草中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法及应用，其步骤是a.转化载体的构建将苏云金芽孢杆菌的aiiA基因用限制性内切酶酶切后连接到植物双元转化载体pA8上，通过冻融法将连接好的植物双元转化载体pA8-aiiA转入农杆菌菌株EHA105中；b.植物遗传转化通过叶盘转化方法分别转化珊硒烟草和本生烟草，在含有潮霉素的MS培养基上筛选获得转化苗，通过生根培养基获得完整的再生植物，包括转化空载体的pA8再生植物以及转化pA8-aiiA的再生植物。方法易行，操作简便，增强对不同植物病毒的广谱抗性，将可广泛应用于经济作物的病毒病防治。
文档编号C12N15/31GK102492719SQ20111040259
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者张勇, 杨宝玉, 陈士云 申请人:中国科学院武汉病毒研究所