Ascl1在诱导星形胶质细胞转分化为功能性神经元中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和细胞治疗领域，具体地，本发明涉及一种诱导星形胶质细 胞转分化为功能性神经元细胞的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 许多转录因子和染色质表观遗传修饰过程在维持已分化细胞的特性稳定中起着 非常重要的作用。然而，诱导多能干细胞（iPS细胞）的研究表明，分化的细胞并不是被不 可逆地锁定在其成熟的状态，而是可以通过选择性过量表达特定的转录因子实现去分化。 [0003] 最近的研究结果发现，特定的转录因子可以直接将成纤维细胞诱导为功能性的神 经元，这进一步表明了非神经元细胞可直接转分化为神经元。例如通过过表达转录因子 Neurog2或Dlx2可以在体外将出生后小鼠大脑皮层的星形胶质细胞转分化为谷氨酸能神 经元或GABA能神经元。一些研究还表明，非神经元细胞在体内可被重新编程为神经元或神 经前体细胞。但是，体内的星形胶质细胞能否转分化为神经元以及这些诱导产生的神经元 (iN)是否可以整合到已经存在的神经环路中目前还知之甚少。
[0004] 目前，过表达前神经蛋白Neurog2能够将体外培养的来自于出生早期小鼠大脑 皮层的星形胶质细胞重编程为可形成突触联系的谷氨酸能神经元。过表达前神经蛋白 NeuroDl能够将小鼠大脑皮层损伤后的反应性星形胶质细胞重编程为神经元。但是，目前还 没有可以将正常状态下的星形胶质细胞转分化为功能性神经元的任何方法或路径。
[0005] 因此，本领域迫切需要寻找一种能够诱导成熟细胞转分化为有活性的神经元细胞 的细胞因子，从而在大脑功能修复中开创新的治疗方式。
[0006] 越来越多的证据支持星形胶质细胞的谱系具有非常高的异质性。可以设想星形 胶质细胞的不同来源可能影响其转分化为神经元的效果。在本研究中发现，单个转录因子 Ascll可以在体外有效地将出生后小鼠背侧中脑的星形胶质细胞转分化为可形成突触联系 的神经元。此外，还设计了一个在体内特异靶向星形胶质细胞的基因表达系统，发现单个 转录因子Ascll能够诱导体内的星形胶质细胞转分化为功能性的神经元。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了 Ascll基因或其蛋白在诱导星形胶质细胞转分化为功能性神经元 细胞的用途，以及其在神经系统疾病治疗方面的应用。
[0008] 本发明第一方面，提供了一种无刚毛鳞甲复合体同源物样I (achaete-scute complex homolog-like 1，Ascll)基因或其蛋白的用途，⑴用于制备诱导星形胶质细胞 形成功能性神经元细胞的药物组合物；和/或（ii)用于制备治疗神经系统疾病的药物组合 物。
[0009] 在另一优选例中，所述的Ascll基因或其蛋白来源于哺乳动物，较佳地，来源于 人、小鼠、大鼠。
[0010] 在另一优选例中，所述的星形胶质细胞包括正常状态和损伤状态下的星形胶质细 胞。
[0011] 在另一优选例中，所述的Ascll基因的GenBank号为U68534. 2,蛋白序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0012] 在另一优选例中，编码所述的Ascll基因的mRNA NCBI Reference Sequence号为 ΝΜ_008553· 4, mRNA 序列如 SEQ ID NO. :2 所示。
[0013] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括含有Ascll编码序列的表达载体（FUGW 和GFAP-AAV)，和药学上可接受的载体（GFAP-AAV)。
[0014] 在另一优选例中，所述的星形胶质细胞来源于纹状体、脊髓、背侧中脑或大脑皮 层，较佳地，所述的星形胶质细胞来源于皮层、背侧中脑。
[0015] 在另一优选例中，所述的功能性神经元包括谷氨酸能神经元和/或γ _氨基丁酸 (GABA)能神经元。
[0016] 在另一优选例中，所述的功能性神经元能够发放动作电位并能够形成突触联系。
[0017] 本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有Ascll蛋白编码序 列，且所述的表达载体可整合入星形胶质细胞，并在星形胶质细胞中表达外源的Ascll蛋 白。
[0018] 在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒、病毒载体。
[0019] 在另一优选例中，所述的病毒载体可感染星形胶质细胞。
[0020] 在另一优选例中，所述的表达载体是星形胶质细胞特异性表达载体。
[0021 ] 在另一优选例中，所述的表达载体GFAP-AAV载体。
[0022] 在另一优选例中，所述的病毒载体包括慢病毒FUGW载体。
[0023] 在另一优选例中，所述的表达载体自5'到3'端依次包括一下元件：GFAP_AAV载 体：病毒ITR序列+CMV的增强子+人GFAP的启动子+Ascll和红色荧光蛋白mCherry的编 码框+转录后调控元件WPRE+病毒ITR序列+氨苄抗性基因的启动子和编码框
[0024] FUGW 载体：病毒 ITR 序列+Ubiquitin promoter 启动子+Ascll 编码框+IRES 序 列+绿色蛋白GFP的编码框+转录后调控元件WPRE+病毒ITR序列+氨苄抗性基因的启动 子和编码框
[0025] 在另一优选例中，所述的病毒载体制备如下：
[0026] 将具有Ascll编码序列的多核苷酸序列导入病毒颗粒的包装细胞中，从而形成所 述的病毒载体。
[0027] 本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞的染色体整合有编码 Ascll蛋白的多核苷酸，或所述的宿主细胞含有本发明第二方面所述的表达载体。
[0028] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是星状胶质细胞。
[0029] 本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的将星形胶质细胞转分化为功能性神 经元细胞的方法，包括步骤：
[0030] 在外源性Ascll蛋白存在下，培养星形胶质细胞，从而诱导星形胶质细胞形成神 经元细胞。
[0031] 在另一优选例中，所述的外源性Ascll蛋白是在所述星形胶质细胞内表达外源 Ascll编码序列而产生的外源Ascll蛋白。
[0032] 在另一优选例中，所述的外源性Ascll蛋白是在所述星形胶质细胞内表达外源 Ascll编码序列而产生的外源Ascll蛋白。
[0033] 在另一优选例中，所述的外源性Ascll蛋白通过本发明第二方面所述的表达载体 表达获得。
[0034] 在另一优选例中，所述的表达载体为慢病毒颗粒。
[0035] 本发明第五方面，提供了一种由星形胶质细胞转分化的功能性神经元细胞和/或 神经元细胞群，所述的功能性神经元细胞和/或神经元细胞群由本发明第四方所述的方法 制备获得，且所述的功能性神经元细胞和/或神经元细胞群具有以下一种或多种特征：
[0036] (a)至少50%的神经元细胞，优选至少60%、70%、80%、90%、或100%的神经元 细胞表达神经元的标志物Tujl，MAP2、NeuN或Synapsin I ;
[0037] (b)能够发放动作电位并能够形成关触联系。
[0038] 在另一优选例中，所述的神经细胞群中，所述的神经元细胞不表达Gfap, SlOOP、 Acsbgl、Sox2 或 Pax6 等标志物。
[0039] 在另一优选例中，所述的不表达包括基本不表达，例如至少60 %、70%、80%、 90%、或100%的神经元细胞不表达Gfap, SlOO β、Acsbgl、Sox2或Pax6等标志物。
[0040] 本发明第六方面，提供了本发明第五方面所述的功能性神经元的用途，所述的功 能性神经元细胞和/或神经元细胞群用于制备治疗神经系统疾病的药物组合物。
[0041] 在另一优选例中，所述的神经系统疾病包括癫痫、阿尔兹海默症（AD)、帕金森病 (ro)、中风引起的神经元死亡等。
[0042] 本发明第七方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括（A)本发明第 二方面所述的表达载体或Ascl蛋白，或（B)本发明第五方面所述的功能性神经元；和（C) 药学上可接受的载体。
[0043] 本发明第八方面，提供了一种治疗神经系统疾病的方法，包括步骤：
[0044] 向需要的对象施用安全有效量的本发明第七方面所述的药物组合物，从而治疗神 经系统疾病。
[0045] 本发明第九方面，提供了一种（a)筛选治疗神经系统疾病的候选化合物；和/或 (b)筛选诱导星形胶质细胞转分化为功能性神经元细胞的候选化合物的方法，其特征在于， 包括步骤：
[0046] (i)将测试化合物加入细胞培养体系作为测试组，并将未加入测试化合物的细胞 培养体系作为对照组；
[0047] (ii)比较测试组中Ascll基因或其蛋白的表达量和/或活性El与对照组中的表 达量和/或活性EO ;
[0048] 其中，当测试组中El显著高于E0,则表明所试化合物为（a)治疗神经系统疾病的 候选化合物；和/或（b)诱导星形胶质细胞转分化为功能性神经元细胞的候选化合物。
[0049] 在另一优选例中，所述的细胞为星形胶质细胞。
[0050] 在另一优选例中，所述的显著高于指的是El高于E0,且具有统计学差异；优选地， 为El多2E0。
[0051] 在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
[0052] (iii)将测试化合物加入星形胶质细胞培养体系作为测试组，并将未加入测试化 合物的星形胶质细胞培养体系作为对照组；
[0053] (iv)比较测试组中星形胶质细胞向功能性神经元转化的比例，从而确定所述测试 化合物是否为（a)治疗神经系统疾病的候选化合物；和/或（b)筛选诱导星形胶质细胞转 分化为功能性神经元细胞的候选化合物；
[0054] 其中，当测试组中星形胶质细胞向功能性神经元转化的比例Tl显著高于对照组 的比例T0,则表明所述测试化合物为（a)治疗神经系统疾病的候选化合物；和/或（b)筛 选诱导星形胶质细胞转分化为功能性神经元细胞的候选化合物。
[0055] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0056] 图la-h显示了分离纯化的星形胶质细胞的属性鉴定，绝大部分的细胞表达星 形胶质细胞的标志分子GFAP和SlOO β，少量的细胞表达少突胶质细胞的标志分子04和 CNPase，少量的细胞表达NG2胶质细胞的标志分子NG2,没有检测到神经元标志分子Tu j 1以 及干细胞标志分子Sox2和0ct4的表达。
[0057] 图2显示了星形胶质细胞在经慢病毒载体诱导发生转分化后表达神经元标志分 子表达的情况。图2a-b显示星形胶质细胞转染对照慢病毒载体FUGW 10天后，星形胶质 细胞不表达神经元的标志分子Tujl，仍维持胶质细胞的形态同时表达星形胶质细胞的标志 分子GFAP。图2c显示了感染慢病毒FUGW-Ascll 10天后，大部分星形胶质细胞表达神经 元的标志分子Tujl，同时呈现典型的神经元形态。图2d和图2e分别显示了感染慢病毒 FUGW-Ascll 21天后，星形胶质细胞还表达成熟神经元的标志分子MAP2和synapsin I。图 2f显示了对这些神经元进行了全细胞电生理记录。图2g显示，在慢病毒转染30-40天后， 所有GFP阳性的细胞（共63个）都能产生动作电位，且绝大多数的iN细胞上（87. 3%， 55/63个细胞）能记录到自发的突触后电流。图2h-i为FUW-Ascll-tdTomato及对照病毒 感染取自hGFAP-GFP小鼠的星形胶质细胞（星形胶质细胞带有GFP标记）的结果。其中， 图2h显示感染只含红色荧光蛋白的对照慢病毒FUW-tdTomato后，被病毒感染的细胞仍然 维持星形胶质细胞的形态，并表达GFAP ;图2i显示用慢病毒过量表达Ascll可诱导星形胶 质细胞的形态发生改变，同时表达Tujl。这些转分化产生的神经元仍然有GFP的表达。
[0058] 图3显示了所诱导细胞的递质属性。图3a显示大多数iN细胞表达GABA，而图3b 和图3d分别显示了部分iN细胞表达GABA能神经元标志分子GAD67和VGAT。图3c和e分 别显示了对照病毒感染的细胞不表达GABA能神经元标志分子VGAT以及谷氨酸能神经元标 志分子VGLUT2。图3f